Name: נוהל הפעלה רגיל של מעקב וירוס של אוכלוסיית העטלף בטייוואן (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-27T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 s
Description: למדו נוהל סטנדרטי לאבחון אנטיגנים של ליסה-וירוס בעטלפים בטייוואן. שיטה זו מסייעת לחוקרים לבצע מעקב וירולוגי יעיל ולזהות נגיפים זואונוטיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לטיין-צ'נג לי, יי טאנג לין, צ'יה-ג'ונג טסאי, ו-Ya-Lan Li על עזרתם במהלך המחקר. מחקר זה היה נתמך על ידי גרנט no 107AS-8.7.1-BQ-B2 (1) מן הלשכה של בעלי חיים ובריאות הצמח בידוד, מועצת החקלאות, ההנהלה יואן, טייוואן.

1. אמצעי זהירות בטיחות בטיפול בווירוסים
<ol><li>ודא כי כל עובדי המעבדה המטפלים בדגימות העטלף מקבלים טיפול טרוםחשיפה לכלבתמניעה. לעקוב אחר רמות נוגדן הכלבת של העובדים מראש ולבחון אותם מחדש כל 6 חודשים17. הטיפול החיסון נגד כלבת נדרש עבור אלה שרמות הנוגדן שלהם נמוך מ 0.5 IU/mL17.</li>
	<li>בהתאם לתקנות אבטחה טיחות של המדינה שבה המעבדה ממוקמת, להבטיח כי ההליכים הבאים מבוצעים במעבדות ברמה אבטחה טיחות מתאימה (למשל, bsl-2 מעבדות בטייוואן ו bsl-3 מעבדות באוסטרליה), וכי עובדים מוסמכים כיום ללבוש ציוד הגנה אישית נאותה18. הערה: חיסון נגד כלבת מספק מעט ללא הגנה מפני וירוסים השייכים phylogroups II ו-III18. העובדים חייבים להיות מודעים לכך שמספר פתוגנים zoonotic זוהו בעטלפים19 וצריכים לטפל בדגימות תחת תנאי מעבדה ברמת בטיחות מתאימה עם ציוד הגנה אישי תקין.</li>
</ol>2. אוסף דוגמאות
<ol><li>השימוש נמצא מוצא חלש או מטורף חולה או גוויות. הערה: בעלי החיים החלשים או החולים מועברים לאגודת השימור של טאיפה לטיפול וטרינרי, בעוד שהגוויות נשלחות ישירות למכון לחקר בריאות החיות. שום עטלפים בריאים לא מורדמים. בתוכנית ההשגחה הזאת</li>
	<li>בעזרת מאפיינים מורפולוגיים20, יש אקולוג עטלף שיזהה מיני עטלף.</li>
	<li>לבצע ברקוד DNA של מינים בת כאשר lyssavirus חיובית מאובחנת, באמצעות הליכים שפורסמו בעבר21.</li>
	<li>שליחת דף מידע של כל קארקאס (אתר אוסף, מינים, סימנים קליניים וכו ').</li>
</ol>3. נקרומי עטלף
<ol><li>. הכינו חומרים<ol>
<li>הכינו לוח חיתוך נקי ומניחים. פד סופג סטרילי לנקרופסי</li>
		<li>הכינו צינורות איסוף לאיסוף אברי עטלף.</li>
		<li>הכינו מלקחיים חד פעמיים. ואזמלים לנקרופסי שינוי כלים בין נמק של כל עטלף. הכינו כדורי צמר גפן עם 70% אתנול לניקוי מלקחיים ואזמלים במהלך הדגימה.</li>
		<li>הכינו שני מיקרוסקופ לשומן. לאסוף דגימות טריות לתקן אותם בפתרון פורמלין לבדיקה histopathological.</li>
	</ol>
</li>
	<li>בדקו את כל הפתחים. החיצוניים לפני נקרופסי צלם את התכונות החיצוניות של העטלף, במיוחד את הראש, האוזניים והכנפיים, לבידול מינים.</li>
	<li>לאסוף דגימת ספוגית אוראלי. מניחים את המחבט בתוך הלוח שכיבה ולתקן את ראשו של המחבט עם מלקחיים. חותכים את העור לאורך קו האמצע של הcalvaria עם אזמל ומשוך את העור לצדדים לרוחב. חותכים את הגולגולת לאורך קו האמצע של הcalvaria עם אזמל ולפתוח אותו עם מלקחיים כדי לחשוף את רקמת המוח.</li>
	<li>להסיר את רקמת המוח מהגולגולת ומניחים אותו על מדכא לשון סטרילי או, ולעשות ריח הרושם מרקמת המוח (ראה שלב 4.2). לאסוף חתיכה קטנה של רקמת מוח טרי ולתקן אותו פורמלין לבדיקה histopathological. מכילים את רקמת המוח הנותרים בצינור עבור חילוץ חומצת גרעין.</li>
	<li>מלקחיים נקיים ואזמל עם כדורי צמר גפן לחלח עם 70% אתנול כדי להסיר רקמות שנשמרו בין אוסף הדגימה.</li>
	<li>מניחים את המחבט על הלוח בתוך שכיבה בראש ולתקן אותו על הלוח עם מחטים בשני הצדדים של הקצה ואת העקב הזנב.</li>
	<li>הזמן את העור לאורך קו האמצע של הגוף מלסת תחתונה לפי הטבעת. הרימו והפרידו את העור ואת רקמות השריר המשמשות בפינצטה. לאסוף את בלוטות הרוק, אשר נמצאים ליד עצם הלסת.</li>
	<li>הרם את עצם החזה מעט עם מלקחיים, וחתוך את עצם החזה ואת קיר הבטן לאורך קו האמצע עם אזמל. . תחתוך את הבריח עם אזמל לתקן את הצלעות שמאל וימין ללוח עם מחטים כדי לפתוח את חלל החזה.</li>
	<li>הקלט את הנגעים הדוחים ואת דרגת השינוי שלאחר המוות.</li>
	<li>הסר את רקמות הקרביים (כלומר, לב, ריאות, כבד, כליות, מעיים) מתוך הגווייה באמצעות מלקחיים ואזמל. לאסוף את דגימות הקרביים לפי הצורך למחקר עתידי. הערה: מומלץ לאסוף מדגמים כפולים. יש לאסוף אותו לאבחון מולקולרי, והשני צריך להיות קפוא ב-80 ° c עם או בלי מדיום הובלה ויראלי עבור תרבות ויראלית22.</li>
</ol>4. הבדיקה הישירה של נוגדן פלורסנט (FAT)
<ol><li>הפוך את הריח הרושם של רקמת המוח עבור FAT. בצע את ה-FAT כפי שמתואר בעבר18,23 עם השינויים הבאים.</li>
	<li>הפרד בעדינות את רקמת המוח מרקמת העצב המחובר עם מלקחיים והעברת רקמת המוח למקלות לשון סטרילית. חותכים את חתך המוח, כולל את גזע המוח והמוח החלק ה-18,23. לעשות ריח הרושם של רקמת המוח על ידי נגיעה קלה משטח לחתוך של רקמת המוח, ולחץ על השקופית על רקמת העדשה כדי להסיר את הרקמה העודפת.</li>
	<li>תקן את השקופיות עם אצטון ב-20 ° c עבור 30 דקות. נגב את השקופיות שנבדקו ואת הפקדים החיוביים והשליליים לפני הצביעת עם המשלים.</li>
