Name: הערכה של סרטן המעי הגס סיכון ושכיחות על ידי שרפרף DNA זיהוי שלמות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-08T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: למדו שיטת זיהוי לא פולשנית לסרטן המעי הגס באמצעות ערכת FL-DNA. השיטה משפרת את דיוק הסקרים הקיימים ומסייעת לחזות את נוכחות הלסיות הנאופלסטיות ביעילות ובמהירות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

למחברים אין ותודות.

המטופלים גויסו בבית החולים הקונטולוו רומאנולו לולו סטודיו e לה דה טוורי (IRST) של מלנדולה (FC, איטליה) בין 2013 ל 2015. חולים נרשמו היו לתוך פרוטוקול IRSTB002, אושרה על ידי ועדת האתיקה של IRST-IRCCS AVR (25/10/2012, ver .1). כל השיטות בוצעו בהתאם להנחיות ולתקנות רלוונטיות. הסכמה מושכלת בכתב הושגה מכל המטופלים.
1. חילוץ דנ א מצואה
<ol><li>השתמשו בערכה להכנת דגימות צואה (ראו טבלת חומרים). בחר וטפל בחומר הצואה על-ידי ביצוע החילוץ בהתאם להוראות היצרן. להגביר את הדנ א הטהור ישירות או לאחסן ב-20 ° c לניתוח הבא.</li>
</ol>2. הכנת בקרה חיובית, סטנדרטים, ספייק-DNA, ודגימות קליניות
<ol><li>הכנת תקנים ודגימות<ol>
<li>כדי להכין את השליטה החיובית, סטנדרטים, ספייק-ב-DNA, ואת כל הדגימות הקליניות, צנטריפוגה מראה של שליטה חיובית, תקנים, ו-DNA-ב, לאחר מכן להשעות מחדש כל מגיב על ידי הוספת כמות נכונה של מים שסופקו (ראה להלן). ואז, מערבולת בזהירות את השליטה החיובית, סטנדרטי, ו-DNA-in-in, ולאחר מכן צנטריפוגה עבור 10 s. כדי להשיג השעיה מלאה של ריאגנטים יבש, לאחסן את ריאגנטים נוזלי בטמפרטורת החדר (RT) עבור 30 דקות לפני השימוש.<ol>
<li>השליטה החיובית היא דנ א אנושי בפורמט יבש. השהה מחדש כל נורית עם 750 μL של מים.</li>
			<li>ה-DNA של הדקר הוא סלמון (Oncorהלופון keta) dna, אשר משמש כפקד פנימי אקסוסוגני כדי לאמת את הנוכחות האפשרית של מעכבי בדגימות DNA שחולצו מצואה. השהה מחדש כל נורית עם 100 μL של מים.</li>
		</ol>
</li>
		<li>כדי להכין את עקומת התקן, ליצור ארבעה 1:5 מדלל החל מהפתרון במניה. הנקודות הסטנדרטיות חייב להיות 10 ng/התגובה, 2 ng/התגובה, 0.4 ng/התגובה, ו 0.08 ng/התגובה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הכנת ה-DNA של הדקר הראשונה<ol>
<li>הכן את בקרת ה-DNA של הדקר ישירות לפני השימוש.</li>
		<li>הכן את 1 x ספייק בקרת דנ א על ידי ערבוב 5 μL של FL-DNa ספייק עם 20 μL של מים סטריליים. מספר של 1 x ספייק דגימות בקרת DNA יהיה מוכן על פי מספר הדגימות שיש לנתח, בתוספת שליטה חיובית.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הכנת דגימות<ol>
<li>מערבבים 75 μL של דגימות (דגימות קליניות או בקרה חיובית) עם 25 μL של 1 x ספייק-ב-DNA, מניב נפח כולל של 100 μL.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. הגברה ונחישות של הערך FL-DNA באמצעות qPCR Easy PGX
הערה: תערובות הגברה מלאות המכילות את התחל והבדיקות הספציפיות המכוונות ל-dna האנושי והשליטה הפנימית מסופקים בתבנית ליטליבית ב -8 רצועות היטב לתמהיל fl-dna mix a ו-fl-dna mix B. תקנים, שליטה חיובית ושלילית, והדגימות חייבות להיות מוגברה עם תערובות ליטו דגימות קליניות רק צריך להיות מוגבר רק בשכפול עם שני מתערבב ליקומי.
<ol><li>עיין בטבלת החומרים של הכלי ותוכנת ההפעלה של qpcr.<ol>
<li>פתח את תוכנת ההפעלה והגדר את הלוחית והפרופיל התרמי:<ol>
<li>הגדר את הצלחת כפי שמוצג בטבלה 1.<ol>
<li>הגדר את סוג הבאר עבור כל שמונת המיקומים בעמודה 1 כרגיל.</li>
				<li>הגדר את סוג הבאר עבור הבארות A2 ו-B2 כ- Ntc.</li>
				<li>הגדר את סוג הבאר עבור C2 ו-D2 (הפקדים החיוביים) כבלתי ידועים.</li>
				<li>הגדר את סוג הבאר עבור כל המיקומים האחרים כבלתי ידועים.
</li>
				<li>בחר את כל המיקומים 96, ולהוסיף את משפחה צבע הקסדצימאלי. לחץ על לוח סנכרון.</li>
			</ol>
</li>
			<li>הגדר את הפרופיל התרמי לפי טבלה 2.</li>
		</ol>
</li>
		<li>צנטריפוגה את המספר הדרוש של רצועות עבור 10 s כדי להביא את התוכן לתחתית הצינור.</li>
