Name: תבנית-המופעל חמצוני ושתיל עיכוב הצמיחה שתילה Assays באריידרופסיס thaliana (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-21T13:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 11 s
Description: למד שני שיטות לכימות תגובות חיסון ב-Arabidopsis thaliana: מדידת פרץ חמצוני חולף והערכת עיכוב צמיחת שתילים. השיטות מהירות, אמינות ומשתמשות בציוד מעבדה רגיל.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

העבודה במעבדה שלנו ממומנת באמצעות המועצה הטבעית של משאבי מחקר והנדסה של קנדה (NSERC) תוכנית דיסקברי, הקרן הקנדית לחדשנות ג'ון R. אוונס קרן מנהיג, ואוניברסיטת המלכה. KS והוא נתמך על ידי מלגות דו-מושביים אונטריו ובוגר NSERC קנדה מלגות לסטודנטים של מאסטר (CGS-M).

1. זיהוי פרץ של רוס בדיסקי העלה Arabidopsis בעקבות ההעצמה החיסונית
<ol><li>גידול ואחזקה של צמחים.<ol>
<li>כדי לסנכרן את הנביטה , הזרעים האראבאכופזיס באמצעות השעיית כ 50 זרעים ב 1 מ ל סטרילי 0.1% אגר [w/v] ולאחסן ב 4 ° צ' (ללא אור) עבור 3-4 ימים. הערה: Stratify שליטה ברקע סוג פראי (לדוגמה, Col-0) ו-גנוטיפים עם פלטי המערכת החיסונית גבוהה ונמוכה (לדוגמה, cpk28-1 ו -bak1-5, בהתאמה) כדי לשמש כפקדים פנימיים.</li>
		<li>לזרוע זרעים על הקרקע ולנבוט בתנאים הסטנדרטיים של יום קצר (22 ° c, 10 h אור, 150 mE/m2/s האור בעוצמה, ו 65-70% לחות יחסית).</li>
		<li>לאחר כ 7 ימים, השתמש מלקחיים להשתלות שתילים בודדים לסירים חדשים, מופרדים על ידי לפחות 4 ס מ כדי לאפשר פיתוח שושנת מלא. השתלת 6-12 שתילים לכל גנוטיפ וחזרה לתנאים הסטנדרטיים של היום הקצר. המים באופן קבוע צמחים להפרות (1 g/L של 20-20-20 דשן כל 2 שבועות).</li>
	</ol></li>
	<li>לאסוף דיסקי עלים ב 96-היטב צלחות עבור התאוששות לילה.<ol>
<li>ב 4-5 שבועות לאחר נביטה (איור 1A), להשתמש חדה 4 מ"מ ביופסיה באגרוף להסרת דיסק עלה אחד לכל צמח, הימנעות באמצע וריד ולהיות זהיר כדי להגביל את הפצע (איור 1a). מניחים דיסקים עלים בצלחת 96-ולומילומטר הכולל 100 μL של ddH2O עם הצד השני פונה כלפי מעלה כדי למנוע התייבשות22 (איור 1c). אם הערכת elicitors מרובים, להסיר את התקליטור 1 עלה מאותו עלה עבור כל טיפול באמצעות. הערה: עלים לדוגמה המורחבים לחלוטין, שלישי עד חמישי מראש הוורשה, ובערך בגודל ובגיל זהה להגבלת השונות. במידת האפשר, גזור דיסקי עלים במחצית באמצעות להב גילוח לפני התאוששות לילה, כמו זה מגדיל את פני השטח חשוף לקבלת פתרון23.</li>
		<li>לשחזר את הלילה בטמפרטורת החדר כדי למנוע את ההפרעה של ROS המיוצר על ידי פצועים במהלך אוסף דיסק עלה. לכסות את הצלחות עם מכסה כדי למנוע אידוי.</li>
	</ol></li>
	<li>בצע את הטיפול הפקת ולמדוד הייצור של ROS.<ol>
