שיפור העפילו של תא גזע הנגרם לידי אדם-קרדיוציטים באמצעות עיכוב חולף של פעילות Rho קינאז

הנתונים שלנו מראים כי עיכוב חולף של פעילות Rho-kinase משפר הידבקות, הישרדות, וחריטה של cardiomyocytes נגזר hiPSC לאחר שהושתל לתוך לבבות בעלי חיים אוטם. אנו מספקים שיטה פשוטה, בעלות נמוכה, תוך יעילה מאוד להגברת חריטה של קרדיומיוציטים המושתלים שמקורם ב- hiPSC בלבבות בעלי החיים הפצועים. כמו טכניקה זו יכולה לשפר את שיעורי חריטה התא בבטחה וביעילות אוטם לב חריף ואי ספיקת לב, זה תורם לשיפורים וכתוצאה מכך בתפקוד הלב, כלי דם, אפופטוזיס.

למרות שבדקנו את הפרוטוקולים שלנו רק ב- hiPSCs, ניתן ליישם שיטות אלה על סוגים אחרים של תאים, כגון תאי גזע עובריים, תאי גזע mesenchymal, וכו '. המינון ומשך הטיפול Y-27632 הוא קריטי. ההדגמה החזותית יכולה להדגים בפירוט רב את כל השלבים העיקריים בפרוטוקול, וזה מועיל עבור מישהו שמעולם לא ביצע טכניקה זו לפני.

ביום 21 לאחר בידול hiPSC-CM, שאפו את המדיום ושטפו את התאים עם PBS סטרילי פעם אחת. דגירה התאים עם 0.5 מיליליטר של אנזימי דיסוציאציה התא ל הבאר ב 37 מעלות צלזיוס במשך חמש עד שבע דקות. לאחר זמן הדגירה, שוב ושוב pipette ההשעיה התא באמצעות פיפטה מיליליטר אחד על מנת לנתק ביסודיות את התאים.

לאחר מכן, מוסיפים מיליליטר אחד של נטרול פתרון לכל באר, אוספים את תערובת התאים בצינור צנטריפוגה 15 מיליליטר, וצנטריפוגה ב 200 פעמים g במשך שלוש דקות. לאחר הצנטריפוגה, השלך את העל-טבעי והתן מחדש את התאים בתת-הפתרון המנטרל. לאחר מכן, לשתול מחדש את התאים על מצופה ג'לטין, שש בארות צלחות בצפיפות של שני מיליון תאים לגם.

לאחר 24 עד 48 שעות, החלף את מדיום התרבות במדיום הטיהור במשך שלושה עד חמישה ימים. לפני ההשתלה, תרבות התאים בקבוצת הטיפול במשך 12 שעות ב RB פלוס בינוני בתוספת 10 מיקרומולרי Y-27632. באופן דומה, לבצע טיפול verapamil על התאים במדיום RB פלוס עם micromole אחד של verapamil במשך 12 שעות.

לאחר הטיפול, לשטוף את hiPSC-CMs עם PBS פעם אחת, ולהדקר את התאים עם 0.5 microliters של אנזימי דיסוציאציה התא ל הבאר לכל היותר שתי דקות. שוב ושוב pipette ההשעיה התא באמצעות פיפטה מיליליטר אחד כדי לנתק ביסודיות את התאים. לאחר מכן, לנטרל את התאים עם פתרון נטרול, לאסוף את תערובת התא בצינור צנטריפוגה 15 מיליליטר, צנטריפוגה ב 200 פעמים g במשך שלוש דקות.

לאחר צנטריפוגה, תן שימוש חוזר בתאים ב- PBS בריכוז של 0.1 מיליון תאים לכל חמישה מיקרוליטרים כהכנה להזרקה. מיד לאחר אינדוקציה אוטם שריר הלב, להזריק חמישה microliters של hiPSC-CMs שליטה, Y-27632-pretreated hiPSC-CMs, hiPSC-CMs מטופלים verapamil, או נפח שווה של PBS לתוך שריר הלב של העכבר בכל אתר, אחד באזור infarct ושניים באזורים סביב infarct. 12 שעות לפני ביצוע זיהוי סידן ארעי והתכווצות, להוסיף 10 מיקרומולר Y-27632, 100-nanomolar RA, verapamil מיקרומולר אחד, או נפח שווה של PBS לתוך מדיום התרבות של hiPSC-CMs.