	<li>שימוש בכל אחד משני התאים הנמכרים מבחינה מסחרית FITC מצובת נגד כלבת אנטיגן מומלץ מאוד23. קבע את ריכוז העבודה של המשלים המסחרי לפני ההכתמים הראשונים. שחרר את השערים מדולל באמצעות מסנן μM 0.45 מזרק על השקופיות ו מודלת את השקופיות ב 37 ° c עבור 30 דקות בתוך חדר רטוב.</li>
	<li>סוחטים את עודפי המשלים מהשקופיות ושוטפים את השקופיות עם תמיסת מלח מוזרמת פוספט (PBS) לאחר הדגירה.</li>
	<li>שחרר כמות קטנה של 10% גליצרול על השקופיות וכיסוי עם שקופיות כיסוי.</li>
	<li>בדוק את השקופיות עם מיקרוסקופ פלורסנט.</li>
</ol>5. הפקת חומצת גרעין
<ol><li>הוסף את הנפח המתאים של הגברת -10 (בינוני חיוני מינימלי שיושלם עם 10% סרום בקר עוברי) לרקמת המוח (10% w/v).</li>
	<li>המגון אכל את רקמת המוח עם חרוז פלדה 5 מ"מ במכשיר הומוגניצר וצנטריפוגה ב 825 x g עבור 10 דקות.</li>
	<li>לחלץ את חומצת הגרעין, הנפח הסופי של אשר הוא 50 μL, בתוך 200 μL של supernatant באמצעות מסחרית הכולל של חומצות גרעין מסחרי ערכת החילוץ עם מכשיר.</li>
</ol>6. RT-PCR ואנליזה פיללוגנטית
הערה: מספר קבוצות פריימר פורסמו כדי לזהות את כל lyssaviruses ידועים או lyssaviruses ספציפיים. הפרוטוקול המתואר כאן הוא דוגמה לכך שהמעבדה שלנו משתמשת ואינה יכולה להתאים את כל הצרכים הניסיוניים. בחר צבעי יסוד מתאימים בהתאם לצורכי המעבדה.
<ol><li>הכינו את מגיב אחד RT-PCR כדלקמן: להוסיף 5 μL של חומצות גרעין שחולצו לתערובת התגובה המכילה 2.5 μL של מאגר התגובה 10x, 0.5 μL של קדימה והפוך התחל (10 μM של כל אחד), 4 μL של 1.25 מ"מ dNTP, 0.3 μL של מעכב RNase (40 U/ , 0.3 μL של היפוך הטרנסקריפטאז (10 U/μL), 0.4 μL של DNA פולימראז (5 U/μL), ו 11.5 μL של מים מטופלים DEPC. הערה: מערכת התחל המשמשת בפרוטוקול זה היא JW12 (5 '-ATGTAACACCYCTACAATG-3 ') ו-N165-146 (5 '-הגלוטטקקטה-3 ')24. שינוי ההכנה של ריאגנטים ותנאי רכיבה על אופניים על פי סטים התחל בשימוש.</li>
	<li>בצע את הרכיבה על אופניים בתנאים הבאים: דגירה ב 42 ° c עבור 40 דקות; הדנטורציה ראשונית ב 94 ° c עבור 10 דקות; 35 מחזורים של 94 ° c עבור 30 s, 55 ° צ' עבור 30 s, ו 72 ° צ' עבור 30 s; ולבסוף, הארכה נוספת ב 72 ° c עבור 10 דקות.</li>
	<li>השתמש בערכות תחל אחרות או יותר כדי להגדיל את הרגישות האבחונית.<ol>
<li>השימוש N113F (5 '-gtaggatgctggg-3 ') ו-N304R (5 '-שימוש ב-3 ')25,26 כדי להכין את אחד השלבים RT-PCR מגיב כדלקמן: להוסיף 5 μl של חומצות גרעין שחולצו לתערובת תגובה המכילה 5 μl של מאגר 10x, 5 μl של התחל קדימה ואחורה (4 μM של כל אחד), 5 μL של 1.25 מ"מ dNTP, 0.5 μL של RNase מעכב (40 U/μL), 0.2 μL של היפוך ההמרה (10 U/μl), 1 μL של דנ א פולימראז (5 U/μl), ו-23.3 μL של מים מטופלים DEPC.</li>
		<li>בצע את הרכיבה על אופניים בתנאים הבאים: דגירה ב 42 ° c עבור 40 דקות; הדנטורציה ראשונית ב 95 ° c עבור 5 דקות; 35 מחזורים של 95 ° c עבור 1 דקות, 55 ° צ' עבור 1 דקות ו -20 s, 72 ו-c ° צלזיוס עבור 1 דקות; ולבסוף, הארכה נוספת ב 72 ° c עבור 10 דקות. הערה: בהתאם לצורכי המעבדה, בחר צבעי יסוד מתאימים לאבחון. N113F תוכנן במקור עבור הגברה וירוס כלבת, אבל זה לא יכול לעבוד טוב עבור lyssaviruses אחרים. הקבוצה של N113F ו N304R עובד היטב עבור וירוס כלבת (משתנה הגירית החמוס טייוואן) ו-lyssavirus ירוס בובת טייוואן. זה יהיה קל יותר להשיג רצפים שלמים של נואופלפרוטאין באמצעות סט של JW12 ו N304R התחל אם הווירוס lyssavirus ירוס מוגבר על ידי שני סטים לעיל התחל.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לנתח את מוצר ה-PCR ב-2% האגג ג'ל ולהמחיש על ידי תאורה UV אור.</li>
	<li>רצף את מוצר ה-PCR באמצעות שירות רצף מסחרי.</li>
	<li>הזן או העלה את הרצף לדף האינטרנט של כלי היישור המקומי של נוקלאוטיד בסיסי חיפוש (הפיצוץ). בחר "אחרים (nr וכו ')" מסד הנתונים ולהזין את האורגניזם כמו Lyssavirus. בחר את האלגוריתם ממגיית האחרון והפעל את הפיצוץ.</li>
</ol>7. בידוד וירוס
הערה: בצע בידוד וירוסים כאשר אחד מהם הוא ה-FAT או 2) ה-RT-PCR מציין חיוביות.
<ol><li>המגון להפוך את הדגימה של המוח ב 10% (w/v) השעיה ב-זיכרון 10. צנטריפוגה ב 825 x g עבור 10 דקות.</li>
	<li>איחסן 200 μL של סופרנטנט עם השעיה של 3 x 106 mna (עכבר נוירובלסטומה) תאים 1 מ ל של הגברת -10 עבור 1 h ב 37 ° צ' עם 1% CO2. להעביר את המוח המגון הבולם התא לתוך 25 ס מ2 בקבוקון ולהוסיף 6 מ ל של זיכרון 10.</li>
	<li>לטפח 1 מ ל של המוח המגון המגון הבולם תא בתוך 4 היטב טפלון מצופה זכוכית שקופיות עם קוטר 6 מ"מ באותו זמן.</li>
	<li>לאחר 3 – 4 ימים של דגירה ב 37 ° צ' עם 1% CO2, לתקן את התאים על השקופית 4 טוב עם 100% אצטון (v/v).</li>
	<li>הכתם את השקופיות עם שני נוגדנים מצופי כלבת מעלה FITC בעקבות הצעדים 4.4 – 4.7. התאים נגועים כאשר ההכללות התאיים הם נחקרים. הקלט את אחוז התאים הנגועים.</li>
	<li>בצע טריסיזציה ותת-תרבות של תרבית התא שחוסנו כאשר השקופיות מוכתמות כשלילי:<ol>
<li>להסיר בינוני לשטוף את הבקבוקון עם 5 מ ל של PBS.</li>
		<li>להוסיף 1 מ ל טריפסין לבקבוקון ולהכות בחוזקה את החלק התחתון של הבקבוקון.</li>
		<li>הוסף 6 מ ל של זיכרון 10 והשהה מחדש את התאים.</li>
		<li>לשים את ההשעיה התא לתוך הבקבוקון רקמה חדשה (6 מ ל) על 4 שקופית גם (1 mL).</li>
	</ol>
</li>
	<li>חזור על שלבים 7.4 – 12.3 עד 100% הנגועים.</li>
	<li>לאסוף את סופרנטנט לאחר 24 שעות של דגירה.</li>
</ol>