<li>התוכנית הקורא לוחית לפני הוספת פתרון התגובה, כמו זה יהיה להקטין את הזמן בין התפרצות הפריצה של רוס ואת המידות הראשונות שנרשמו. השתמש בתוכנה מסחרית המתאימה לקורא הצלחות. במקרה שלנו ( עיין בתוכן העניינים), לחץ על הגדרות ובחר את מחסנית LUM96 ואת סוג הקריאה הקינטית. לחץ על הקטגוריה ' קרא אזור ' וגרור כדי לבחור קבוצת משנה של בארות או את כל הלוח שייקרא. תחת הכרטיסייה PMT ו-אופטיקה , הגדר את זמן השילוב ל-1,000 Ms. תחת הכרטיסיה תזמון , הגדר את הזמן הקצוב הכולל ל-40-60 דקות ואת המרווח ל-2 דקות. </li>
		<li>מסירים מים מכל הבאר בעזרת פיפטה רב-ערוצית. הערה: אין לנקב דיסקים עלה, כי זה עלול לגרום ללחץ פצועים ולגרום ליותר משתנה ROS התפוקות.</li>
		<li>להכין פתרון התגובה המכילה 100 μM לומייול, 10 μg/mL HRP, ואת הריכוז הרצוי של מעורר (למשל: elf18 ב 1 ננומטר, 10 ננומטר, 100 nM, או 1,000 nM) ב-מעוקר ddH2O באמצעות 10 מ"ל של פתרון עבור 1 96-באר צלחת. הערה: התמוססות הפפטידים בצינורות בכריכה נמוכה2O בצינוריות מחייב לעשות מלאי של 10 מ"מ, הקפאת הבזק בנוזל N2, ואחסן ב-80 ° c. כאשר מוכן לשימוש, לדלל את המניות בבית השני סטרילי2O כדי ליצור 100 μm עבודה מלאי וחנות ב-20 ° c.</li>
		<li>השתמש בצינורות מרובי ערוצים כדי לוותר על 100 μL של תערובת התגובה לכל טוב, הוספת הפתרון לכל הדיסקים עלים של אותו טיפול באותו זמן22. כלול תגובת שליטה (לא מעורר) עבור כל גנוטיפ כדי להעריך את רמות ה-ROS הבזליים בהעדר מעורר. מיד למדוד את פליטת האור עבור כל אורכי גל בספקטרום גלוי באמצעות קורא מיקרופלייט. הערה: הכינו והחילו את פתרון התגובה תחת אור נמוך, כמו הלומירול ו-HRP הם ריאגנטים רגיש לאור. המשיכו לעקוב אחרי הקרח או ב-20 ° c, אלא אם כן בשימוש.</li>
		<li>מדידת פליטת האור עם 1,000 ms זמן האינטגרציה ב 2 דקות מרווחי מעל התקופה 40-60 דקות בקורא מיקרופלייט כדי ללכוד את פרץ חמצוני דינאמי (איור 1D). הערה: השתמש בזמן שילוב ארוך יותר כדי לשפר את רגישות התיקון11, תוך הקפדה על כל הדגימות בצלחת 96-באר ניתן למדוד בתוך מרווח אחד.</li>
	</ol></li>
	<li>. פרשנות נתונים<ol>
<li>עבור כל גנוטיפ, השתמש ביישום גיליון אלקטרוני כדי לחשב את ספירת הפוטון הממוצעת ואת השגיאה הסטנדרטית בכל נקודת זמן, ולהציג את הייצור של ROS כפונקציה של זמן באמצעות מזימת פיזור. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/59437/59437eq1.jpg"> כאשר t = בכל פעם שאתה מצביע
</li>
		<li>לחילופין, לסכם את ספירות פוטון עבור כל דיסק עלה ולהציג את הממוצע של ערכים אלה עבור כל גנוטיפ באמצעות גרף בר עם קווי שגיאה סטנדרטיים או תיבת והחלקה העלילה. <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/59437/59437eq2.jpg">
</li>
	</ol></li>
</ol>2. שתיל שיטת עיכוב הצמיחה
<ol><li>מעקר זרעים ומחזיר על לוחות מורראשיג ו Skoog (MS).<ol>
<li>הכן סטרילי חצי כוח (0.5 x) MS בינונית (2.16 g/L) המכיל 0.8% אגר [w/v]. שופכים מדיה ללוחות (90 x 15 מ"מ) במכסה זרימה למינארי.</li>
