Name: אסטרטגיה מתכנס לדור של ספריית דנ א בלתי מופנה מצדפות פסיפיק (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-13T13:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 14 s
Description: למד שיטה ליצירת ספריית cDNA מצדפות פסיפיק מקומיות ללא ריצוף קונבנציונלי. השיטה מאפשרת שיבוט גנים ביוטכנולוגיים רלוונטיים באמצעות השוואת רצפי COX1 ו-NADH עם מסדי נתונים ציבוריים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו היתה נתמכת בחלקו של הקרן המדע הטבעי של סין (להעניק מספרים 31471703, A0201300537 ו 31671854 ל J.V. ו זמנהוף, גרנט מספר 31470435 G.Y.), ואת תוכנית כשרונות זרים 100 (מענק מספר JSB2014012 ל J.V.).

הערה: מבט סכימטי מוצג באיור 1.
1. אוסף דוגמאות
<ol><li>. השיגו דגימות צדפה שמרו צדפות על הקרח במהלך התקופה החקלאית, ההובלה ולפני השימוש במעבדה והתהליך בתוך 4-7 ימים לאחר הרכישה. הערה: עבור פרוטוקול זה, צדפות נרכשו מהשוק הסיטונאי Zhong Cai לנאנג (שמקורם בנינגנדה, פוג'יין, סין Lianyungang, ג'יאנגסו, סין), החברה מוצר ימיים Haijie בצ (שמקורם צ'ינגדאו, שאנדונג, סין), Jucheng חברת מוצרים ימיים ביאנטאי (שמקורם יאנטאי, שאנדונג, סין) ו Jinxiu מוצר החברה המוצר צ'ינגדאו (שמקורם צ'ינגדאו, שאנדונג, סין)).</li>
</ol>2. בידוד רנ א על ידי גואנידיניום-הפקת פנול
<ol><li>הכנת דגימת רקמת צדפה<ol>
<li>גזור כ 100 מ"ג של רקמה רכה הומוגנית מהמרכז הגיאומטרי משוער של כל דגימה צדפה עם אזמל מעוקר, ולהעביר את הדגימות לתוך חנקן נוזלי.</li>
		<li>המתת חסד את החלק הנותר של הצדפות על ידי הקפאת ב-80 ° c עבור 1 h ולהשליך כמו פסולת ביולוגית.</li>
		<li>לטחון את רקמת הצדפה הקפואה בהבזק לאבקה משובחת בחומר מליטה (200 mL) המלא ב 50 מ ל של חנקן נוזלי.</li>
		<li>שוקלים 75 מ"ג של הרקמה הקפואה של כל מדגם לתוך שפופרת סטרילי 1.5 mL ולערבב עם 1 מ ל של guanidinium החילוץ-פנול מגיב. צנטריפוגה את המדגם ב 14,000 x g ב 4 ° צ' עבור 15 דקות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להעביר את supernatant לצינור חדש 1.5 mL של צנטריפוגה, להוסיף 200 μL של כלורופורם ולערבב ביסודיות באמצעות מערבל מערבולת עבור 10-15 s עד התערובת הופך חלבי-לבן.</li>
	<li>צנטריפוגה ב 14,000 x g ב 4 ° צ' עבור 15 דקות, ולהעביר את שכבת מימית העליון בזהירות עם הצינור 200 μl מבלי להפריע את השלב הפנימי לתוך שפופרת צנטריפוגה של 1 מ ל 1.5 חדש.</li>
	<li>הוסף 500 μL של אלכוהול איזופרופיל וערבב את הדגימות בעדינות על-ידי היפוך, ולאחר מכן השאר את הדגימות עבור 20 דקות על הקרח. צנטריפוגה ב 14,000 x g ב 4 ° צ' עבור 8 דקות ולהסיר את הסופרנטאנט.</li>