		<li>להסיר בעדינות את חותמות מן הרצועות, תוך כדי לשים לב לשמור את התוכן, ולהוסיף את הרצועות המתאימות: שליטה שלילית: 20 μL של מים; לדוגמה: 20 μL של דנ א; עקומת סטנדרטי: 20 μL של תקן 1, 2, 3 או 4; שליטה חיובית: 20 μL של שליטה חיובית.</li>
		<li>סגור בקפידה את כל הרצועות באמצעות 8 רצועה כמוסות אופטיות שטוחות ומערבולת לכמה שניות.</li>
		<li>צנטריפוגה את הרצועות עבור 10 ולטעון אותם לתוך המכשיר. . אז תתחיל לרוץ</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. ניתוח נתונים
הערה: ניתן לבצע ניתוח נתונים באופן אוטומטי או ידני בהתאם לתוכנה (ראה טבלת חומרים).
<ol><li>בסוף ההפעלה, בחר עמודות A, C, E, G עבור "משפחה: FL-DNA-A" ו "HEX: IC", ועמודות B, D, F, H עבור "המשפחה: FL-DNA-B" ו-"hex: IC".</li>
	<li>הגדר את הפרטים הבאים עבור כמות ההתחלתי של כמויות: 10 ng/התגובה עבור בארות A1 ו-B1, 2 ng/תגובה עבור C1 ו-D1, 0.4 ng/התגובה עבור E1 ו F1, ו 0.08 ng/התגובה עבור G1 ו-H1.</li>
	<li>הגדר ערכי הזריחה של הסף ל 150 משפחה (FL-dna A ו-FL-dna B) ו-HEX (IC) ערוצים.</li>
	<li>בתיבה תוצאות טבלה, לחץ על אפשרויות עמודה | בחר הכל | אישור כדי לקבל את התוצאות בשני הערוצים עם cq המתאים שלהם (∆ R) ו ∆ r הערכים האחרונים. הערה: ערכים אלה מסופקים על-ידי תוכנת הכלי של מכשיר ה-PCR בזמן אמת. ΔR האחרון מתייחס לערך הזריחה המנורמל למחזור ההגברה האחרון.</li>
	<li>בתיבה תוצאת טבלה, לחץ לחיצה ימנית על הטבלה כדי לפתוח את התפריט תלוי ההקשר ולחץ על שלח ל-Excel כדי לייצא את הנתונים הגולמיים.</li>
	<li>בדוק את ערכי התקנים כדי לאמת את ההתאמה של העקומה הסטנדרטית.</li>
	<li>עבור כל שילוב FL-DNA, לבדוק את R2 ["r ² (∆ R)" עמודה] ויעילות ["יעילות (%)" עמודה] ערכים. אם הם נמצאים בטווח מקובל, ניתן להמשיך בניתוח בהתאם להוראות היצרן (שולחן 3).</li>
	<li>אם תוצאות ערוץ ה-משפחה אינן נמצאות בטווח הצפוי, השמט נקודה אחת של העקומה הרגילה והפעל מחדש את ההפעלה.</li>
	<li>קבע את ערכי הפקדים השליליים והחיוביים עם הנוסחה הבאה, בהתחשב בערכים "No Cq" כאפס: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/59426/59426eq1.jpg"> <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/59426/59426eq2.jpg">
</li>
	<li>השווה בין הערכים המתקבלים לאלה המדווחים בטבלה 4.</li>
	<li>אם שולטת התגובה הם בטווח של ערכים צפויים, להמשיך עם ניתוח של דגימות. הערה: ודא שערכי Cq שהתקבלו מופקים מתגובת הגברה אמיתית (עקומת פלואורסצנטית מסיבית) ולא מחפץ (עקומת פלואורסצנטית לינארית).</li>
	<li>כדי לנתח את ההתאמה של המדגם עבור כל שילוב FL-DNA, להשוות את ערכי Cq של ערוץ HEX. אם הערך הוא ≥ 16, המשך בניתוח הדגימות. אם הערך הוא &lt; 16 או שאין Cq, סביר להניח שהסיבה לכך היא שגיאה מחוץ לספייק-DNA. לכן, לא ניתן לנתח את הדגימות.</li>
	<li>חשב את הממוצע של ערכי Cq בערוץ "HEX" של הפקד החיובי באמצעות הנוסחה הבאה: <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/59426/59426eq3.jpg">
</li>
	<li>חשב את הממוצע של ערכי Cq בערוץ "HEX" של המדגם הכפול באמצעות הנוסחה הבאה: <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/59426/59426eq4.jpg">
</li>
	<li>חשב את הערכים ∆ CqHEX בהתאם לנוסחה הבאה: <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/59426/59426eq5.jpg">
</li>
	<li>השווה את ערכי ∆ CqHEX של הדגימות עם אלה שדווחו בטבלה 5.</li>
	<li>עבור כל תערובת (Mix A ו-Mix B), השווה את ערכי ה-Cq של ערוץ המשפחה עם אלה המדווחים בטבלה 6.
</li>
	<li>כדי לקבוע את ערך FL-DNA של כל דוגמה מתאימה, השתמש בנוסחה הבאה, בהתחשב בערכי "No Cq" כאפס: <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/59426/59426eq6.jpg"> <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/59426/59426eq2.jpg"> הערה: הסיכון לסרטן המעי הגס ושכיחות היא פונקציה של הערכות iFOBT ו-FL-DNA על פי התוצאות nomogram Fagan שהתקבלו על ידי Rengucci ואח '12 (שולחן 7).</li>
</ol>