		<li>לחטא כ 100 זרעים בצינור מיקרוצנטריפוגה על ידי כביסה עם 1 מ ל של 70% אתנול עבור 2 דקות ולהסיר על ידי השאיפה. הוסף 1 מ ל של 40% אקונומיקה ו רוק בעדינות עבור 17 דקות בטמפרטורת החדר. להסיר אקונומיקה על ידי שאיפה ולשטוף שלוש פעמים 1 מ ל של מים סטריליים עבור 5 דקות. השהה מחדש 1 מ ל של סטרילי 0.1% אגר. הערה: לחלופין, השתמש בפרוטוקול העיקור בזרעי הגז כלור24.</li>
		<li>מחזירה כ-100 זרעים לכל גנוטיפ על לוחות MS אגר באמצעות פיפטה וחותם עם סרט מיקרונקבובית במכסה של זרם למינארי. הערה: הימנע הצבת זרעים בקרבת זה יהיה להפוך שתילים השתילים קשה מאוחר יותר.</li>
		<li>הזרעים stratify על ידי הצבת צלחות ב 4 ° צ' (אין אור) עבור 3-4 ימים כדי לסנכרן נביטה (איור 2A).</li>
	</ol>
</li>
	<li>השתלת שתילים לתוך 48-לוחיות הרישוי המכילות את הנוגדנים החיסונית.<ol>
<li>לאחר ריבוד, להעביר לוחות לאור בתנאי יום קצר (22 ° צ', 10 h אור, 150 mE/m2/s בעוצמת האור, ו 65-70% לחות יחסית) עבור 3-4 ימים כדי לאפשר נביטה.</li>
		<li>במכסה של זרם למינארי, הכינו מדים פפטיד (0 ננומטר, 1 ננומטר, 10 ננומטר, 100 nM, 1,000 nM) במדיה סטרילית של 0.5 x MS המכיל 1% סוכרוז [w/v], באמצעות 25 מ ל של MS עבור כל הצלחת 48-באר. להכין צלחות על ידי pipetting 500 μL של MS בינונית נוזלית או MS בינונית המכילה פפטידים לכל טוב. אם הוא זמין, השתמש בצינורות חוזרים להכנת הצלחות כדי לזרז את התהליך. הערה: עבור כל גנוטיפ, לגדל שתילים ב-MS ללא הגיוני לחשבון עבור כל הבדלים הטבועות בצמיחה נבט.</li>
		<li>שימוש מלקחיים סטרילי השתלת בזהירות אחד שתיל לכל טוב של אותו גודל וגיל, להבטיח כי אין נזק שתיל או שבירה לשורש וכי השורש הוא השקוע במדיה. עבור כל גנוטיפ, השתלה מינימום של 6-8 שתילים לתוך כל דילול פפטיד (איור 2B). הערה: שתילי להשתלות 4 ימים לאחר נביטה, כמו שורשים קצרים קל יותר לתמרן, ושתילים ישנים עשויים להניב תוצאות מיטביות פחות.</li>
		<li>איטום צלחות עם סרט מיקרונקבוביות ולחזור לאור בתנאים סטנדרטיים של יום קצר (22 ° c, 10 h אור, 150 mE/m2/s בעוצמת האור, ו 65-70% לחות יחסית). אפשר לשתילים לצמוח במשך 8-12 ימים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>קביעת אחוז עיכוב בגדילה.<ol>
<li>בזהירות להסיר שתילים מ 48-צלחות טוב ויבש על ידי מגבת נייר. שוקלים שתילים בקנה מידה אנליטי ומתעדים ערכים. אם הוא זמין, השתמש בקנה מידה אנליטי המצויד בפלט USB כדי להקליט ערכי משקל טריים בגיליון אלקטרוני. לפני שתלי שקילה, לצלם תמונה כדי להציג חזותית עיכוב גדילה (איור 2C).</li>
		<li>קביעת אחוז הגידול בעיכוב של שתילים מטופלים שטופלו לעומת שתילים גדל MS בלבד (איור 2D) כדלקמן: <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/59437/59437eq3.jpg">
</li>
		<li>התווה נתונים באמצעות גרף עמודות עם קווי שגיאה סטנדרטיים או שימוש בתיבה והחלקת מזימה כדי להציג בצורה טובה יותר את השונות הבין-ניסויית.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