	<li>השהה מחדש את כל כדורי ב 1 מ ל של 75% אטוח, וצנטריפוגה ב 14,000 x g ב 4 ° c עבור 5 דקות. הסר את כל הסופרנטאנט.</li>
	<li>חזור על שלב 2.5 פעם אחת. יבש את כדורי 6 דקות בטמפרטורת החדר. אל תייבש למשך זמן רב יותר; אחרת, זה עלול להיות קשה לפזר את הגלולה RNA בשלב הבא.</li>
	<li>לפזר את הגלולה מיובש RNA ב 25 μL של DEPC (diethylפחמתי)-מטופלים מים ולשמור על הצינור על הקרח. השתמש בדגימות RNA בתוך 24 שעות.</li>
</ol>3. cDNA הדור בספרייה על ידי שעתוק הפוכה
<ol><li>עבור כל לדוגמה RNA, להכין תערובת התגובה באמצעות מערכת מסחרי הפוכה שעתוק באמצעות הצינורות 10 μL: להוסיף 4 μL של פתרון MgCl2 , 2 μl של מאגר התגובה 10x, 2 μl של פתרון dntp, 0.5 μl של מעכב RNase, 0.7 μl של היפוך amv טראנסקריפט, 0.5 μL של Oligo (dT) 15 פריימר, 1 μL של דגימת RNA שחולצו ו 9.3 μL של H2O לתוך שפופרת 300 μl-PCR.</li>
	<li>התערובת מודקרת ב-PCR 60 דקות ב-42 ° c, ולאחר מכן הגדילו את הטמפרטורה ל-95 ° c עבור 5 דקות.</li>
	<li>אחסן את ספריית cDNA שנוצרה עד 12 חודשים ב-20 ° c.</li>
</ol>4. גן מיטוכונדריאלי הגברה וטיהור
<ol><li>הכינו את תערובת ה-PCR באמצעות הפיפטה 10 μL. הוסף 0.25 μL (1.25 U) של באיכות גבוהה DNA פולימראז, 2 μL של פתרון dNTP (2.5 mM של כל dNTP), 0.5 μL של COX1 או ND בהילוך קדמי (100 μM), 0.5 μL של היפוך COX1 או ND פריימר הפוכה (100 μM), 1 μL של ספריית cDNA , 5 μL של פתרון מאגר 5x ו -16 μL של מזוקק H2O לתוך צינור 300 μl.</li>
	<li>בצע את הגברה ה-PCR באמצעות הפרמטרים הבאים: לאחר צעד התחלתי ראשוני ב-95 ° צ' (משך 5 דקות), 35 מחזורי התגובה של ה-PCR המורכב משלב ריפוי ב55 ° צ' (30), צעד התארכות בשעה 72 ° צ' (2 דקות) וצעד הדנטורציה ב-95 ° צ' (30) , בצע צעד התארכות אחד עבור 5 דקות ב-72 ° c.</li>
	<li>השתמש 5 μL של מוצר ה-PCR כדי לוודא על-ידי אגנה ג'ל האיכות של מוצר ה-PCR המתקבל. לצפות את הגן COX1 או ND מוגבר כמו להקה אחת בכל אחד 759 או 748 זוגות בסיס, בהתאמה.</li>
	<li>לטהר את שאר מוצר ה-PCR עם ערכת ניקוי של ה-PCR.<ol>
<li>הוסף 100 μL של פתרון ' PCR-A ' (מאגר כריכת DNA המכיל ריכוזים גבוהים של מלחי chaotropic11) למדגם. מערבולת לזמן קצר כדי לערבב את התוכן.</li>
		<li>מקם את עמודת הטיהור לתוך צינורית צנטריפוגה של 2 מ ל. מפיפטה את תערובת התגובה של ה4.4.1. לתוך הטור. צנטריפוגה ב 14,000 x g עבור 1 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>השמט את הפילטרט מצינור הצנטריפוגה. להחזיר את העמודה 2 mL צנטריפוגה שפופרת, להוסיף 700 μL של פתרון ' W2 ' לתוך העמודה צנטריפוגה ב 14,000 x g עבור 1 דקות בטמפרטורת החדר (' W2 ' הוא פתרון כביסה אשר מכיל ריכוזים גבוהים של אתנול להסרת שיורית chaotropic מלחים מעמודת הטיהור).</li>
