הערכה של ריבוי סינפטית באמצעות תאים כל תיקון-קלאמפ אלקטרופיזיולוגיה
April 23rd, 2019
כאן, אנו מציגים פרוטוקול להערכת תפקודית הריבוי סינפטית באמצעות תיקון שלם-תא קלאמפ אלקטרופיזיולוגיה פרוסות המוח חריפה.
במוח, זוג נוירונים יוצרים לעתים קרובות מגעים סינפטיים מרובים, הנקראים ריבוי סינפטי. עם זאת, בדיקה מדויקת של ריבוי סינפטי דורשת ניסויים מאתגרים מבחינה טכנית. פרוטוקול זה מתאר שיטה פשוטה להערכה ברוטו של ריבוי סינפטי באמצעות אלקטרופיזיולוגיה של מהדק טלאי שלם.
שיטה זו יכולה להיות מיושמת על כל מין ואזור המוח כדי לחקור ריבוי סינפטי. שיטה זו דורשת מיומנויות בסיסיות באלקטרופיזיולוגיה של מהדק-טלאי שלם. השגת הקלטות באיכות גבוהה עם עמידות נמוכה ויציבה לגישה היא קריטית לפרשנות המדויקת של הנתונים.
כדי להשיג תצורה של תא שלם, מקם את פיפיט ההקלטה ממש מעל הפרוסה והיסט זרם פיפטה במצב מהדק המתח. החל לחץ חיובי קל על פיפטה, ולנעול את stopcock. לאחר מכן, בחר תא בריא עם קרום שלם, והתקרב לרקמה עם פיפטה.
הלחץ החיובי אמור לגרום להפרעה קלה ברקמה. לאט לאט לקרב את פיפטה לתא בתנועה אלכסונית עד גומה קטנה נוצרת על פני התא. לאחר מכן, שחרר את נעילת הלחץ החיובית.
התא יתחיל ליצור חותם, וההתנגדות תגדל מעל ג'יגה-אוהם אחד. במלקחיים במתח, החזק את התא במינוס 68 מילי-וולט. לאחר מכן, מעט למשוך את פיפטה מן התא באלכסון כדי להסיר לחץ עודף.
לפצות על קיבוליות פיפטה מהירה ואיטית. החל יניקה קצרה דרך הצינור המחובר למחזיק פיפטה כדי לפרוץ את התא ולקבל תצורה של תא שלם. לאחר מכן, עבור למצב תא בחלון בדיקת הממברנה בתוכנה לאילופיזיולוגיה של איסוף וניתוח נתונים.
שמור על הטמפרטורה של אמבט ההקלטה ב 27 עד 30 מעלות צלזיוס ואת קצב הזרימה ב 1.5 עד שני מיליליטר לדקה לניסויים הבאים. בסינפסה ריבוי, פוטנציאל פעולה מסנכרן שחרור נוירוטרנסמיטר ומייצר זרם פוסט-סינפטי גדול יותר. חסימת פוטנציאל פעולה ושחרור כלי רכב תלוי סידן עם TTX ו קדמיום מונע את הסיכום הנוכחי postsynaptic ומפחית את משרעת.
כאשר אין ריבוי, חסימת פוטנציאל הפעולה לא תשנה את משרעת. בניסוי אחד, כדי להעריך ריבוי, להחזיק את התא במינוס 68 מיליבולטים תוך זלוף זה עם aCSF סידן נמוך. הקלט את ה- EPSCs הספונטניים למשך חמש דקות לפחות כדי להבטיח תוכנית בסיסית יציבה.
לאחר מכן, להוסיף 30 micromolars 4-AP ל- aCSF כדי להגדיל את הפעולה אירועים תלויים פוטנציאליים, ולהקליט EPSCs ספונטניים לפחות 10 דקות כדי להשיג את אפקט התרופה המלאה. לאחר מכן, הוסיפו 0.5 מיקרומולרים TTX ו-10 מיקרומולרים קדמיום ל-aCSF עם 4-AP, והקליטו את ה-EPSCs הזעירים למשך 10 דקות לפחות. לניתוח לא מקוון, השתמש בדקה האחרונה של תוכנית הבסיס מיד לפני היישום של 4-AP, בדקה העשירית של יישום 4-AP ובדקה העשירית של יישום TTX.