נייר זה מתאר שתי שיטות לגבי התגובה החיסונית המופעל דפוס ב Arabidopsis, המציע גישות כמותיים להערכת התפוקה החיסונית ללא שימוש בציוד מיוחד. בשילוב, מופעלת תבנית ROS ו SGI ניתן להשתמש כדי להעריך את התגובות מוקדם ומאוחר לתפיסת חיידק, בהתאמה.
המגבלה העיקרית של שיטת פרץ חמצוני היא שינויים. מסיבות שאינן מובנות לחלוטין, RLUs מוחלטים לעתים קרובות שונים על ידי סדר גודל בין ניסויים. מכיוון שבין ההבדלים בניסוי הוא גבוה, מומלץ לכלול פקדי התייחסות פנימיים עם high (למשל, cpk28-1) נמוך (למשל<...

כדי לתפוס ולהגן מפני פתוגנים, הצמחים התפתחו ממברנה מאוגד הזיהוי דפוסים קולטנים (PRRs) המאתרות מולקולות מיקרוביאלית שימור מחוץ לתא המכונה תבניות מולקולריות הקשורות חיידק (MAMPs)1. הכריכה של mamps כדי קנצוני שלהם prrs יוזם חלבון קינאז-בתיווך איתות החיסונית וכתוצאה מכך עמידות מחלת ספקטרום רחב2. אחת התשובות המוקדם ביותר בעקבות הפעלת PRR הוא זרחון והפעלה של ממברנה בלתי נפרד פלזמה פרץ הומואוקסידאז log (RBOH) חלבונים אשר מזרז את הייצור של מינים חמצן תגובתי לחילוץ (ROS)3 , 4. ROS לשחק תפקיד חשוב בהקמת התנגדות למחלות, משחק הן כמו שליחים משניים להפיץ איתות החיסונית, כמו גם סוכנים מיקרוביאלית ישיר5. התצפית הראשונה של פרץ חמצוני מחוסן מפני החיסון המתואר באמצעות פקעות תפוחי אדמה של קורות חיים. רישירי אחרי Phytophthora ... הפקה ROS כבר הוערך מינים צמחים מספר שימוש בדיסקי העלה7, הבולם התרבויות התאים8, ו protoplasts6. המתואר כאן היא שיטה פשוטה עבור הפקת דפוס-הפקה של רוס מופעל דיסקים של העלים של arabidopsis thaliana (arabidopsis).
כתגובה לתפיסה mamp, מופעל חלבונים rboh לזרז את הייצור של רדיקלים סופראוקסיד (O2-), רדיקלים הידרוקסיל (• או), ו סינגתן חמצן (1o2) המומרים חמצן מימן (H2o 2) בחלל החילוץ9. H2O2 ניתן לכמת על-ידי הלומירול מבוססי כימובסנס בנוכחות של הסוכן האוקסיגון חזרת peroxidase (hrp)10. HRP מחמצן2o2 יצירת יון הידרוקסיד (הו-או) וגז חמצן (O2) אשר מגיבים עם הלומירול כדי לייצר ביניים לא יציבה המשחרר פוטון של אור10. פליטת פוטון ניתן לכמת כיחידות אור יחסית (rlus) באמצעות קורא מיקרופלייט או צמידה מסוגל לזהות לומינסנציה, אשר הפכו להיות חלקים סטנדרטיים של ציוד במעבדות המולקולרית ביותר. על ידי מדידת האור המיוצר על פני מרווח 40-60 דקות, פרץ חמצוני חולף ניתן לזהות כבר מוקדם ככל 2-5 דקות לאחר הטיפול הפקה, לשיא ב 10-20 דקות, וחזרה לרמות בסיס אחרי ~ 60 דקות11. האור המצטבר שהופק במהלך הזמן הזה יכול לשמש כמדד של כוח החיסון המתאים להפעלת חלבונים RBOH12. באופן נוח, שיטת הפעולה אינה דורשת ציוד מיוחד או הכנה לדוגמה מסורבלת.
לשיא זמן קצר לאחר זיהוי MAMP, פרץ חמצוני נחשב תגובה חיסונית מוקדמת, יחד עם הפעלה MAMP וייצור אתילן5. מאוחר יותר תגובות החיסון כוללות תכנות משנה, הסגר שיניים, ולהוריד את התצהיר2,5. חשיפה ממושכת למחברי הפרלמנט מפעילה באופן שוטף את האיתות החיסוני אנרגטית-יקר הנובע מעיכוב צמיחת הצמח, הרומז על סחר בין פיתוח לחסינות13. תבנית-המופעל שתיל הצמיחה עיכוב (sgi) משמש רבות כדי להעריך את הפלט החיסונית ב arabidopsis והיה אינטגרלי לזיהוי של מספר רכיבים מרכזיים של איתות החיסון כולל prrs14,15 ,בן 16 לכן, הנייר הזה בנוסף מציג את התשובה עבור מדגם מופעל SGI ב Arabidopsis, לפיו שתילים גדלים בצלחות רב-היטב המכילים מדיה רגילה או מדיה בתוספת מעורר החיסון עבור 8-12 ימים ולאחר מכן שקלת תוך שימוש בקנה מידה אנליטי.
כדי להדגים כיצד ROS ו sgi בחני ניתן להשתמש כדי לפקח על prr בתיווך איתות, שלושה גנוטיפים המייצגים פלטי החיסונית משתנים נבחרו: (1) סוג פראי arabidopsis ההצטרפות קולומביה (Col-0), (2) הדומיננטי-שלילי bak1-5 מוטציה שבה רב תפקודי prr שיתוף קולטן brassinosteroid 1-הקשורים קינאז 1 (BAK1) הוא שאינו פונקציונלי איתות החיסונית17,18, ו (3) המוטציה cpk28-1 , אשר חסרה את ה קינאז חלבון משועבד לחלבונים בחלבון (CPK28) ומציג תגובות מוגברת למערכת החיסונית19,20. ROS ו sgi בחני מוצגים בתגובה מלאכותית המיוצר elf18 פפטיד אפירופה של התארכות בקטריאלי פקטור Tu (EF-tu), מזוהה arabidopsis על ידי הקולטן prr EF-tu (efr)15. פרוטוקולים אלה ניתן להשתמש עם elicitors החיסונית אחרים כגון כותל חלבון בקטריאלי לתנועתיות14 או אנדוגני הצמח מקבל חלבונים (atpeps)16, עם זאת, יש לציין כי תגובתיות הצמח שונה בהתאם ל . מעורר21 יחד, ROS ו sgi בחני יכול לשמש הערכה מהירה וכמותית של תגובות prr מוקדם ומאוחר.