<ol><li>Kuzmin, I. V. Basic facts about lyssavirus. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKuzmin%2C+IV+%22Current+laboratory+techniques+in+rabies+diagnosis%2C+research%2C+and+prevention%2C+volume+1%22">Current laboratory techniques in rabies diagnosis, research, and prevention, volume 1</a>. Rupprecht, C. E., Nagarajan, T. , Elsevier. California. 3-21 (2014).</li>
<li>Aréchiga Ceballos, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+lyssavirus+in+bat%2C+Spain%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Novel lyssavirus in bat, Spain.</a> Emerging Infectious Diseases. 19 (5), 793-795 (2013).</li>
<li>Gunawardena, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lyssavirus+in+Indian+Flying+Foxes%2C+Sri+Lanka%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Lyssavirus in Indian Flying Foxes, Sri Lanka.</a> Emerging Infectious Diseases. 22 (8), 1456-1459 (2016).</li>
<li>Hu, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lyssavirus+in+Japanese+Pipistrelle%2C+Taiwan%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Lyssavirus in Japanese Pipistrelle, Taiwan.</a> Emerging Infectious Diseases. 24 (4), 782-785 (2018).</li>
<li>Nokireki, T., Tammiranta, N., Kokkonen, U. -M., Kantala, T., Gadd, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tentative+novel+lyssavirus+in+a+bat+in+Finland%5BTitle%5D)+AND+%22Transboundary+Emerging+Diseases%22%5BJournal%5D)">Tentative novel lyssavirus in a bat in Finland.</a> Transboundary Emerging Diseases. 65 (3), 593-596 (2018).</li>
<li>Banyard, A. C., Evans, J. S., Luo, T. R., Fooks, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lyssaviruses+and+bats%3A+emergence+and+zoonotic+threat%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Lyssaviruses and bats: emergence and zoonotic threat.</a> Viruses. 6 (8), 2974-2990 (2014).</li>
<li>Pal, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rabies+virus+infection+of+a+flying+fox+bat%2C+Pteropus+policephalus+in+Chandigarh%2C+Northern+India%5BTitle%5D)+AND+%22Tropical+and+Geographical+Medicine%22%5BJournal%5D)">Rabies virus infection of a flying fox bat, Pteropus policephalus in Chandigarh, Northern India.</a> Tropical and Geographical Medicine. 32 (3), 265-267 (1980).</li>
<li>Smith, P. C., Lawhaswasdi, K., Vick, W. E., Stanton, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+rabies+virus+from+fruit+bats+in+Thailand%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Isolation of rabies virus from fruit bats in Thailand.</a> Nature. 216 (5113), 384(1967).</li>
<li>Tang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pivotal+role+of+dogs+in+rabies+transmission%2C+China%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Pivotal role of dogs in rabies transmission, China.</a> Emerging Infectious Diseases. 11 (12), 1970-1972 (2005).</li>
<li>Kuzmin, I. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bat+lyssaviruses+%28Aravan+and+Khujand%29+from+Central+Asia%3A+phylogenetic+relationships+according+to+N%2C+P+and+G+gene+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Virus+Research%22%5BJournal%5D)">Bat lyssaviruses (Aravan and Khujand) from Central Asia: phylogenetic relationships according to N, P and G gene sequences.</a> Virus Research. 97 (2), 65-79 (2003).</li>
<li>Arguin, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serologic+evidence+of+Lyssavirus+infections+among+bats%2C+the+Philippines%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Serologic evidence of Lyssavirus infections among bats, the Philippines.</a> Emerging Infectious Diseases. 8 (3), 258-262 (2002).</li>
<li>Lumlertdacha, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survey+for+bat+lyssaviruses%2C+Thailand%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Survey for bat lyssaviruses, Thailand.</a> Emerging Infectious Diseases. 11 (2), 232-236 (2005).</li>
<li>Kuzmin, I. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lyssavirus+surveillance+in+bats%2C+Bangladesh%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Lyssavirus surveillance in bats, Bangladesh.</a> Emerging Infectious Diseases. 12 (3), 486-488 (2006).</li>
<li>Reynes, J. -M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serologic+evidence+of+lyssavirus+infection+in+bats%2C+Cambodia%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Serologic evidence of lyssavirus infection in bats, Cambodia.</a> Emerging Infectious Diseases. 10 (12), 2231-2234 (2004).</li>
<li>Nguyen, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bat+lyssaviruses%2C+northern+Vietnam%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Bat lyssaviruses, northern Vietnam.</a> Emerging Infectious Diseases. 20 (1), 161-163 (2014).</li>
<li>Liu, Y., Zhang, S., Zhao, J., Zhang, F., Hu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Irkut+virus+from+a+Murina+leucogaster+bat+in+China%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Isolation of Irkut virus from a Murina leucogaster bat in China.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (3), 2097(2013).</li>
<li>Kaplan, M. M. Safety precautions in handling rabies virus. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKaplan%2C+MM+%22Laboratory+Techniques+in+Rabies%2C+4th+Ed%22">Laboratory Techniques in Rabies, 4th Ed</a>. Meslin, F. X., Kaplan, M. M., Kiprowski, H. , World Health Organization. Geneva. 3-8 (1996).</li>