בניסוי זה, סידן חוץ-תאי מוחלף בסטרונציום כדי לבטל את ההינכרון של שחרור וריצים סינפטיים. לכן, אם קיים ריבוי, זה אמור להקטין את משרעת של זרמים postsynaptic. בניסוי 2, להקליט EPSCs ספונטניים לפחות חמש דקות תוך התלקחות התא עם aCSF סידן נורמלי.
כדי לבטל את ניתוק שחרור וקסיק, להתחיל לתפור את התא עם aCSF סטרונציום, ולהקליט EPSCs ספונטניים. לניתוח לא מקוון, כדי לקבוע אם משרעת גדולה EPSCs ספונטניים נובעים שחרור סינכרוני של וקסיקים, להשוות את הדקה האחרונה של הבסיס לדקה העשירית של יישום aCSF סטרונציום. ריבוי יכול לכלול שחרור רב-מערכתי, מה שגורם לריכוז נוירוטרנסמיטר גבוה יותר בסוע הסינפטי.
תוספת של גאמא-DGG, אנטגוניסט קולטן אמפא בזיקה נמוכה, מובילה לעיכוב פחות יעיל של רב-קוואנטי גדול יותר בהשוואה לזרמים פוסט-אנטינפטיים קטנים יותר. ללא הפצה רב-מערכתית, גאמא-DGG תהיה יעילה באותה מידה בזרמים פוסט-סינפטיים גדולים וקטנים יותר. בניסוי 3, כדי לבדוק שחרור רב-מערכתי, הקלט EPSCs ספונטניים ב- aCSF עם סידן נמוך למשך חמש דקות לפחות.
הוסף 30 מיקרומולרים 4-AP ל- aCSF באמצעות מערכת החיסון. הקלט את ה- EPSCs הספונטניים למשך 10 דקות לפחות. לאחר מכן, הוסיפו 200 מיקרומולרים גאמא-DGG ל-ACSF עם 4-AP, והקליטו את ה-EPSCs הספונטניים למשך 10 דקות לפחות.
כניסוי בקרה בתא נפרד, חזור על ההליכים, אך החל ריכוז נמוך של DNQX במקום גאמא-DGG. לניתוח לא מקוון, לנתח את הרגע האחרון של כל יישום סמים. פרצי פעילות סינפטית יכולים להגדיל באופן חולף את פוטנציאל הפעולה הספונטני ולשחרר את ההסתברות של afferents מגורה.
אם נוירונים מפגינים ריבוי, העלייה בפוטנציאל הפעולה אמורה לגרום לעלייה ארעית משרעת של זרמים פוסט-סינפטיים. בניסוי 4, להקליט EPSCs ספונטניים בסידן aCSF נורמלי. כדי להגביר את פוטנציאל הפעולה, לעורר את afferents באמצעות אלקטרודה זכוכית מונופולארי מלא aCSF בקצב של 20 הרץ במשך שתי שניות, ולחזור 10 פעמים עם מרווח בין פרץ של 20 שניות.
לניתוח, השתמש ב- EPSCs ספונטניים של 5,000 אלפיות שניה לפני הגירוי הראשון כבסיס והשווה ל- EPSCs הספונטניים של 10 עד 300 אלפיות השניה לאחר הגירוי הסופי. לאחר מכן, לקחת את משרעת הממוצע ושינוי תדירות מעל 10 ניסויים. נתח EPSCs ספונטניים ו- EPSCs זעירים באמצעות תוכנית המזהה ומנתחת זרמים סינפטיים.
השתמש בפרמטרי הזיהוי המוצעים ובפונקציית ניתוח ללא הפסקה לזיהוי EPSCs המתווים על-ידי קולטן אמפא. סרוק באופן ידני כל הקלטה כדי לוודא שהתוכנית מזהה במדויק כל אירוע. יצא את נתוני האירוע על-ידי העתקתם ללוח והדבק אותם בתוכנת ניהול נתונים.