<ol><li>Fearon, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Genetics+of+Colorectal+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Molecular Genetics of Colorectal Cancer.</a> Annual Review of Pathology. 6, 479-507 (2011).</li>
<li>Sears, C. L., Garrett, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbes%2C+Microbiota%2C+and+Colon+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+and+Microbe%22%5BJournal%5D)">Microbes, Microbiota, and Colon Cancer.</a> Cell Host and Microbe. 15, 317-328 (2014).</li>
<li>SEER Stat Fact Sheets: Colon and Rectum Cancer. National Cancer Institute. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://seer.cancer.gov/statfacts/html/colorect.html">http://seer.cancer.gov/statfacts/html/colorect.html</a> (2019).</li>
<li>Levin, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+and+Surveillance+for+the+Early+Detection+of+Colorectal+Cancer+and+Adenomatous+Polyps%2C+2008%3A+A+Joint+Guideline+From+the+American+Cancer+Society%2C+the+US+Multi-Society+Task+Force+on+Colorectal+Cancer%2C+and+the+American+College+of+Radiology%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Screening and Surveillance for the Early Detection of Colorectal Cancer and Adenomatous Polyps, 2008: A Joint Guideline From the American Cancer Society, the US Multi-Society Task Force on Colorectal Cancer, and the American College of Radiology.</a> Gastroenterology. 134, 1570-1595 (2008).</li>
<li>Bosch, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+tests+for+colorectal+cancer+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Colorectal+Cancer%22%5BJournal%5D)">Molecular tests for colorectal cancer screening.</a> Clinical Colorectal Cancer. 10, 8-23 (2011).</li>
<li>Ahlquist, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+detection+of+colorectal+neoplasia%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Molecular detection of colorectal neoplasia.</a> Gastroenterology. 138, 2127-2139 (2010).</li>
<li>Calistri, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fecal+multiple+molecular+tests+to+detect+colorectal+cancer+in+stool%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Fecal multiple molecular tests to detect colorectal cancer in stool.</a> Clinical Gastroenterology and Hepatology. 1, 377-383 (2003).</li>
<li>Calistri, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+colorectal+cancer+by+a+quantitative+fluorescence+determination+of+DNA+amplification+in+stool%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Detection of colorectal cancer by a quantitative fluorescence determination of DNA amplification in stool.</a> Neoplasia. 6, 536-540 (2004).</li>
<li>Calistri, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+fluorescence+determination+of+long-fragment+DNA+in+stool+as+a+marker+for+the+early+detection+of+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Oncology%22%5BJournal%5D)">Quantitative fluorescence determination of long-fragment DNA in stool as a marker for the early detection of colorectal cancer.</a> Cellular Oncology. 31, 11-17 (2009).</li>
<li>Calistri, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fecal+DNA+for+noninvasive+diagnosis+of+colorectal+cancer+in+immunochemical+fecal+occult+blood+test-positive+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Epidemiology+Biomarkers+and+Prevention%22%5BJournal%5D)">Fecal DNA for noninvasive diagnosis of colorectal cancer in immunochemical fecal occult blood test-positive individuals.</a> Cancer Epidemiology Biomarkers and Prevention. 19, 2647-2654 (2010).</li>
<li>De Maio, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+and+stool+nucleic+acid+analysis+for+colorectal+cancer+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Circulating and stool nucleic acid analysis for colorectal cancer diagnosis.</a> World Journal of Gastroenterology. 20, 957-967 (2014).</li>
<li>Rengucci, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+stool+DNA+integrity+method+for+early+colorectal+cancer+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Epidemiology+Biomarkers+and+Prevention%22%5BJournal%5D)">Improved stool DNA integrity method for early colorectal cancer diagnosis.</a> Cancer Epidemiology Biomarkers and Prevention. 23, 2553-2560 (2014).</li>
</ol>