<table><tbody><tr><td>20-20-20 דשן</td><td>Plant Prod</td><td>10529</td><td>מערבבים 1 גרם/ליטר במים ומורחים על הצמחים כל שבועיים לצמיחה אופטימלית.</td></tr><tr><td>4 מ"מ Biopsy Punch</td><td>Medical Mart</td><td>232-33-34-P</td><td>ניתן להשתמש גם בסט בור שעם עם שטח פנים של 0.125 ס"מ^2.</td></tr><tr><td>צלחות סטריליות 48 בארות עם מכסה</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3548</td><td></td></tr><tr><td>סולם אנליטי עם טיוטה Sheid</td><td>VWR</td><td>VWR-225AC</td><td>כל סולם אנליטי סטנדרטי יכול לשמש לבדיקות התחלת צמיחה, עם זאת, פלט מחשב ישיר הוא אופטימלי.</td></tr><tr><td>BioHit mLine Mechanical 12 פיפטה רב-ערוצית (30-300 uL)</td><td>Sartorius</td><td>725240</td><td>ניתן להשתמש בכל פיפטה רב-ערוצית, כמו גם בצינור בודד במידת הצורך.</td></tr><tr><td>elf18 (Ac-SKEKFERTKPHVNVGTIG)</td><td>EZ Biolab</td><td>cp7211</td><td>מאחסן פפטיד מלאי של 10 מ"מ ב-80C בצינורות קשירת חלבון נמוכים. לאחר ההפשרה, אחסן מלאי עבודה של 100 uM בטמפרטורה של -20C.</td></tr><tr><td>מלקחיים</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>22-327379</td><td></td></tr><tr><td>חזרת פרוקסידאז</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P6782</td><td>מתמוססים במים טהורים. יש לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס והרחק מאור.</td></tr><tr><td>לומינול</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>A8511</td><td>מתמוסס ב-DMSO. יש לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס והרחק מאור.</td></tr><tr><td>Murisage and Skoog Basal Salts</td><td>Cedarlane Labs</td><td>MSP09-100LT</td><td>חנות ב-4C.</td></tr><tr><td>Soil</td><td>SunGrow Horticulture</td><td>Sunshine Mix #1</td><td>ניתן להשתמש גם בסוגי קרקע אחרים לגידול Arabidopsis. מערבבים עם מים בעת מילוי סירים.</td></tr><tr><td>SpectraMax Paradigm Multi Mode Microplate Reader עם מודול LUM</td><td>התקנים מולקולריים</td><td>חייבים לבקש הצעת מחיר</td><td>כל קורא צלחות המסוגל לזהות זוהר יכול לשמש לבדיקות אלה.</td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>S0389-1KG</td><td>יש לאחסן בטמפרטורת החדר.</td></tr><tr><td>צלחות פוליסטירן לבן 96 בארות</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>07-200-589</td><td></td></tr></tbody></table>

