הערכה של מקונן אוניברסלי הפוכה תגובת שרשרת פולימראז לאיתור של Lyssaviruses

RT-PCR מקונן פותחה כדי לזהות את כל Lyssaviruses, כולל כל 16 ICTV שאושרו ושני מינים Lyssavirus הרומן. האימות של שיטה זו הוכח באמצעות מעל 9000 דגימות מוח בעלי חיים ב 10 שנים של אבחון כלבת קלינית ומעקב בסין. RT-PCR המקונן לא רק יכול לייצר תוצאה אמינה על דגימות רקמת המוח טרי, אלא גם על דגימות מושפלות.

ה ההצפה שיטה זו יכולה לשמש כדי להתבגר דגימות נוזל ביולוגי כגון נוזל השדרתי, רוק, שתן, ובכך שיטה זו יכולה להיות מיושמת לתוך אבחנות אולטימטום. על מנת למזער את זיהום נשיאת PCR, חשוב להכין פקדים שליליים וחיוביים חשוב מאוד לנקוט צעדים. לדוגמה, עבור כל מיצוי RNA צריך הכנה, PCR להגדיר, אלקטרופורזה ג'ל צריך להיות מופעל באזורים נפרדים פיזית.

מומלץ גם להשתמש בקלטות ספירלה בחילוץ RNA ותמלול הפוך על מנת למנוע זיהום כלבת לשרשרת הפפטיד. טיפול נכון כגון הכנת הסוכנים שלך על קרח, החלפת כפפות באופן קבוע, ושימוש בחומרים חופשיים ribonuclease ימנע את כניסתה של ריבונוקלאז ולמנוע השפלה של RNA. כדי להתחיל בהליך זה, לחלץ את RNA מכלבת חשד רקמה, ביופסיות העור, רוק, נוזל השדרתי או תרבות תאים נגועים RABV כמתואר בפרוטוקול הטקסט.

כאשר מוכן להמשיך, הסיר את reagents הדרושים מהמקפיא ולשמור אותם על קרח. הקפד להפשיר ולמערבולת כל רהגנט לפני השימוש. עבור שעתוק הפוך של RNA ויראלי cDNA להכין 12 מיקרו ליטרים של תערובת תגובה עבור כל מדגם על קרח צינור צנטריפוגה 1.5 מיליליטר כפי שמתואר בטבלה 1 של פרוטוקול הטקסט בחדר נקי.

כדי להסביר וריאציות pipetting, להכין נפח של תמהיל הורים לפחות גודל תגובה אחד גדול מהנדרשה, ולאחר מכן לחלק את תערובת התגובה לתוך צינורות PCR 0.2 מיליליטר. בתחנת עבודה של PCR בחדר תבניות, הוסף שמונה מיקרוליטרים של המדגם או אחד הפקדים לתערובת התגובות. השליטה החיובית היא RNA המופק מתרבות התאים הנגועים בזן קבוע-RABV CVS11, בעוד שהבקרה השלילית מכילה מים מזוקקים כפולים ללא Rnase.

מערבבים את התוכן של כל צינור על ידי מערבולת תחילה ולאחר מכן על ידי צנטריפוגה בקצרה. לאחר מכן, לטעון את צינורות התגובה לתוך תרמוסיקלר. הגדר והפעל את תוכנית הסינתזה cDNA כמתואר בפרוטוקול הטקסט.

ראשית, לאחזר את reagents הדרושים ולשמור אותם על קרח בחדר נקי עד מוכן לשימוש. כאשר מוכן, להפשיר ומערבולת את reagents. לאחר מכן, הכן 48 מיקרוליטרים של תערובת PCR בסיבוב הראשון עבור כל מדגם בצינור צנטריפוגה 1.5 מיליליטר כפי שמתואר בטבלה 2 של פרוטוקול הטקסט ולחלק את תערובת התגובה לצינורות PCR 0.2 מיליליטר.

בתחנת עבודה PCR בחדר תבנית, להוסיף מדגם שני microliter של cDNA לתערובת PCR הסיבוב הראשון. כלול שני מיקרוליטרים של CVS11 cDNA כבקרה חיובית, ושני מיקרוליטרים של מים מזוקקים כפולים כבקרה שלילית. לאחר מכן, העבר את הצינורות האטומים לתוך תרמוסיקלר PCR ומחזור באמצעות הפרמטרים המפורטים בטבלה 3 של פרוטוקול הטקסט.