מאורה מנאגי הוא עובד במשרה מלאה of Diatech פרמקוגנטיקה srl.

מחקרים קודמים הוכיחו כי שלמות DNA ניתוח של שרפרפים שחולצו על ידי גישות ידניות וחצי אוטומטי יכול לייצג כלי אלטרנטיבי לגילוי מוקדם של נגעים המעי הגס7,8,9,10,11,12. מולקולרית, בדיקות ההקרנה לא פולשנית פותחו במהלך השנים לאיתור של סרטן המעי הגס, אבל הדיפוזיה הנרחבת של שיטות אלה מוגבלת בשל הגישות גוזלת זמן וללא עלות נמוכה לעומת בדי...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/59426/evaluation-colorectal-cancer-risk-prevalence-stool-dna-integrity">Evaluation of Colorectal Cancer Risk and Prevalence by Stool DNA Integrity Detection</a>. An&#160;affiliation&#160;was&#160;updated.
The first&#160;affiliation was updated from:
Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST)
to:
Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) IRCCS, Meldola, Italy

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/59426/evaluation-colorectal-cancer-risk-prevalence-stool-dna-integrity">Evaluation of Colorectal Cancer Risk and Prevalence by Stool DNA Integrity Detection</a>. An&#160;affiliation&#160;was&#160;updated.

Erratum: Evaluation of Colorectal Cancer Risk and Prevalence by Stool DNA Integrity Detection

סרטן המעי הגס (CRC) נובע תהליך רב שלב שבו האפיתל בריא לאט מתפתחת לתוך אדנומות או פוליפים, אשר התקדמות קרצינומות ממאירים לאורך זמן1,2. למרות שיעור השכיחות הגבוה של CRC, מגמה כלפי מטה באחוז מקרי המוות נצפתה בעשור האחרון3. אכן, כלים אבחון מוקדם שאומצה תוכניות הקרנה הובילו גילוי מוקדם והסרה של אדנומות טרום הנאופלסטית או פוליפים4. עם זאת, בשל המגבלות הטכניות השונות, אף אחת מהשיטות הללו אינה אופטימלית. ואכן, כדי לשפר את הרגישות והספציפיות, הוצעו בדיקות דנ א שרפרף רבות בלבד או בשילוב עם בדיקות אבחון5שגרתיות 5,6.
בדרך כלל, רירית בריאה שופך את זרם הצואה האפוציטים, בעוד רירית החולה מפילינג הקולונציטים בלתי אפוטוטיות. שברים של 200 bp או יותר באורך לאפיין את ה-DNA לא אפוטוטית. ה-DNA הזה נקרא DNA ארוך (L-DNA) והפך utilizable ביוקרה לאבחנה מוקדמת CRC. ה-dna יכול להיות מבודד מדגימת צואה וכימות על ידי qpcr באמצעות בדיקת מחוץ למערכת האבחון של מבחנה-dna בערכה7,8,9,10,11,12.
הבדיקה מורכבת משני שאומר לאיתור שברי FL-DNA החל 138 bp כדי 339 bp. כל שיטת הזמן מאפשרת הגברה של FL-DNA (משפחה) כמו גם ספייק-DNA (HEX). כדי להבטיח הגברה אופטימלית של כל השברים, הבדיקה חולקה לשתי שמות (בשם "A" ו-"B"). השיטת A מזהה שני אזורים של אקסון 14 של גן הנגמ ש (NM_001127511) וחלק של אקסון 7 של הגן TP53 (NM_001276760). שיטת B מזהה קטע של אקסון 14 של הנגמ ש (NM_001127511) ושני אזורים של אקסון 5 ו-8 של הגן TP53 (NM_001276760). ההסכמה אינה מבדילה בין האזורים שזוהו. ה-DNA של הדקר מתאים ל-DNA הoncorהלופון הסלמון מאפשר אימות כי ההליך נעשה כראוי ובודק את הנוכחות האפשרית של מעכבי, אשר עשוי להניב תוצאות שליליות שווא. הריכוז חליל-DNA מוערך על ידי קוונפיקציה מוחלטת באמצעות שיטת העקומה הסטנדרטית והוא מתבטא כ ng/התגובה.
השיטה FL-dna היא לא פולשנית וזולה שרפרף DNA מבחן, כי, בשילוב עם מבוסס מבחינה כימית חיסוני בדיקת דם סמוי (ifobt), משמש כיום תוכניות הקרנת crc ומאפשר תחזיות טוב יותר של CRC ו/או בסיכון גבוה הנגעים אדנומה12.