תבנית-המופעל חמצוני ושתיל עיכוב הצמיחה שתילה assays באריידרופסיס thaliana

Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana

צמחים התפתחו מערכת חיסונית חזקה לתפוס פתוגנים ולהגן מפני מחלה. נייר זה מתאר שתי מטרות שניתן להשתמש בהן כדי למדוד את כוחה של הפעלה חיסונית באריידאופזיס thaliana בעקבות הטיפול עם מולקולות מעורר. מוצג הראשון הוא שיטה ללכידת התפרצות חמצוני במהירות ודינמית, אשר ניתן לפקח באמצעות שיטת הלומירול מבוסס. השני הוא שיטה המתארת כיצד למדוד החיסונית המושרה עיכוב של צמיחת שתיל. פרוטוקולים אלה הם מהירים ואמינים, אינם דורשים הכשרה או ציוד מיוחדים, והם משמשים רבות כדי להבין את הבסיס הגנטי של חסינות הצמח.

מוטציה cpk28-119,25 ו bak1-517,18 צמחים שימשו כדי להפגין תוצאות צפויות עבור גנוטיפים עם תגובות החיסון גבוה ונמוך, בהתאמה, בפרץ חמצוני ו sgi בחני יחסית לבקרת רקע פראי (Col-0). כדי להעריך אפקטים תלויי-מינון, השתמשו בסדרת דילול פפטיד בעלת 10 מקפלים (1-1000 ננומטר) של elf18. כצפוי, cpk28-1 שורות הפונקציה היה מצטבר גבוה יותר (איור...

נייר זה מתאר שתי שיטות לכמת את התגובות ההגנה באריידאופזיס thaliana בעקבות החשיפה elicitors החיסונית: פרץ חמצוני חולף, ואת עיכוב צמיחת שתיל.

תבנית-המופעל חמצוני ושתיל עיכוב הצמיחה שתילה Assays באריידרופסיס thaliana

Plants have evolved a robust immune system to perceive pathogens and protect against disease. This paper describes two assays that can be used to measure ...