		<li>התעלם מהfiltrate והחזר את העמודה לשפופרת הצנטריפוגה של 2 מ"ל. הוסף 400 μL של פתרון ' W2 ' לעמודה ולצנטריפוגה ב 14,000 x g עבור 1 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>טרום חום 1 מ ל של מים מיוהים עד 65 ° c בתנור מתכת לחסום. העבר את העמודה לשפופרת צנטריפוגה חדשה 1.5 mL. פיפטה 25 μL של 65 מעלות צלזיוס מחומם לפני המים המחוממים והחמים למרכז קרום הטור הלבן. תנו לקרום להשרות במשך 1 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>צנטריפוגה ב 14,000 x g עבור 1 דקות בטמפרטורת החדר ולמחוק את העמודה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>אחסן את מוצר ה-PCR הטהור למשך עד 12 חודשים ב-20 ° c.</li>
</ol>5. רצף מיטוכונדריאלי גנטי והשוואה
<ol><li>שלחו את דגימות ה-PCR המטוהרים משלב 4.5 עבור רצפי שלבים באמצעות COX1 או ND לפני התחל ברצף התחל. באופן אופציונלי, ניתן להשתמש בCOX1 או ND התחל הפוך גם עבור רצף דו-כיווני.</li>
	<li>לאחר אחזור התוצאות ברצף, להשוות את רצפי עם רצף הגנום של השמש צדפה התייחסות זן (מזהה טקסונומיה של NCBI 29159) באמצעות הפיצוץ NCBI ק בכלי מקוון (blast.ncbi.nlm.nih.gov) (איור 2 ואיור 3 ).</li>
</ol>6. החלת ספריית cDNA לשכפול הגנים MgUGD ו MgUXS
<ol><li>להגביר ולטהר את הגנים MgUGD ו MgUXS באמצעות התחל קדימה והפוכה הפוך של MgUGD ו MgUXS על ידי ה-PCR לאחר השלבים 4.1. ל4.4.</li>
	<li>העברה 2 μL של מאגר העיכול (10x מרוכז) ו 6 μL של מים מוזים לתוך שפופרת צנטריפוגה 1.5 mL. הוסף 10 μL של מוצרים MgUGD או MgUXS PCR מטוהרים יחד עם end, ההגבלה Nde I ו-Xho I (1 μL כל אחד, 20 U). מודטה ב 37 ° צ' צלזיוס במשך 3 שעות.</li>
	<li>להכין את pET-30a מתעכל וקטור: להעביר 500 ng של pET-30a וקטור לתוך שפופרת צנטריפוגה חדש 1.5 mL ו למעלה את אמצעי האחסון כדי 16 μL באמצעות מים מוהים. הוסף 2 μL של מאגר העיכול (10x מרוכז) יחד עם ההגבלה end, הגבלת Nde I ו-Xho I (1 μL כל אחד, 20 U).<ol>
<li>לאחר הדגירה של התערובת ב 37 ° c עבור 3 h, להוסיף 1 μL של פוספספטאז אלקליין (1 U) ו דגירה ב 37 ° c עבור שעה נוספת. הפוך את פוספספטאז אלקליין על ידי חימום ב 75 ° c עבור 10 דקות בתנור מתכת מחומם מראש לחסום.</li>
	</ol>
</li>
	<li>העברה 4 μL של MgUGD או MgUXS DNA מוצרים לתוך טריות 1.5 mL לצינורות צנטריפוגה ולהוסיף 4 μL של וקטור pET-30a מתעכל. הוסף 1 μl של מאגר לחיץ (10x), 1 μl של T4 ליגאז (3 U) ו הדגירה תערובת התגובה ב 22 ° c עבור 3 h.</li>