<table><tbody><tr><td>צינורות נעילת טוויסט מפוליפרופילן 1.5 מ"ל ו-2 מ"ל (ללא DNase-, RNase-, DNA-, מעכבי PCR)</td><td></td><td></td><td>חומרים מתכלים הנדרשים למיצוי DNA ואתנול מוחלט PCR בזמן אמת</td></tr><tr><td>(איכות של דרגה אנליטית)</td><td></td><td></td><td>מגיב נדרש למיצוי DNA</td></tr><tr><td>צנטריפוגה ספסלית&nbsp;</td><td></td><td></td><td>מהירות מרבית של 20000 x גרם. מכשיר נדרש למיצוי DNA</td></tr><tr><td>תוכנת ניתוח EasyPGX גרסה 2.0.0</td><td>Diatech Pharmacogenetics</td><td>תוכנת ניתוח RT800-SW</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>צנטריפוגה/מערבולת EasyPGX רצועות 8 בארות</td><td>Diatech Pharmacogenetics</td><td>RT803</td><td>מכשיר מומלץ לבדיקת PCR בזמן אמת</td></tr><tr><td>מכשיר EasyPGX qPCR 96&nbsp;</td><td>Diatech Pharmacogenetics</td><td>RT800-96</td><td>מכשיר מומלץ לבדיקת PCR בזמן אמת</td></tr><tr>ערכת FL-DNA <td>Diatech Pharmacogenetics</td><td>RT029</td><td>מוכנה ל-EasyPGX</td><td>נדרשת לבדיקת PCR בזמן אמת</td></tr><tr><td>מיקרופיפטות (נפחים מ-1 עד 1.000 ומיקרו; L)</td><td></td><td></td> <td>חומרים מתכלים הנדרשים למיצוי DNA</td></tr><tr>וכפפות <td></td><td></td><td>חד פעמיות ללא אבקה</td> PCR בזמן אמת <td>חומרים מתכלים הנדרשים למיצוי DNA וערכת PCR</td></tr><tr><td>QIAamp Fast DNA Stool</td><td>Qiagen</td><td>51604</td><td>מומלצת למיצוי וטיהור DNA מצואה</td></tr><tr><td>קצות מסנן סטריליים DNase-, RNase ללא (נפחים מ-1 עד 1.000 ומיקרו; L)</td><td></td><td></td> <td>חומרים מתכלים הנדרשים למיצוי DNA ובלוק תרמי PCR בזמן אמת</td></tr><tr><td>למשל בלוק יבש EasyPGX</td><td>Diatech Pharmacogenetics</td><td>RT801</td><td>מכשיר הנדרש למיצוי DNA</td></tr><tr><td>מערבולת למשל צנטריפוגה/מערבולת EasyPGX 1.5 מ"ל&nbsp;</td><td>מכשיר Diatech Pharmacogenetics</td><td>RT802</td><td>נדרש למיצוי DNA</td></tr></tbody></table>

הערכה של סרטן המעי הגס סיכון ושכיחות על ידי שרפרף dna זיהוי שלמות

Evaluation of Colorectal Cancer Risk and Prevalence by Stool DNA Integrity Detection

בימינו, שרפרף DNA יכול להיות מבודד ומנותח על ידי מספר שיטות. שרידים ארוכים של דנ א בצואה ניתן להבחין על ידי הספק qPCR, המספק סבירות אמינה לנוכחות של נגעים טרום הנאופלסטית או נאופלסטית המעי הגס. שיטה זו, המכונה DNA ארוך הזריחה (FL-DNA), הוא הליך מהיר, פולשני שהוא שיפור על מערכת המניעה העיקרית. שיטה זו מבוססת על הערכה של שלמות ה-DNA צואה על ידי הגברה כמותית של יעדים ספציפיים של דנ א גנומית. בפרט, הערכה של שברי DNA יותר מ 200 bp מאפשר זיהוי של חולים עם נגעים המעי הגס עם ספציפיות מאוד. עם זאת, מערכת זו וכל בדיקות ה-DNA שרפרף הזמין כרגע להציג כמה בעיות כלליות שצריך להיות ממוען (למשל, את התדר שבו יש בדיקות צריך להתבצע מספר אופטימלי של שרפרף שנאסף בכל נקודת זמן עבור כל אדם). עם זאת, היתרון העיקרי של FL-DNA היא האפשרות להשתמש בו בשיתוף עם מבחן המשמש כיום בתוכנית ההקרנה CRC, המכונה כימיקלים מבוססי חיסוני בדיקת דם סמוי (iFOBT). אכן, שתי בדיקות ניתן לבצע על אותו מדגם, הפחתת עלויות והשגת חיזוי טוב יותר של נוכחות בסופו של דבר של נגעים המעי הגס.