בדיקות אלה ניתן להשתמש כדי להעריך ולהשוות תפוקות החיסון של גנוטיפים צמחיים שונים. היתרון העיקרי של טכניקות אלה הוא שהם מהירים, אמינים, ולהשתמש בציוד מעבדה משותף. עבור עיכוב הצמיחה להגיד, שתילים באותו גודל וגיל צריך להיות מושתל לחלוטין כתם יבש לפני השקילה כדי להגביל את הווריאציה.לאחר נביטה של ארבעה עד חמישה שבועות, השתמש באגרוף ביופסיה חד של ארבעה מילימטרים כדי להסיר דיסק עלה אחד לכל צמח Arabidopsis, הימנעות midvein נזהר להגביל את הפציעה. לאסוף את הדיסקים לתוך בארות בודדות של צלחת לומינומטר 96-well שאינם שימוש המכיל 100 microliters של מים מזוקקים כפולים לתוך באר, צד adaxial למעלה, כדי למנוע ייעוד. אם מעריכים מספר מעוררים, מסירים דיסק עלה שני מאותו עלה עבור כל טיפול מעורר, ומכסים את הצלחת במכסה כדי לאפשר לדיסקים העלים להתאושש בן לילה בטמפרטורת החדר.למחרת בבוקר, הגדר את הפרמטרים של קורא המיקרופלסטיק לזמן אינטגרציה של 1,000 אלפיות שניה במרווחים של שתי דקות לאורך תקופה של 40 עד 60 דקות כדי ללכוד את פרץ החמצון הדינמי. לאחר מכן, השתמש פיפטה רב ערוצית להחליף את המים בכל באר עם 100 microliters של פתרון תגובה מוכן טרי, כולל שליטה, אין תגובה מעוררת עבור כל גנוטיפ כדי להעריך את רמות מיני חמצן התגובה הבסיסית בהיעדר עוררות. לאחר מכן, מיד למדוד את פליטת האור עבור כל אורכי הגל בספקטרום הנראה על קורא מיקרופלסטיק.בארבעה ימים לאחר הנביטה, לטעון כל באר של צלחת 48 באר עם 500 microliters של מדיום MS בתוספת דילול של פפטיד elicitor. לאחר מכן, השתמש במטלפים סטריליים כדי להשתיל בזהירות שישה עד שמונה שתילים באותו גודל, גיל וגנוטיפ לכל דילול פפטיד, תוך טיפול שום נזק השתיל או שבירה לשורש, כי השורש שקוע בינוני. כאשר כל השתילים כבר מצופים, לאטום את הצלחות עם סרט Micropore, ולמקם את הצמחים בתנאים סטנדרטיים של יום קצר במשך שמונה עד 12 ימים.כדי לקבוע את עיכוב הצמיחה באחוזים, צלם תמונה כדי לתעד חזותית את עיכוב הגדילה לפני שתסיר בזהירות את השתילים מכל באר. לאחר מכן, לטבול את השורשים על מגבת נייר להתייבש, ולשקול כל שתיל בקנה מידה אנליטי. בניסוי מייצג זה, צמחים מוטנטים עם איתות חיסוני היפראקטיבי הדגימו פרץ חמצוני מצטבר וממוצע גבוה יותר בהשוואה לצמחים ערבידופסיים מסוג בר, ואילו צמחים מוטנטים עם איתות חיסוני לקוי הציגו פרץ חמצוני מופחת בריכוזים שבין 10 ל -1,000 ננומולרים.ניתן להבחין גם בהבדלים הצפויים בעיכוב צמיחת השתילים בין כל הגנוטיפים הגדלים ב-100 וב-1,000 ריכוזי פפטיד ננו-מולאריים. כאשר גדל 1, 000 דילול פפטיד nanomolar, המוטנטים עם איתות חיסוני היפראקטיבי היו קטנים משמעותית מאשר צמחים מסוג בר גדל באותם תנאים, בעוד המוטנטים עם איתות חיסוני לקוי הציג עיכוב חלש של צמיחה יחסית לצמחים מסוג בר. שיטות אלה מספקות ראיות לתגובות חיסוניות מוקדמות ומאוחרות.מספר טכניקות אחרות, כולל מסיכי MAP kinase, ביטוי גנים הנגרמים על ידי פתוגן, ו assays זיהום, ניתן להשתמש כדי לתוות מסלולים אלה. טכניקות אלה שונו לשימוש במסכים בקנה מידה גדול, אשר זיהו בהצלחה חלבונים קולטן פתוגן וכמה רכיבי איתות אחרים.

pattern-triggered-oxidative-burst-seedling-growth-inhibition-assays

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

מוות מבוססי תא assay עבור PTI בצמחים ניקוטיאנה benthamiana מתואר.

Assay עבור תבנית הפתוגן-Associated מולקולרית (PAMP)-שהופעלו חסינות (PTI) בצמחים

בחיפוש יסודי ביולוגיה של התא היא להגדיר את המנגנונים העומדים בבסיס זהותה של האברונים המרכיבים התאים האיקריוטים. כאן אנו מציעים שיטה לזהות את הגנים האחראים על תקינות מורפולוגית ופונקציונלית של אברונים צמחים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ואת הדור הבא של כלים רצף.

פלואורסצנטי, מיקרוסקופ הקרנת ואת הדור הבא הרצף: כלים שימושיים לזיהוי גנים המעורבים אברון Integrity

Source: Liu, X., et al. Bacterial Leaf Infiltration Assay for Fine Characterization of Plant Defense Responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae Pathosystem. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates a method to assess the bacterial load in Arabidopsis thaliana leaves infected with Pseudomonas syringae. Leaf discs from infected leaves are homogenized, serially diluted, and plated onto nutrient-rich agar to promote bacterial colony formation. Colony counts are then used to...