<li>World Organization for Animal Health (OIE). Rabies (infection with rabies and other lyssavirus. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/3.01.17_RABIES.pdf">http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/3.01.17_RABIES.pdf</a> (2019).</li>
<li>Smith, I., Wang, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bats+and+their+virome%3A+an+important+source+of+emerging+viruses+capable+of+infecting+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Virology%22%5BJournal%5D)">Bats and their virome: an important source of emerging viruses capable of infecting humans.</a> Current Opinion in Virology. 3 (1), 84-91 (2013).</li>
<li>Corbet, G. B., Hill, J. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCorbet%2C+GB+%22The+mammals+of+the+Indomalayan+region%3A+a+systematic+review%22">The mammals of the Indomalayan region: a systematic review</a>. , Oxford University Press. Oxford, New York. (1992).</li>
<li>Mayer, F., von Helversen, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryptic+diversity+in+European+bats%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Royal+Society+B%3A+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Cryptic diversity in European bats.</a> Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 268 (1478), 1825-1832 (2001).</li>
<li>Epstein, J. H., Field, H. E. Anthropogenic epidemics: the ecology of bat-borne viruses and our role in their emergence. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEpstein%2C+JH+%22Bats+and+viruses%3A+a+new+frontier+of+emerging+infectious+diseases%22">Bats and viruses: a new frontier of emerging infectious diseases</a>. Wang, L. F., Cowled, C. , John Wiley & Sons, Inc. Hoboken, New Jersey. 249-280 (2016).</li>
<li>Centers for Disease Control and Prevention. Protocol for postmortem diagnosis of rabies in animals by direct fluorescent antibody testing. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.cdc.gov/rabies/pdf/rabiesdfaspv2.pdf">https://www.cdc.gov/rabies/pdf/rabiesdfaspv2.pdf</a> (2019).</li>
<li>Hayman, D. T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+universal+real-time+assay+for+the+detection+of+Lyssaviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">A universal real-time assay for the detection of Lyssaviruses.</a> Journal of Virological Methods. 177 (1), 87-93 (2011).</li>
<li>Franka, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+phylogenetic+lineage+of+rabies+virus+associated+with+western+pipistrelle+bats+%28Pipistrellus+hesperus%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Virology%22%5BJournal%5D)">A new phylogenetic lineage of rabies virus associated with western pipistrelle bats (Pipistrellus hesperus).</a> Journal of General Virology. 87 (8), 2309-2321 (2006).</li>
<li>Trimarchi, C. V., Smith, J. S. Diagnostic evaluation. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTrimarchi%2C+CV+%22Rabies%2C+1st+ed%22">Rabies, 1st ed</a>. Press, A., Jackson, A. C., Wunner, W. H. , Academic Press. San Diego, CA. 307-349 (2002).</li>
<li>Moldal, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+detection+of+European+bat+lyssavirus+type+2+%28EBLV-2%29+in+Norway%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Veterinary+Research%22%5BJournal%5D)">First detection of European bat lyssavirus type 2 (EBLV-2) in Norway.</a> BMC Veterinary Research. 13, 216(2017).</li>
<li>Robardet, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+assay+of+fluorescent+antibody+test+results+among+twelve+European+National+Reference+Laboratories+using+various+anti-rabies+conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Comparative assay of fluorescent antibody test results among twelve European National Reference Laboratories using various anti-rabies conjugates.</a> Journal of Virological Methods. 191 (1), 88-94 (2013).</li>
<li>Hanlon, C. A., Nadin-Davis, S. A. Laboratory diagnosis of rabies. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHanlon%2C+CA+%22Rabies%2C+3rd+ed%22">Rabies, 3rd ed</a>. Jackson, A. C. , Academic Press. San Diego, CA. 409-459 (2013).</li>
<li>Fischer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+step+forward+in+molecular+diagnostics+of+lyssaviruses--results+of+a+ring+trial+among+European+laboratories%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">A step forward in molecular diagnostics of lyssaviruses--results of a ring trial among European laboratories.</a> PLoS ONE. 8 (3), 58372(2013).</li>
<li>David, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rabies+virus+detection+by+RT-PCR+in+decomposed+naturally+infected+brains%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Rabies virus detection by RT-PCR in decomposed naturally infected brains.</a> Veterinary Microbiology. 87 (2), 111-118 (2002).</li>
<li>Robardet, E., Picard-Meyer, E., Andrieu, S., Servat, A., Cliquet, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((International+interlaboratory+trials+on+rabies+diagnosis%3A+an+overview+of+results+and+variation+in+reference+diagnosis+techniques+%28fluorescent+antibody+test%2C+rabies+tissue+culture+infection+test%2C+mouse+inoculation+test%29+and+molecular+biology+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">International interlaboratory trials on rabies diagnosis: an overview of results and variation in reference diagnosis techniques (fluorescent antibody test, rabies tissue culture infection test, mouse inoculation test) and molecular biology techniques.</a> Journal of Virological Methods. 177 (1), 15-25 (2011).</li>
</ol>