זרימת העבודה של פרוטוקול זה מוצגת באיור 1. זרימת העבודה מספקת שני צעדי בקרה ופעולות שונות בהתאם לתוצאות שלב אלה. ראשית, אם מדגם מציג פקדים לא מתאימים, יש לחזור על הגברה. שנית, אם הגברה מעכבות, יש לעבד את המדגם מההתחלה או לסווג כערך לא יקר.
איור 2 מציג את עקומות הזריחה המיוצרים על ידי דגימות חיוביות ושליליות. (א) מוצג דוגמה למדגם חיובי מתאים. האות לדוגמה בערוץ ה-HEX נמצאת בטווח המקובל. האות החיובי הוא מעל הסף בערוץ משפחתי. (ב) ...

ערכת האבחון המוצגת חליל-DNA היא שיטת חיסכון בזמן וידידותי למשתמש כדי לקבוע את ההסתברות האמינה של נוכחות של נגעים סרטן המעי הגס.

הערכה של סרטן המעי הגס סיכון ושכיחות על ידי שרפרף DNA זיהוי שלמות

Nowadays, stool DNA can be isolated and analyzed by several methods. The long fragments of DNA in stool can be detected by a qPCR assay, which provides a ...

שיטה זו מאפשרת לזהות, על ידי גישה לא פולשנית, חולה עם נגע neoplastic המעי הדם. בפרט, בדיקה זו מאפשרת, בשיתוף עם בדיקות המשמשות כיום בתוכנית הקרנת סרטן המעי הגס, כדי לחזות טוב יותר את נוכחותם של סרטן או סיכון גבוה יותר של נגעים חריגים. כדי להתחיל בפרוטוקול זה, צנטריפוגה aliquot של כל שליטה חיובית, DNAs סטנדרטי, ו- DNA ספייק ב, בפורמט יבש במשך 10 שניות על מיני צנטריפוגה.תן שימוש חוזר בשליטה החיובית עם 750 מיקרוליטרים של מים. תן מחדש את ה-DNA ספייק ב, המשמש שליטה פנימית אקסוגנית, כדי לבדוק את נוכחותם של מעכבים, עם 100 microliters של מים. עבור העקומה הסטנדרטית, בצע שימוש חוזר בתקן היבש עם 100 מיקרוליטרים של מים ובצע ארבעה דילולים של 1:5 החל מתסמת המלאי.לאחר מכן, בזהירות מערבולת reagents במשך 15 שניות, ו צנטריפוגה בצנטריפוגה מיני במשך 10 שניות. למשך שימוש חוזר מלא, יש לאחסן את הריג'ים הנוזליים בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות לפני השימוש. כדי להכין את בקרת ה-DNA ספייק-אין 1x, לערבב חמישה microliters של ספייק FL-DNA עם 45 microliters של מים סטריליים.עבור הדגימות, לערבב 75 microliters של כל מדגם עם 50 microliters של 1x ספייק ב- DNA, מניב נפח כולל של 125 microliters. תחילה, פתח את תוכנת ההפעלה qPCR. כדי להגדיר את הלוחית, הגדר את סוג באר עבור כל שמונת המיקומים בעמודה אחת, כסטנדרט.הגדר את סוג הבאר עבור הבאר A2 ו- B2 כ- NTC. הגדר את סוג באר עבור הפקדים החיוביים, C2 ו- D2, כבלתי ידועים. ולהגדיר את סוג באר עבור כל העמדות האחרות כמו לא ידוע.בחר את כל 96 המיקומים. הוסף את הצבעים, FAM ו- HEX ולחץ על סנכרן צלחת. לאחר מכן הגדר את הפרופיל התרמי, כפי שסופק.הכינו את המספר הרצוי של רצועות 8 בארות המכילות תערובות הגברה ליופיפיליות שלמות, עם פריימרים ובדיקות ספציפיים המכוונים לדנ"א האנושי, והשליטה הפנימית. כדי להביא את התוכן לתחתית הצינורות, צנטריפוגה את הרצועות במשך 10 שניות. בעדינות להסיר את החותמים מן הרצועות, הקפד לא לאבד כל גלולה.לאחר מכן הוסיפו 25 מיקרוליטרים של מים ל בארות הבקרה השליליות. 