Assessing Pseudomonas syringae Infection Load in Arabidopsis thaliana Leaves

סרטון זה מדגים בדיקה למדידת התפרצות חמצונית בעלי ארבידופסיס לאחר חיסול מערכת החיסון. דיסקיות עלים, חתוכות מעלי צמחים, מודגרות בפפטידים חיידקיים המתפקדים כתבניות מולקולריות הקשורות לחיידקים או MAMPs. עם גילוי MAMPs, תאים צמחיים לגרום לייצור של ROS חוץ-תאי, אשר מזוהה באמצעות מבחן chemiluminescence.

בדיקה לגילוי פרץ חמצוני בדיסקיות עלי ארבידופסיס בעת האצה חיסונית

סרטון זה מדגים את בדיקת עיכוב צמיחת השתיל בצמח Arabidopsis thaliana . ההשפעה של ריכוז מוגבר של פפטיד חיסוני מעורר על צמיחת שתילים נקבעת.

מדידת עיכוב של צמיחת שתילים על ידי מערכת החיסון

כימות צמיחת פתוגנים הוא כלי רב עוצמה לאפיון תגובות חיסוניות שונות של Arabidopsis thaliana (להלן: Arabidopsis). השיטה המתוארת כאן מציגה בדיקת חדירת מזרק אופטימלית לכימות Pseudomonas syringae pv. מקוליקולה גידול ES4326 בעלים בוגרים של Arabidopsis.

חיידקי עלה הסתננות Assay עבור אפיון פיין של תגובות הצמחים ביטחון באמצעות<em&gt; Thaliana-Pseudomonas ארבידופסיס syringae</em&gt; Pathosystem

מטרת המחקר הייתה לקבוע את ההשפעות של אקונומיקה, כלור גז עיקור על נביטת הזרעים של אחרים טווח של תודרנית גדל על מדיה סטרילי. עיקור ממוטבת פרוטוקולים פותחו כדי למנוע את התפתחותם של חיידקים מזהמים תוך מתן זרע משביע רצון הישרדות.

שיטה סטנדרטית עבור תפוקה גבוהה עיקור של תודרנית זרעים

פרוטוקול תפוקה גבוהה לעיקור פני השטח של זרעי Arabidopsisthaliana (Arabidopsis) מסופק, אופטימיזציה של שלבי הטיפול בנוזל עם מכשיר יניקה פשוט שנבנה עם משאבת ואקום. מאות דגימות זרעים יכולות להיות מעוקרות על פני השטח ביום אחד.

שיטה חזקה וגמישה מאוד לעיקור פני השטח של זרעי ערבידופסיס

במאמר זה אנו מתארים כלי מתקדם המיועד לניטור ביוסינתזה של כלורופיל בשלבים המוקדמים של דה-אטיולציה של שתילי ארבידופסיס . המתודולוגיה החדשנית מספקת דימות פלואורסצנטי כלורופיל לא פולשני בזמן אמת ברזולוציה מרחבית וטמפורלית גבוהה.

בדיקה לא פולשנית לביוסינתזה של כלורופיל קביעת קינטיקה בשלבים מוקדמים של דה-אטיולציה של ארבידופסיס

כאן, אנו מציגים שיטה פשוטה לתצפית ישירה ומדידה אוטומטית של תגובות סטומאטליות לפלישת חיידקים ב - Arabidopsis thaliana. שיטה זו ממנפת מכשיר הדמיה סטומטלי נייד, יחד עם צינור ניתוח תמונה המיועד לתמונות עלים שצולמו על ידי המכשיר.

תצפית ישירה ומדידה אוטומטית של תגובות סטומאטליות למזרקי Pseudomonas PV . עגבניה DC3000 ב Arabidopsis thaliana

פרוטוקול זה מתאר גישה בעלת תפוקה גבוהה להערכת דליפת יוני צמחים, פעילות פרוקסידאז וייצור קלוז באותה דגימה.

הערכת תגובות עלים למטבוליטים משניים מיקרוביאליים באמצעות פורמט בעל תפוקה גבוהה

למד שני שיטות לכימות תגובות חיסון ב-Arabidopsis thaliana: מדידת פרץ חמצוני חולף והערכת עיכוב צמיחת שתילים. השיטות מהירות, אמינות ומשתמשות בציוד מעבדה רגיל.

תבנית-המופעל חמצוני ושתיל עיכוב הצמיחה שתילה Assays באריידרופסיס thaliana

גלה סרטונים נוספים