לאחר מכן, לחשב את התדירות הממוצעת משרעת עבור כל טיפול תרופתי, ולבצע את הניתוחים הסטטיסטיים הרלוונטיים. בדוגמה המוצגת כאן, 4-AP מגביר הן את משרעת והן את התדירות של EPSCs ספונטניים. היישום הבא של TTX ו קדמיום מקטין הן את משרעת ותדירות.
הנה ההפצה של משרעת EPSC ספונטנית מההקלטה. בנוירונים ההיפותלמיים שנבדקו כאן, משרעת ותדירות של תנאי הבסיס ו- TTX זהים, מה שמרמז על כך שה- EPSCs הספונטניים הבסיסיים מכילים מעט מאוד EPSCs תלויי פוטנציאל פעולה. בהתאם לכך, ניסויים עוקבים יכולים להשוות את ההפרש בין קו הבסיס ל- 4-AP כדי למדוד ריבוי.
כוחו של שידור סינפטי יכול להיות מוגבר באופן חולף על ידי התפרצויות של פעילות סינפטית. כדי לחקור ריבוי בתנאים פיזיולוגיים יותר, גירוי אדיש יכול לשמש כדי להגדיל את פוטנציאל הפעולה ירי והסתברות שחרור. להלן הסיכומים של תדירות EPSC ספונטנית ושינויים משרעת בעקבות גירוי סינפטי.
הקלטות יציבות חיוניות לפרשנות מדויקת של הנתונים. תאר את הנתונים אם ההתנגדות לגישה משתנה ביותר מ- 20% במהלך ההקלטה, מכיוון ש הדבר עלול לבלבל את הניתוח. פרוטוקול זה מציע דרך פשוטה להעריך ריבוי סינפטי, שהוא גורם מפתח ביעילות הסינפטית ובפלסטיות שלה בתנאים פיזיולוגיים ופתופיזיולוגיים שונים.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה כללית
מחקר זה מציג פרוטוקול להערכת ריבוי סינפטי פונקציונלי בנוירונים באמצעות אלקטרופיזיולוגיה של פאץ' קלמפ בתא שלם בפרוסות מוח חדות. הגישה מאפשרת לחוקרים להעריך את רבוי הסינפסות על פני מינים שונים ואזורי מוח, תוך הדגשת החשיבות בהשגת הקלטות באיכות גבוהה.
מרכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- נוירומדע
- אלקטרופיזיולוגיה
- מנגנונים סינפטיים
רקע
- הבנת רבוי סינפטי היא חיונית לפיענוח התקשורת הנוירונית.
- ניסויים קודמים הדגישו את המורכבות של חקר מגעים סינפטיים.
- יש צורך בשיטה אמינה להערכה גסה של רבוי סינפטי במודלים שונים.
- הפרוטוקול משתמש בטכניקות פאץ' קלמפ בתא שלם כדי לספק תובנה לגבי הדינמיקה הסינפטית.
מטרת המחקר
- לפתח פרוטוקול פשוט להערכת רבוי סינפטי.
- להקל על הבנת מנגנוני שחרור נוירוטרנסמיטר.
- לספק שיטה הניתנת להתאמה לאזורי מוח ומין שונים.
שיטות ששימשו
- אלקטרופיזיולוגיה של פאץ' קלמפ בתא שלם בפרוסות מוח חדות.
- המודל כולל זוגות נוירונים בין אזורי מוח שונים.
- הניסויים כוללים חסימת פוטנציאלי פעולה ושחרור וסיקולרי תלוי סידן כדי להעריך את הריבוי.
- הליכים קריטיים כוללים שמירה על עמידות גישה יציבה ושליטה בטמפרטורה במהלך ההקלטות.
- ניתוח הנתונים כולל השוואת סטטיסטית של זרמים סינפטיים פוסט-סינפטיים מעוררים (EPSCs) בתנאים משתנים.