25 מיקרוליטרים של דנ"א לדוגמה כדי לדגום בארות ו-25 מיקרוליטרים של דנ"א שליטה חיובי ל בארות הבקרה החיוביות. לעקומה הסטנדרטית, הוסיפו 25 מיקרוליטרים של באר רגילה 1, 2, 3 ו-4 בכל באר ייעודית.השתמש באותיות אופטיות שטוחות עם 8 פסים כדי לסגור בזהירות את כל הרצועות והמערבולת למשך מספר שניות. צנטריפוגה הרצועות במשך 10 שניות, לטעון אותם לתוך המכשיר, ולהתחיל את הריצה. בסוף הריצה, עבור FAM FL-DNA A ו- HEX IC, בחר עמודות, A, C, E ו- G.For FAM FL-DNA B ו- HEX IC, בחר עמודות, B, D, F ו- H.עבור הכמות ההתחלתית של הכמויות הסטנדרטיות, הגדר 10 ננוגרם לתגובה עבור בארות A1 ו- B1, שתי ננוגרם לתגובה עבור C1 ו- D1, הצבע ארבעה ננוגרם לתגובה עבור E1 ו- B1 ונקודת אפס שמונה ננוגרם לתגובה עבור G1 ו- H1. לאחר מכן, הן עבור ערוצי FAM והן עבור ערוצי HEX, הגדר ערכי פלואורסצנטיות סף ל- 150.בתיבה טבלת תוצאות, לחץ על אפשרויות עמודה ולאחר מכן, בחר הכל ולאחר מכן בסדר, כדי להשיג את התוצאות בשני הערוצים עם הערכים האחרונים שלהם Cq ודלתא R, המסופקים על-ידי תוכנת כלי qPCR בזמן אמת. Delta R מתאים לאחרונה לערך הפלואורסצנטיות מנורמל למחזור ההגברה האחרון. בתיבה טבלת תוצאות, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על הטבלה כדי לפתוח את תפריט ההקשר.לחץ על שלח ל- Excel כדי לייצא את הנתונים הגולמיים. ואז להעלות את קובץ Excel על תוכנת ניתוח ייעודי לחישוב אוטומטי של כמות FL-DNA. מתוך השילוב של iFOBT וערכי FL-DNA להעריך עבור כל חולה, הסיכון לסרטן המעי הגס.עקומות פלואורסצנטיות של מדגם חיובי מתאים מראות את אות הדגימה בערוץ HEX, שהוא הבקרה הפנימית, בטווח המקובל. אות חיובי הוא מעל הסף בערוץ FAM, אשר מראה את ההגברה של גנים היעד. עקומות פלואורסצנטיות של מדגם שלילי מתאים מראות את אות הדגימה בטווח המקובל בערוץ HEX.אות הבקרה השלילית נמצא מתחת לסף בערוץ השאלות הנפוצות. מצד שני, עקומות של מדגם לא מתאים להראות את אות המדגם שאינו בטווח המקובל בערוץ HEX. סביר להניח עקב עיכוב פוטנציאלי.לכן, מדגם זה חייב לחזור על עצמו, החל מן החילוץ. טבלת פלט ניתוח תוכנה מציגה נתונים הן עבור Mix A והן עבור Mix B במונחים של ריכוז FL-DNA עבור בקרות תגובה, דגימות קליניות ותוצאות בקרת איכות ריצה. לדגימה מספר ארבע אין תוצאות מכיוון שהיא לא עברה את בקרת האיכות.זה חייב לחזור ולתבוא מחדש. אנא היזהר כאשר השתמש מחדש את ה-DNA עבור ספייק בשליטה על העקומה הסטנדרטית. וכאשר מפיצים DNAs שונים לרצועות 8 בארות, כמו גם במהלך זיהוי מולקולרי בסעיף ניתוח התוצאות.שיטה זו חייבת להתבצע בשילוב עם בדיקת iFOBT כדי לאפשר הערכה טובה יותר של נגעים neoplastic המעי הירך, זה חייב להתבצע עם אותה מדגם צואה.

evaluation-colorectal-cancer-risk-prevalence-stool-dna-integrity

Research

JoVE Journal

Cancer Research

מחקר סרטן

ביטוי מופחת / נעדרים של Pms2 ו / או ERCC1 ב מאורות כולו הוא אירוע שכיח בטווח של 10 ס"מ בכל צד של אדנוקרצינומות הגס, סביר להניח בסיס פגם שדה עם הניוון גבוה להתפתחות סרטן. מחסור Ku86 או CcOI הרבה פחות תכופים פגמים אלה בשדה.

