עיבוד של ברונמכתשיים נוזלים ומתאימים דם עבור מכתשיים מקרופאג ו CD4+ T-Cell Immunophenotyping קלדה ומאגר HIV הערכה

HIV הוא חשוך מרפא בשל התמדתו במאגרים הסלולר והאנטומי. שיטה זו מאפשרת הערכת מאגר HIV של תאים חיסוניים מבודדים מהריאות. טכניקה זו מאפשרת בידוד של תאי T ריאתיים ומאקרופאגים מכתש מנוזל BAL להערכה פנוטיפית או וירולוגית נוספת כמאגרים תאיים של HIV.

הבנת הביולוגיה של מקרופאגים מכתליים ותאי T חיוביים CD4 ותרומתם למאגר HIV יכול להוביל תובנות חשובות על האתגרים העומדים בפני תרופה HIV. הבידוד של מקרופאגים ראשוניים מ- BAL יכול להיות מיושם על תחומי מחקר שונים אחרים, כולל מחלות ריאות דלקתיות או זיהומיות כגון אסטמה ושחפת. לאחר קבלת נוזל BAL מחולה אנושי על פי פרוטוקולים סטנדרטיים, מערבולת הנוזל בצינור האיסוף המקורי לפני העברת המדגם לצינור 50 מיליליטר בתוך ארון biosafety.

אם הנוזל נראה מאוד עכור או מזוהם על ידי רקמה filamentous, לסנן את המדגם דרך מסנן רשת ניילון 70 מיקרומטר לתוך צינור חדש 50 מיליליטר. לאחר צנטריפוגה, להעביר את supernatant לצינור חדש 50 מיליליטר ולהשתמש קצה פיפטה כדי לשבור בעדינות את גלולה המכילה את כל תאי BAL. תוסיפו את גלולת הכדור במיליליטר אחד של מדיום RPMI 1640 והוסיפו מיליליטר אחד של העל-טבעי השמור של כל אחד מ-10 צינורות המיקרוצנטריפוגה של 1.5 מיליליטר.

הוסיפו 10 מיליליטר של העל-טבעי הנותר לצינורות חרוטיים של 15 מיליליטר והצבו את כל הדגימות העל-טבעיות באחסון של מינוס 80 מעלות צלזיוס. לדלל את ההשעיה תא גלולה ב 10 מיליליטר של מדיום עבור כל 25 מיליליטר של המדגם המקורי ולאסוף את התאים BAL על ידי צנטריפוגה. לאחר מכן לחץ מחדש את גלולה במיליליטר אחד של בינוני בתוספת 10% סרום בקר עוברי, או FBS, לספירה.

למיון תאים מונונוקלאריים שלמים של BAL ודם היקפי, הוסיפו חמש פעמים 10 לחמשת התאים לכל אחד משני צינורות פוליסטירן מעוגלים של חמישה מיליליטר לכל קבוצת משנה עבור פקדי הפיצוי הבלתי נגועים ומוכתמים בכדאיות והוסיפו את שאר דגימת קבוצת המשנה לצינור אחד של חמישה מיליליטר לדגימה. לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה ולתלות מחדש את כדורי הבקרה ב 100 microliters של PBS לכל צינור על קרח עד שהם משמשים. תן שימוש חוזר כדורי התאים למיון ב 250 microliters של אחד ב 20 דילול של חיץ חסימת קולטן Fc במשך שעה אחת בארבע מעלות צלזיוס כדי לחסום כל כריכה לא ספציפית.

בסוף הדגירה החוסמת, מוסיפים את קוקטייל הנוגדנים המתאים למשך שעה נוספת של דגירה בארבע מעלות צלזיוס. בסוף הדגירה העיקרית של הנוגדנים, הוסיפו מיליליטר אחד של PBS לכל צינור לצנטריפוגה והוסיפו את הכדורים ב-250 מיקרוליטרים של חיץ מיון על קרח המוגן מפני אור עד למיון. כדי להכין את בקרות הפיצוי, להוסיף שלוש טיפות כל אחד בחנוזי פיצוי קאפה אימונוגלובולין נגד עכבר וחרוזי פיצוי שליטה שלילית לכל מיליליטר של PBS לצינור microcentrifuge ולהעביר 100 microliters של פתרון חרוזים לכל מדגם לשמש לפיצוי.

מוסיפים מיקרוליטר אחד של כל נוגדן בקוקטייל לכל צינור נפרד המכיל חרוזים ומוסיפים מיקרוליטר אחד של כתם כדאיות לכל צינור בקרת פיצוי כתמי כדאיות. לאחר 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס מוגנות מפני אור, לשטוף את הדגימות עם מיליליטר אחד של PBS לצינור ולתלות מחדש את כדורי ב 250 microliters של PBS טרי לצינור. טען את דגימת הבקרה הלא-נגועה של התא BAL כולו על ציטרומטר הזרימה והגדר את מטריצת הפיצוי.

לאחר מכן לטעון את הצינור לדוגמה למיין את התאים תחת לחץ נמוך, gating כדי לא לכלול רעש, לכלול תאים חיים ו- CD45 חיובי, ולא לכלול את הכפילים. בתוך אוכלוסיית המיאלואידים הגדולה יותר, מיין את התאים הדו-חיוביים הכפולים CD206 ו- CD169 כמאקרופאגים מכתביים. בתוך אוכלוסיית הלימפוציטים הקטנה יותר, בודדו את התאים החיוביים ל-CD3 ומינו את האוכלוסיות החד-חיוביות CD4 ו-CD8.

כדי למיין את דגימת התא המונונוקלארי בדם ההיקפי, שער כדי לא לכלול את הרעש והכפילות ולכלול את התאים החיים CD45 חיובי כפי שהודגם. לאחר gating על CD3, שער CD3 שלילי, CD14 חיובי תאים למיון מונוציטים חיובי יחיד שער CD3 חיובי, CD4, ו CD8 חיובי תאים למיון שתי האוכלוסיות החיוביות יחיד. בעת ספירת מדגם BAL שלם, ניתן לדמיין סוגי תאים שונים, כולל מקרופאגים עגולים גדולים יותר ולימפוציטים עגולים קטנים יותר.

מקרופאגים הם סוג התא הנפוץ ביותר בנוזל BAL, המהווים כ -85% מהתאים בריאות שאינן מעשנות. תאים אלה מועשרים במעשנים עד כדי כך שהם נראים כמעט בלעדיים ונוטים להיות מוגדלים בכ -40% בהשוואה למאקרופאגים שנצפו אצל לא מעשנים. סמנים המשמשים למיון מקרופאגים מכתש מדגימות נוזל BAL נבחרו בהתבסס על פנוטיפים שתוארו בעבר של מקרופאגים מכתש, כגון קולטן mannose CD206 אשר קיים על תאים phagocytic ואת קולטן sialoadhesin CD169.

לאחר הבידוד שלהם, מקרופאגים מים וסוגי תאים אחרים יכולים לשמש immunophenotyping על ידי ציטומטריה זרימה, בדיקות תפקודיות אימונולוגיות, או כימות מאגר על ידי PCR רגיש במיוחד. טכניקה זו מאפשרת גישה למאקרופאגים טהורים מאוד של תושבי רקמות, אשר מבחינה היסטורית היו קשים להשגה, ומאפשרת בדיקה בלתי מושגת בעבר של אוכלוסיית תאי החיסון המשמעותית.