תוצאות עיקריות
- זיהוי שיטות להערכת רבוי סינפטי דרך שינויים בגודל ה-EPSC.
- הוכחה כי הפרעה בשחרור וסיקולרי משנה את תגובות הזרם הפוסט-סינפטי, המאשרת את רבוי הסינפסות.
- טיפול בהשלכות השחרור המווסיקולרי על היעילות הסינפטית וריכוז הנוירוטרנסמיטר.
- אימות הפרוטוקול בתנאים ניסיוניים שונים, המספק נתונים חזקים על הדינמיקה הסינפטית.
מסקנות
- המחקר מבסס פרוטוקול אמין להערכת רבוי סינפטי בזוגות נוירונים.
- הממצאים משפרים את ההבנה של התמרה סינפטית ומנגנוניה הבסיסיים.
- שיטה זו יכולה לשמש בהקשרים נוירוביולוגיים שונים לחקר התנהגות פלסטיות סינפטית.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Understanding synaptic multiplicity provides critical insight into the functional organization of neuronal circuits, which is essential for target validation in neuropsychiatric drug discovery. This electrophysiology-based method enables mechanistic de-risking by quantifying synaptic efficacy and plasticity under physiological conditions, supporting predictive confidence in early-stage target engagement. The approach aids in evaluating how pharmacological or environmental interventions alter synaptic connectivity, informing portfolio decisions in CNS therapeutic development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of synaptic transmission mechanisms by estimating functional multiplicity of excitatory inputs onto postsynaptic neurons.
- Operational Value: Provides a quantitative electrophysiological readout to assess target-mediated changes in synaptic efficacy.
- Predictive Value: Supports biological de-risking by linking molecular targets to measurable changes in synaptic strength and release probability.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Establishes a standardized whole-cell patch-clamp protocol for measuring spontaneous and miniature EPSCs as functional synaptic outputs.
- Reproducibility: Requires stable access resistance and controlled perfusion conditions to ensure reliable amplitude and frequency comparisons across drug treatments.
- Scalability: Adaptable to various brain regions and species, enabling cross-model validation of synaptic phenotypes in discovery workflows.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects in vitro synaptic measurements to in vivo behavioral or pharmacological interventions affecting synaptic organization.
- Mechanistic De-risking: Differentiates action potential-dependent from independent release, clarifying presynaptic mechanisms of drug action.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by quantifying how targets influence synaptic multiplicity and neurotransmitter release dynamics.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, supporting hypothesis testing in target validation and enabling assay development for screening synaptic modulators prior to lead identification.
- Discovery Biology: Facilitates pathway clarification by measuring changes in EPSC amplitude and frequency in response to pharmacological perturbations.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible electrophysiological outputs suitable for assessing compound effects on synaptic transmission.
- Analytics: Generates amplitude and frequency distributions of sEPSCs and mEPSCs, enabling statistical comparison of synaptic activity under baseline and drug conditions.
- Translational Research: Supports continuity to preclinical models by linking synaptic multiplicity changes to behavioral or environmental manipulations.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable electrophysiological capability for evaluating synaptic function across multiple CNS targets and disease areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides mechanistic insight into synaptic efficacy, reducing ambiguity in target-mediated effects on neuronal communication.
- Operational Value: Delivers standardized, quantifiable electrophysiological measurements that enhance reproducibility across laboratories.
- Strategic Value: Improves target selection confidence by linking molecular interventions to functional synaptic outputs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on their effects on synaptic multiplicity and release probability.
Implementation Considerations
- Requires expertise in whole-cell patch-clamp electrophysiology and acute brain slice preparation.
- Dependent on stable access resistance (<20% change) and precise temperature control (27–30°C) for valid data interpretation.
- Necessitates perfusion systems for sequential drug application (e.g., 4-AP, TTX, cadmium, gamma-DGG) and electrophysiology software for event detection.
- Must account for variability in synaptic activity due to burst firing or changes in release probability during afferent stimulation.
- Limited to relative estimates of multiplicity; absolute quantification requires complementary anatomical or imaging approaches.