אין קונפליקטים של עניין מוצהר.

הליך זה תקן מעבדה הפעלה (SOP) מספק תהליך טורי לבדיקת דגימות עטלף לנוכחות של אנטיגנים lyssavirus בטייוואן. השלבים העיקריים כוללים את התעסוקה של FAT ו RT-PCR. הבחירה של דגימות מתאימות ובידוד מוצלח של הנגיף הם גם חשובים. בנוסף, פתרון בעיות מסוימות נערך במהלך הניטור של lyssaviruses העטלף. ההבדל העיקרי היה בעלי החיים המטרה. בתחילה (2008 – 2009), חיות היעד של מעקבים העטלף lyssavirus ירוס היו עטלפים חיים, אשר נלכדו באי Kinmen בטייוואן ולאחר מכן נבדק על lyssavirus לאחר המתת חסד. רוב העטלפים הלכודים היו בריאים ובלתי צפויים לשאת l...

וירוסים בתוך הסוג Lyssavirus הם zoonotic פתוגנים. יש לפחות שבעה מינים ליסביסםקשורים למקרים אנושיים1. בנוסף 16 מינים בסוג זה1,2,3, טייוואן בת lyssavirus (twblv)4 ו kotalahti בת lyssavirus ירוס5 זוהו לאחרונה עטלפים, אבל המצבים הטקמיים שלהם עדיין לא להיקבע.
עטלפים הם המארחים הטבעיים של מרבית lyssaviruses, למעט מוקדי lyssaviruses וירוס ikoma, אשר עדיין לא זוהו בכל עטלפים1,2,3,6. המידע על lyssaviruses בעטלפים אסיאתי עדיין מוגבל. שניים מהווירוסים הבלתי מאופיינים בעטלפים אסיאתיים (אחד בהודו והאחר בתאילנד)7,שמונה דווחו. אחד מהמקרים האנושיים הקשורים לנשיכת עטלף בסין דווח ב-2002, אבל האבחנה נעשתה רק על ידי התבוננות קלינית9. במרכז אסיה, וירוס lyssavirus נגיף זוהה בתוך העכבר הקטן אוזן אוזניים (Myotis בליית) בקירגיסטאן ב 1991, ו-וירוס ליסרו היתה מזוהה בעטלף השפם (myotis myסטרינוס) בטג'יקיסטן ב 200110. בדרום אסיה, העטלף ליסביססביט היה מזוהה ב שועל ההודי המעופף (פטרפוס medius) בסרי לנקה ב 20153. בדרום מזרח אסיה, מספר מחקרים סרולוגיים על עטלפים בפיליפינים, תאילנד, בנגלדש, קמבודיה, ו וייטנאם הראו משתנה seropreערכיות11,12,13,14, . חמש עשרה למרות Irkut lyssavirus זוהה במחבט גדול יותר-חוטם (Murina leucogaster) במחוז ג ' ילין, סין ב 201216, המינים המדויקים מיקומים של lyssavirus באוכלוסיית העטלף מזרח אסיה נותרו לא ידועים.
כדי להעריך את הנוכחות של lyssavirus באוכלוסיות בת הטייוואנית, תוכנית מעקב העסקת הן שומן ישיר RT-PCR הופעלה. טייוואן בת lyssavirus זוהה בשני מקרים של pipistrelle יפני (Pipistrellus)4 ב 2016 – 2017. במאמר הנוכחי, הליך מעבדה בתקן הפעלה מוצג עבור lyssavirus ירוס מעקב של אוכלוסיית העטלף בטייוואן. תרשים הזרימה של אבחון ליסביזוירוס במעבדה שלנו מוצג באיור 1.

<table><tbody><tr><td>2.5% טריפסין (10x)</td><td>ג'יבקו</td><td>15090046</td><td>טריפסין</td></tr><tr><td>25 ס"מ2 בקבוק</td><td>גריינר ביו-וואן</td><td>690160</td><td></td></tr><tr><td>אצטון</td><td>Honeywell</td><td>32201-1L</td><td></td></tr><tr><td>אגרוז I</td><td>VWR מדעי החיים</td><td>97062-250</td><td></td></tr><tr><td>אלכוהול</td><td>ניהון שיאקו ריאגנט</td><td>NS-32294</td><td></td></tr><tr><td>AMV טרנסקריפטאז הפוך</td><td>פרומגה</td><td>M5101</td><td></td></tr><tr><td>אנטיביוטיקה-אנטי-פטריית(100X)&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td>MEM-10</td></tr><tr><td>להב</td><td>בראון</td><td>BA215</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה</td><td>אפנדורף</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>מערכת כימיה</td><td>TOP BIO CO.</td><td>צינור איסוף MGIS-21-C2-1M</td><td></td></tr><tr><td>צינור</td> איסוף <td>Qiagen</td><td>990381</td><td></td></tr><tr><td>SSI</td><td></td><td>2341-SO</td><td></td></tr><tr><td>שקופית כיסוי</td><td>Muto Pure chemical Co., LTD.</td><td>24505</td><td></td></tr><tr><td>מנתח DNA</td><td>Applied Biosystems</td><td>3700XL</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>Gibco</td><td>10437028</td><td>MEM-10</td></tr><tr><td>FITC אנטי כלבת מונוקולין</td><td>שבטי Fujirebio Diagnostic Inc.</td><td>800-092</td><td>נוגדנים נגד כלבת מצומדים FITC: מגיב B</td></tr><tr><td>שקופית זכוכית בציפוי טפלון ארבע בארות</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>30-86H-WHITE</td><td></td></tr><tr><td>מערכת אלקטרופורזה ג'ל</td><td>מדע ראשי</td><td>MJ-105-R</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (1x)</td> <td>חממת טריפסין Gibco</td><td>14175095</td><td></td></tr><tr><td></td><td>ASTEC</td><td>SCA-165DS</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ הפוך</td><td>אולימפוס</td><td>IX71</td><td></td></tr><tr><td>L-גלוטמין 200 מ"מ (100x)</td> <td>Gibco</td><td>A2916801</td><td>MEM-10</td></tr><tr><td>LIGHT DIAGNOSTICS מגיב שומן</td><td>כלבת EMD Millipore Corporation</td><td>5100</td><td>נוגדנים נגד כלבת מצומדים FITC: מגיב A</td></tr><tr><td>MagNA Pure Compact Instrument</td><td>Roche</td><td>03731146001</td><td></td></tr><tr><td>MagNA Pure Compact NA Isolation Kit 1</td><td>Roche</td><td>03730964001</td><td></td></tr><tr><td>MEM (10x)</td><td>Gibco</td><td>11430030</td><td>MEM-10</td></tr><tr><td>MEM NEAA (100x)</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td>MEM-10</td></tr><tr><td>MEM תמיסת ויטמין</td><td>Gibco</td><td>11120052</td><td>MEM-10</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Merck</td><td>1.06329.0500</td><td>MEM-10</td></tr><tr><td>מחט</td><td>Terumo</td><td>NN*2332R9</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Medicago</td><td>09-8912-100</td><td></td></tr><tr><td>סינתזת פריימר</td><td>Mission Biotech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNasin מעכב ריבונוקלאז</td><td>Promega</td><td>N2111</td><td></td></tr><tr><td>שירות ריצוף</td><td>Mission Biotech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Slide</td><td>Thermo Scientific</td><td>AA00008032E00MNT10</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פירובט (100 מ"מ)</td> <td>Gibco</td><td>11360070</td><td>MEM-10</td></tr><tr><td>חרוזי נירוסטה</td><td>QIAGEN</td><td>69989</td><td></td></tr><tr><td>כרית סופגת סטרילית</td><td>3M</td><td>1604T-2</td><td></td></tr><tr><td>מסנן מזרק</td><td>Nalgene</td><td>171-0045</td><td></td></tr><tr><td>Taq פולימראז</td><td>JMR Holdings</td><td>JMR-801</td><td></td></tr><tr><td>Thermal cycler</td><td>Applied Biosystems</td><td>2720</td><td></td></tr><tr><td>TissueLyser II</td><td>QIAGEN</td><td>85300</td><td></td></tr><tr><td>מדכא לשון</td><td>HONJER CO., LTD.</td><td></td><td></td>122246</tr><tr><td>פינצטה</td><td>טניסון מכשירים רפואיים פיתוח ושות', בע"מ</td><td>A0601</td><td></td></tr><tr><td>טילוזין טרטרט</td><td>סיגמא</td><td>T6271-10G</td><td>MEM-10</td></tr></tbody></table>