Pms2 לקוי, ERCC1, Ku86, CcOI ב פגמים שדה במהלך התקדמות סרטן המעי הגס

אנו תיאר הליך disaggregation של סרטן המעי (CRC) לייצר תאים בודדים קיימא, אשר נלכדים אז על microarrays נוגדן אישית הכרה אנטיגנים השטח (DotScan microarray CRC). תת אוכלוסיות של תאים חייב microarray ניתן צדודית על ידי ריבוב הקרינה באמצעות נוגדנים חד שבטיים מתוייגים עם צבעי ניאון.

סרטן המעי הגס Cell Surface חלבון פרופיל שימוש microarray ו ריבוב נוגדן פלואורסצנטי

סרטון זה מתאר פרוטוקול בידוד DNA מדגימות צואה של עכברים נושאי גידול במעי הגס. הדנ"א המופק מוגבר באמצעות PCR, והמוצר מנוקה עוד יותר באמצעות גישה מבוססת חרוזים מגנטיים. שיטה זו יכולה לשמש כדי לקבוע את ההשפעה של העשרה סביבתית על מיקרוביוטה המעי הגס ותמותת בעלי חיים.

בידוד דנ"א מיקרוביאלי בצואה: חקר השפעת העשרה סביבתית על מגוון המיקרוביום במודל הגידול המורין

אנו מדווחים על שיפורים משמעותיים במדידה הניתנת לשחזור של מוטציות בתאי גזע סומטיים במעי הגס לאחר חשיפה של עכברים לגורמים פוטנציאליים המזיקים ל-DNA.

כימות של מוטציות בתאי גזע המעי הגס

מוצעת שיטה לניתוח שלמות ה-DNA בחלק העל-טבעי נטול התאים של דגימות השתן. השיטה מתאימה לגילוי מוקדם של ממאירויות אורולוגיות והוכחה כמדויקת לאבחון מוקדם של סרטן שלפוחית השתן.

תא ללא DNA Integrity ניתוח בדגימות שתן

העשרה סביבתית (EE) היא סביבת מגורים בעלי חיים המשמש כדי לחשוף את המנגנונים העומדים בבסיס את החיבורים בין אורח חיים, מתח, מחלה. פרוטוקול זה מתאר הליך שבאמצעותו משתמש במודל עכבר של המעי הגס tumorigenesis, EE במיוחד להגדיר שינויים microbiota המגוון הביולוגי עשוי להשפיע התמותה בעלי חיים.

שיטה כדי להגדיר את ההשפעות של העשרה סביבתית על המגוון הביולוגי Microbiome המעי הגס במודל של עכברים המעי הגס גידול

תגובת שרשרת של פולימראז דיגיטלי (PCR) הוא כלי שימושי עבור גילוי רגישות גבוהה של נוקלאוטיד יחיד גרסאות ו- DNA עותק מספר גרסאות. . הנה, נדגים שיקולים מרכזיים למדידת גרסאות נדיר הגנום האנושי באמצעות PCR דיגיטלי עם התבנית שבב-ב--שפופרת.

פולימראז דיגיטלי Assay תגובת שרשרת עבור הווריאציה גנטי לחולה סדיר פוליפוזיס באמצעות התבנית שבב-ב--שפופרת

הציג כאן הוא פרוטוקול כדי לגלות את הגנים המובעות יתר שמירה על התאים הקבועים גזע הסרטן נגזר מתאי HT29 המעי הגס. RNAseq עם ביואינפורמטיקה זמין בוצע כדי לחקור והמסך רשתות ביטוי גנים להבהיר מנגנון פוטנציאלי מעורב בהישרדות של תאים סרטניים ממוקד.

גילוי של גנים הנהג ב המעי הגס HT29-נגזר סרטן גזע כמו Tumorspheres

אנו מציגים פרוטוקול גמיש ליצירת מטגנומים איכותיים של שבר בגודל ויראלי (וירומים) מדגימות צואה אנושיות. הפרוטוקול פותח במקור לווירומיקה בקרקע, וכאן יושם בהצלחה על דגימות צואה, מה שאפשר אפיון חזק של וירוספירת המעי האנושית.

מטגנומיקה של DNA ויראלי בדגימות צואה אנושית

אנו מתארים את הקמתם של גידולים המעי הגס אורטוטופיים באמצעות הזרקה של תאים סרטניים או אורגנואידים לתוך cecum של עכברים הבידוד הבאים של תאים סרטניים במחזור (CTCs) מן המודל הזה.

בידוד של תאים סרטניים במחזור מודל עכבר אורתופטי של סרטן המעי הגס

למדו שיטת זיהוי לא פולשנית לסרטן המעי הגס באמצעות ערכת FL-DNA. השיטה משפרת את דיוק הסקרים הקיימים ומסייעת לחזות את נוכחות הלסיות הנאופלסטיות ביעילות ובמהירות.

הערכה של סרטן המעי הגס סיכון ושכיחות על ידי שרפרף DNA זיהוי שלמות

גלה סרטונים נוספים