לאחר מכן, להשליך את המדיום, ולשטוף את הצלחת עם PBS פעם אחת. שנה את המדיום ל- DMEM נטול פניול נטול אדום המכיל 0.02 משקל לנפח של פוליול פעילי שטח, מחוון סידן חמישה מיקרומולרים, ואת Y-27632 המתאים, RA, verapamil, או נפח שווה של PBS, ולטוג את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. לאחר הדגירה, השליכו את העל-טבעי, שטפו את התאים עם ה-DMEM נטול הצבע שלוש פעמים, ותנו לבינונה הבינונית לנוח במשך 30 דקות כדי לבטל את האסטרוזציה של צבע המיפוי.

מניחים את הכיסויים עם זרעי התא בתא אמבטיה פתוח, ומכניסים את התא למערכת מיקרו-אינקובציה הציידה ל-37 מעלות צלזיוס עם בקר טמפרטורה אוטומטי. לנטרל אותו עם הפתרון של טירוד, ולהוסיף ברציפות RI, RA, או PBS לפתרון תדלוק. השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך וראש סריקת לייזר כדי להקליט סידן ארעי ספונטני על ידי שימוש בסריקת קו x-t.

רשום את ההתכווצות הספונטנית של hiPSC-CMs באמצעות פונקציונליות ניגודיות ההפרעה המדרגית של המיקרוסקופ הקונפוקלי. שיעור ההישרדות של התאים המושתלים אושר על ידי פעילות לוציפראז מוגברת. טרופונין לב אנושי מוגבר T וביטוי אנטיגן גרעיני אנושי הראו כי טיפול מקדים Y-27632 יכול לשפר באופן משמעותי את קצב חריטה התא.

תאים מטופלים Y-27632 הציגו מבנה ציטוסקלטלי גדול ומוגדר יותר בצורת מוט. כמו כן, Y-27632 טיפול מקדים ירד תאים חיוביים TUNEL, המציין את אפופטוזיס hiPSC-CM מושתל מופחת ב vivo. כתם מערבי הציע כי טיפול מקדים Y-27632 הגביר את הביטוי של בטא-1 ו- N-cadherin של Y-27632 והפחית את הביטוי של שרשרת אור phospho-myosin 2.

שינוי זה היה מנורמל 72 שעות לאחר נסיגת Y-27632. ניסויים בהצמדת תא HL-1 בעכבר במבחנה הצביעו על כך שקדם-טיפול Y-27632 הגדיל באופן משמעותי את הדבקות hiPSC-CM ביחס ל- HL-1. טיפול מקדים Y-27632 הפחית את הכוח החוזי, את שיא הסידן הפלואורסצנטי חולף, ואת משך הסידן חולף.

Y-27632 טיפול מקדים מוסדר התכווצות cardiomyocyte על ידי צמצום משמעותי את הביטוי של cTnI ו cTnT. בדומה ל- Y-27632, טיפול מקדים verapamil גדל פעילות luciferase ומספרים של תאים חיוביים כפולים hcTnT / HNA. הצעד החשוב ביותר הוא לתאי תרבות בקבוצת הטיפול במשך 12 שעות ב Rb פלוס בינוני בתוספת 10 מיקרומולרי Y-27632.

בהתבסס על שיטה זו, שחרור איטי של Y-27632 כדי להגדיל עוד יותר את קצב חריטה התא היא אסטרטגיה מבטיחה. טכניקה זו סוללת את הדרך לחוקרים לחקור את הפיזיולוגיה והתפקוד של hiPSC של CMs ב vivo. המולקולה הקטנה CHIR99021 המשמשת להתברות קרדיומיוציטים מסוכנת, מה שעלול לגרום לגירוי נשימתי.

נא לא צריכת או לשאוף בשום דרך.