נוהל הפעלה רגיל של מעקב וירוס של אוכלוסיית העטלף בטייוואן

Standard Operating Procedure for Lyssavirus Surveillance of the Bat Population in Taiwan

וירוסים בתוך הסוג lyssavirus הם zoonotic פתוגנים, ולפחות שבעה מינים lyssavirus קשורים למקרים אנושיים. בגלל עטלפים הם מאגרי הטבע של רוב lyssaviruses, תוכנית מעקב lyssaviruses של עטלפים נערך בטייוואן מאז 2008 כדי להבין את האקולוגיה של וירוסים אלה עטלפים. בתוכנית זו, ארגונים לא ממשלתיים לשימור ומרכזים מקומיים לבקרת מחלות בעלי חיים שיתפו פעולה לאיסוף עטלפים מתים או עטלפים המתים מחולשה או ממחלות. רקמות המוח של עטלפים הושגו באמצעות נקרופסי ונתון לבדיקה אנטי פלואורסצנט פלורסנט ישירה (FAT) והפוכה תמלול שרשרת פולימראז (RT-PCR) לאיתור של אנטיגנים lyssavirus וחומצות גרעין. עבור ה-FAT, מומלץ לפחות שתי שערי מעלה של אבחון כלבת. עבור ה-RT-PCR, שני סטים של התחל (JW12/N165-146, N113F/N304R) משמשים כדי להגביר רצף חלקי של הגן הנואופפרוטאין ליקיה. תוכנית ההשגחה הזאת עוקבת אחר. וירוסים וסוכני zoonotic אחרים בעטלפים טייוואן בת lyssavirus נמצא בשני מקרים של pipistrelllllllllllllllllllllllllllllllllllla ממצאים אלה צריכים ליידע את הציבור, אנשי הבריאות, ומדענים של הסיכונים הפוטנציאליים של יצירת קשר עם עטלפים וחיות בר אחרות.

מ 2014 עד מאי 2017, 332 בת גוויות מ -13 מינים נאספו עבור מעקב. . שני בדיקות חיוביות במקרה העטלף הראשון, את הרושם המוח נבדק שלילי באמצעות שומן עם אחד המסחרי FITC מצועם כלבת נגד נוגדנים (איור 2), בעוד RT-בדיקות העסקת כל אחת מערכות התחל (JW12/N165-146, N113F/N304R) הניב תוצאות חיוביות (איור 3). רצף של 428 bp של אמפליקון (מוגבר עם N113F/N304R והמכיל את הגן החלקי של נואופלפרוטאין) הושג. הרצף שלו היה נתון לביצוע שאילתות הפיצוץ של מסד הנתונים GenBank. התוצאה הראתה כי ה...

פרוטוקול זה מציג נוהל הפעלה מעבדה סטנדרטית עבור בדיקות אבחון של אנטיגנים lyssavirus ירוס בעטלפים בטייוואן.

Viruses within the genus Lyssavirus are zoonotic pathogens, and at least seven lyssavirus species are associated with human cases. Because bats are ...