כדי להתחיל, להכין 48 microliters של תערובת PCR בסיבוב השני עבור כל מדגם בצינור צנטריפוגה 1.5 מיליליטר כפי שמתואר בטבלה 4 של פרוטוקול הטקסט ולחלק את תערובת התגובה לתוך צינורות PCR 0.2 מיליליטר. הוסף שני מיקרוליטרים של מוצר PCR בסיבוב הראשון לתערובת PCR בסיבוב השני. כלול מים מזוקקים כפולים כפקד שלילי עבור סבב PCR זה.

לאחר מכן, בצע תרמוציליות PCR באמצעות הפרמטרים המפורטים בטבלה 3 של פרוטוקול הטקסט. ראשית, מוסיפים 1.5 גרם של אגרוז ל -100 מיליליטר של טריס אצטט EDTA ומחממים אותו במיקרוגל כדי להמיס אותו ביסודיות. לאחר מכן, מוסיפים אתידיום ברומיד בריכוז סופי של 0.01% יוצקים את הג'ל לתבנית ומשאירים אותו להתגבש בטמפרטורת הסביבה לפחות 30 דקות.

הכן את דגימות הטעינה על-ידי ערבוב חמישה מיקרוליטרים של כל מוצר PCR עם מיקרוליטר אחד של מאגר טעינה של 6x. בנפרד לטעון את הדגימות ואת סמן DNA מתאים לתוך הבאר ולהפעיל את הג'ל במשך כ 30 עד 45 דקות ב 120 וולט עד קו הצבע הוא כ 75 עד 80% במורד הג'ל. לאחר השלמת הריצה, כבה את החשמל ונתק את האלקטרודות ממקור הכוח.

לאחר מכן, להסיר בזהירות את הג'ל מתיבת הג'ל. השתמשו במכשיר תיעוד של ג'ל UV כדי לדמיין ולצלם את שברי הדנ"א. איפיין את PCR התמלול ההפוך המקונן כמפורט בפרוטוקול הטקסט.

התוצאות של RT-PCR מקונן נציג כדי לזהות 18 מינים Lyssavirus מוצג כאן. הפקדים החיוביים של PCR מציגים את הרצועה הצפויה ב-845 זוגות בסיסים בהגברה בסיבוב הראשון וב-371 זוגות בסיסים לסיבוב השני. אף להקה לא נראית עבור הפקדים השליליים.

כל 18 Lyssaviruses נראים לייצר את אותן שתי להקות כמו השליטה החיובית, המציין כי RT-PCR מקונן זיהה את כל 18 Lyssaviruses. בעוד 16 של plasmids יש הגברה יעילה בשני סיבובים של PCR, שניים מהם, וירוס Aravan ווירוס Ikoma, מוגברים רק בסיבוב הראשון או השני, בהתאמה. הרגישות של השיטה משתנה בזיהוי פלסמידים שונים של Lyssavirus, החל ערכים הנעים בין 2.24 ל 2, 240 מולקולות לכל microliter.

הבדלים אלה ניתן לייחס את אי התאמות בין פריימרים ותבניות בשל מגוון רצף ויראלי. השוואה של 9, 624 רקמות המוח של דגימות קליניות שנבדקו על ידי PCR מקונן לעומת אלה שנבדקו עם FAT מראה כי RT-PCR מקונן כרגישות של 100%ו ספציפיות של 99.97%בהתאם בין שתי השיטות הוא 99.07%10 מעבדות כלבת אחרות הוזמנו לבצע את הבדיקה כדי לאמת עוד יותר את RT-PCR המקונן. כל עשר המעבדות השיגו תוצאות RT-PCR מקוננות כי הם 100% בהתאם FAT, ללא תשלילים כוזבים או תוצאות חיוביות שגויות, המציין כי RT-PCR מקונן יש ספציפיות גבוהה רבייה.

RT-PCR מומלץ כעת על ידי OIE לשימוש בטכנולוגיות כלבת. ו- RT-PCR המקונן שלנו הוכח כסטנדרט הלאומי של טכנולוגיות כלבת בסין בשנת 2018.