Lyssavirus הוא פתוגנים ללא טיקים בגן החיות. כדי להעריך את נוכחותו של ליסאבירוס באוכלוסיות עטלפים טייוואני, יזמנו תוכנית מעקב. והוא זיהה בהצלחה ארבעה ליסאבירוסים מ-2016 עד 2018.פרוטוקול זה הוא היכרות שלב אחר שלב עם מעקב vi-al Lyssavirus בטייוואן. אנו מקווים שזה יהיה שימושי למחקרים המעוניינים במעקב vi-al Lyssavirus. חשוב לחבר את סמל החבית המיקס הנכון.עטלף מת או גוסס מתאים יותר מאשר עטלף חי למעקב Lyssavirus. בהתאם לתקנות הבטיחות הביולוגית של המדינה בה ממוקמת המעבדה; בצע את ההליכים הבאים במעבדה מתאימה ברמת בטיחות ביולוגית. ולהבטיח כי החוקרים מוסמכים כיום ללבוש ציוד מגן אישי נאות.על אוסף של עטלפים או פקות חלשים או חולים, יש אקולוג עטלף לזהות את מיני העטלפים על ידי המאפיינים המורפולוגיים של הדגימה. שלח דף מידע למעבדה, כולל אתר האיסוף, מינים, סימנים קליניים ונתונים רלוונטיים אחרים עם כל דגימת עטלף. לפני תחילת הנקרוסקופיה, בדקו את כל פתחי הדרך החיצוניים וצלמו את העטלפים תכונות חיצוניות, במיוחד את הראש, האוזניים והכנפיים להת בידול מינים.כדי לאסוף דגימת ספוגית אוראלית מניחים את המחבט בהפוגה גחון על לוח ניתוח סטרילי ולתקן את הראש עם פינצטה. השתמש אזמל לחתוך את העור לאורך קו האמצע של אזור העגל;ולמשוך את העור לצדדים הצדדיים, כדי להפוך חתך בגולגולת לאורך קו האמצע של אזור העגל. פתח את הגולגולת עם פינצטה כדי לחשוף את רקמת המוח ולהשתמש פינצטה כדי להפריד בעדינות את רקמת המוח מן רקמת העצב מחובר.חותכים את החתך של המוח, כולל גזע המוח והמוח הקטן, ולגעת קלות את פני השטח החתוכים של רקמת המוח עם מגלשות זכוכית כדי להפוך את רושם למריחה. לחץ על השקופית על רקמת העדשה כדי להסיר את הרקמה העודפת ולתקן את שקופיות רושם למריחה במינוס 20 מעלות צלזיוס אצטון במשך 30 דקות. ואז לתקן חתיכה קטנה של רקמת מוח טרי, בפורמלין, לבדיקה היסטופתולוגית.ולמקום את שאר הרקמה ב emi-em 10 להפקת חומצת גרעין. לאחר מכן, חתוך את העור מהסעפת לפי הטבעת לאורך קו האמצע של הגוף, ולהשתמש פינצטה כדי להרים ולהפריד את העור ולה מדגיש את רקמות השריר; כדי לאפשר איסוף של בלוטות הרוק, הממוקם ליד עצם הלסת הלסת. מרים מעט את עצם החזה עם פינצטה, להשתמש באזמל כדי לחתוך את עצם החזה ואת דופן הבטן לאורך קו האמצע לחתוך את עצם הבריח.השתמש במחטים כדי לתקן את כלובי הצלעות השמאלית והימין ללוח הניתוח, כדי לפתוח את חלל בית החזה. ולתקליט את הלגיונות הגולמיים ואת מידת השינוי שלאחר המוות. לאחר מכן השתמש פינצטה ואזמל כדי להסיר את רקמות הקרביים בהתאם לניתוח במורד הזרם המתוכנן.כדי לבצע בדיקת נוגדנים פלואורסצנטיים ישירה בסוף ההתקבעות, ייבשו את מגלשות הרושם של ההכפשה ובחרו לפחות שני נוגדנים נוגדנים נגד כלבת פלורסצנטיים לניתוח. סנן נוגדן אחד על כל שקופית דרך מסננת מיקרומטר 0.45. ותדגר את המגלשות במשך 30 דקות ב-37 מעלות צלזיוס בתא לח.בסוף הדגירה, לנקז את ההצתה עודף ולשטוף את השקופיות עם PBS. לאחר מכן השתמש באמצעי אחסון קטן של 10%glycerol כדי לטעון החלקות כיסוי על השקופיות ולדמיין את השקופיות באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. כאשר בדיקת הנוגדנים הפלואורסצנטיים או ניתוח RT-PCR מצביעים על חיוביות, הומוגניזציה של דגימת המוח ב-10%ההשעיה ב- emi-en 10 ומשביעה את הרקמות על ידי צנטריפוגה.לחסן 200 microliters של סופר nat-en עם שלוש פעמים 10 לתאי נוירובלסטומה העכבר השישי ומיליליטר אחד של emi-en 10 במשך שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס ו 1% פחמן דו חמצני. ולהעביר את ההשעיה של תא הומוגני המוח לבקבוק בריבוע 25 ס"מ, המכיל שישה מיליליטר של emi-en טרי 10. במיליליטר אחד של השעיית תא הומוגני במוח לתוך מגלשת זכוכית מצופה טפלון ארבע בארות, עם קוטר של שישה מילימטרים ולמקום את השקופית ב 37 מעלות צלזיוס ו 1% פחמן דו חמצני במשך שלושה עד ארבעה ימים.לאחר קיבעון עם 100% אצטון, להכתים את השקופיות עם אותם שני נוגדנים פלואורסצנטיים אצנוגדנים נגד כלבת המשמשים לבדיקת נוגדנים פלואורסצנטיים. ולהמחיש את השקופיות על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטי כדי לקבוע את מספר התכלילים intracida-plas-מיקרופון. לאחר נסיונות ותת-culturing את תרבות התאים מחוסנים על פי פרוטוקולים סטנדרטיים, להחזיר את התרבות הקרה לאנקובטור תרבות התא עוד שלושה עד ארבעה ימים עם ספירה חוזרת של מספר התאים הנגועים כפי שהודגם רק עד 100% להדביק הוא הגיע.מינואר 2014 עד מאי 2017 נאספו 332 גומי עטלפים מ-13 מינים למעקב. בניתוח מייצג זה של שני מקרי עטלף חיוביים, הרושם המוחי נבדק שלילי באמצעות בדיקת הנוגדנים הפלואורסצנטיים עם אחד הנוגדנים המסחריים, המתאימים נגד כלבת, בעוד RT-PCR המעסיק כל אחת משתי קבוצות פריימר שונות, הניב תוצאות חיוביות. סובייקטיביות של רצף אמפלי-קון שהושג לשאילתת פיצוץ במסד הנתונים של בנק Gen גילתה כי הרצף דומה ל-Lyssaviruses עם זהויות של פחות מ-79% התומכות בזהויות של ה-Lyssaviruses שזוהו.שני ליסאבירוס בודדו לאחר מכן בהצלחה משני המוחות כפי שאושרו על ידי בדיקת נוגדנים פלואורסצנטיים וריווח. הצעד העיקרי לקביעת החיוביות של Lyssavirus הם בדיקת הנוגדנים הפלואורסצנטיים וניתוח RT-החייאה. מומלץ מאוד להשתמש בשני נוגדנים נגד כלבת או יותר בערכות פריימר.בנוסף ל-Lyssavirus ניתן ל לפקח על פתוגנים אחרים של עטלפים לא-ical בגן החיות בשיטות אבחון סגורות. לאחר מכן ניתן להשתמש בנתונים כדי ליידע את הציבור על הימנעות ממגע עם עטלפים. ככל שנוכל לחקור יותר את בת לסבירוס, כך נוכל להבין יותר את התפתחותה ואת השפעתה על בריאות הציבור.

standard-operating-procedure-for-lyssavirus-surveillance-bat

Research

JoVE Journal

Environment

סביבה

כאן, אנו מציגים את הפרוטוקולים כדי לזהות immunomodulators 1) וירוס מקודד המקדמים arbovirus השכפול וגורמים מארח 2) האיקריוטים שמגבילות את שכפול arbovirus. שיטות אלה פלורסצנטיות הפריה חוץ גופית מבוססות מאפשרים להשיג במהירות את המפרט כמותית של שכפול arbovirus ב מבחני פשטני עם יחס אות לרעש נמוך.

זיהומים arbovirus כמו כלים ההקרנה לצורך זיהוי גורמים אנטי ויראלי Immunomodulators ומנחה

פאן-lyssavirus וירוס שעתוק הפוכה התגובה שרשרת פותחה כדי לזהות במיוחד את כל lyssavirus ידוע. אימות באמצעות דגימות מוח של כלבת ממינים שונים של בעלי חיים הראו כי שיטה זו יש רגישות וספציפיות שוות ערך לבדיקת נוגדן הפלורסנט הסטנדרטית וניתן להשתמש בה לאבחון כלבת שגרתית.

הערכה של מקונן אוניברסלי הפוכה תגובת שרשרת פולימראז לאיתור של Lyssaviruses

זהו פרוטוקול עבור הכנת רקמה אופטימלית עבור גנומית, טראנסקריפט, וניתוחים פרוטאומית של עטלפים נתפס בטבע. הוא כולל פרוטוקולים עבור לכידת בת וניתוח, שימור רקמות, ותא culturing של רקמת בת.

אוסף רקמות של עטלפים עבור-ניתוח Omics ותרבות התא הראשוני

זה בזמן אמת RT-PCR באמצעות הצבע הintercalating מתאים לאבחן זיהומים lyssavirus ירוס. השיטה מתחילה עם רנ א שחולצו מפני חשד כלבת לאחר המוות או דגימות שלאחר המוות, המפרט הכנה לערבב הורים, הוספת RNA, ההתקנה של מכונת בזמן אמת ופרשנות נכונה של תוצאות.

הפאן-lyssavirus בזמן אמת RT-PCR לאבחון כלבת

אנו מציגים פרוטוקול מלאה לאבחון שלאחר המוות של כלבת בעלי חיים תחת תנאי שדה באמצעות מבחן חיסוני מהיר האבחון (RIDT), מן הבדיקה ביופסיה המוח לפרשנות הסופי. אנו גם לתאר יישומים נוספים באמצעות המכשיר לניתוח מולקולרי הגנוזות ויראלי.

שדה הנתיחה לאחר המוות חיסוני מהיר מבחן אבחון עבור הגדרות מוגבלות משאב עם יישומים מולקולריים נוספים

פרוטוקול זה מדגים את בדיקת תגובת שרשרת פולימראז (RT-PCR) בזמן אמת של pan-lyssavirus LN34 מאיסוף רקמות ועד לפירוש התוצאה, כולל עדכונים לרצפי פריימר ותכשירים לשיפור ביצועי הבדיקה עבור כמה נגיפי ליסה ולגומורפים שאינם כלבת. אנו גם מדגימים את מערך הבדיקה עבור פורמט LN34 מרובב (LN34M) בעל באר אחת.

אבחון לאחר המוות של כלבת בבעלי חיים על ידי מבחן תגובת שרשרת פולימראז LN34 המעודכן והמרובה בזמן אמת

פותחה גישה לזיהוי תנאי ריכוז נגיפי אופטימליים עבור דגימות מים בנפח קטן באמצעות קוצים של אדנו-וירוס אנושי. הטכניקות המתוארות כאן משמשות לזיהוי פרמטרי ריכוז עבור מטרות נגיפיות אחרות, ומיושמות על ניסויים בריכוז נגיפי בקנה מידה גדול.

נוהל נפח קטן לריכוז נגיפי ממים

נדרש טיפול מיוחד ב"טכניקות נקיות" כדי לאסוף ולעבד כראוי דגימות מים למחקרי עקבות מתכות בסביבות מימיות. מוצג פרוטוקול לדגימה, עיבוד והליכים אנליטיים במטרה להשיג נתוני ניטור סביבתי אמינים ותוצאות עם רגישות גבוהה למחקרי עקבות מפורטים.

נקי דיגום ואנליזה של נהר ושפכי הנהרות ווטרס ללימודי מתכת עקבות

פלנקטון וחלקיקים מושעה לשחק תפקיד מרכזי המעגלים הביוגיאוכימיים באוקיינוס. כאן, אנו מספקים שיטה אולטרה נקי, נמוך מתח עבור האוסף בגדלים שונים של חלקיקים פלנקטון בים עם יכולת לטפל בכמויות גדולות של מי ים.

מנגנון רב שכבתי אולטרה נקי של איסוף פלנקטון ימית גודל Fractionated וחלקיקים מושעה

אנו מציגים פרוטוקול לסינתזה של C5 סוכרים (xylose, אראבינוז) מ מתחדשת שאינם מיועדים לאכילה lignocellulosic ביומסה (קרי, יוטה) עם הנוכחות של Brønsted נוזלים יוניים חומצי (ביצים) כזרז במים. הזרז ביילס הציג כדאי קטליטי ביצועים יותר קונבנציונליים המינרל זרזים חומצה (H2אז4 ו- HCl).

שיטה לניתוח Pentosan נוכח יוטה ביומסה והמרה שלה לתוך מונומרים סוכר באמצעות נוזל חומצי יוניים

למדו נוהל סטנדרטי לאבחון אנטיגנים של ליסה-וירוס בעטלפים בטייוואן. שיטה זו מסייעת לחוקרים לבצע מעקב וירולוגי יעיל ולזהות נגיפים זואונוטיים.

נוהל הפעלה רגיל של מעקב וירוס של אוכלוסיית העטלף בטייוואן

גלה סרטונים נוספים