	<li>שינוי צורה אלקטרומוסמכת E. coli Mach1 תאים מוסמך על ידי אלקטרופורציה באמצעות מוצרים ליפטיים. הפיצו את התאים שעברו שינוי לוחות LB אגר המכיל 50 μg/mL kanamycin. התאים הדגירה ב 37 ° צ' צלזיוס עבור 16 h.</li>
	<li>לאמת מושבות עבור ההכנסה הרצויה על ידי רצף Sanger באמצעות היזם T7 ספציפי הספציפית ושליחות קטלנית התחל. הכינו פלסטלינה מהשיבוטים החיידקיים המאומתים.</li>
</ol>7. ביטוי ובדיקות פעילות של MgUGD ו-MgUXS
<ol><li>המרה E. coli BL21 (DE3) תאים מוכשרים עם פלמידים הנושאים את הגנים MgUGD ו MgUXS ולהפיץ את התאים שעברו שינוי לוחות LB אגר המכיל 50 μg/mL kanamycin. התאים הדגירה ב 37 ° צ' צלזיוס עבור 16 h.</li>
	<li>לטפח מושבה אחת ב 5 מ"ל ליברות בינונית עם 50 μg/mL kanamycin לילה. להעביר את התרבות לתוך 400 mL ליברות בינונית ולטלטל ברציפות ב 200 סל"ד בטמפרטורה של 37 ° צ' עד הצפיפות האופטית באורך הגל של 600 ננומטר (OD600) מגיע לספיגה של כ 0.5.<ol>
<li>הפחת את טמפרטורת הדגירה ל-20 ° c והוסף 400 μL של איזופרופיל β-D-תאיוגליוןצד (ריכוז 1 מ'). לגרום לביטוי של חלבונים רקומביננטי במשך 3 שעות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לקצור את התאים על ידי צנטריפוגה ב 4,500 x g עבור 15 דקות ב 4 ° c. להשעות כדורי ב 10 מ ל של מאגר הליזה (100 מ"מ, 50 mM טריס/HCl, 1% טריטון X-100, 1 מ"מ פנילמתיל-פלואור (PMSF), pH 8.0).</li>
	<li>לשבש את התאים על ידי sonication עבור 20 דקות (40 הופעל/off מחזורים עם משרעת 20 יקרומטר עבור 15 s ב 4 ° c). צנטריפוגה ב 14,000 x g ב 4 ° צ' עבור 20 דקות ולאסוף את supernatant עבור בדיקת הפעילות.</li>
	<li>בצע את שיטת הפעילות של MgUGD על-ידי דגירה 2 μL של התא ליפוסט עם 2 μL של ה-UDP-גלוקוז (10 מ"מ), 4 μL של NAD+ (10mm), 4 Μl של MgCl2 (10 מ"מ), 2 μl של מאגר טריס/HCl (500 מ"מ, pH 7.5), ו-6 μl של H מועברו2O ב חדש 1.5 שפופרת הצנטריפוגה של mL ו-דגירה ב 37 ° c עבור 30 דקות.</li>
	<li>לבצע את שיטת הפעילות של MgUXS על-ידי מארג 2 μL של תא ליפוסט עם 2 μL של חומצה UDP-גלוקורונית (10 מ"מ), 2 μL של מאגר טריס/HCl (500 מ"מ, pH 7.5), ו 14 μL של H2O בתוך הצינור החדש של 1.5 mL ו-דגירה ב 37 °</li>
	<li>כיבוי התגובות בשלב 7.5 ו 7.6 על ידי הוספת 20 μL של מתנול ו 40 μL של כלורופורם לכל תערובת. לאחר vortexing את תערובות לדוגמה, צנטריפוגה ב 14,000 x g עבור 6 דקות ב 4 ° צ' ולאסוף את השכבה העליונה מימית של כל צינור.</li>
	<li>לנתח את מוצרי הריאקציה באמצעות מאלדי-תוף ספקטרומטר מסה במצב אינון שלילי בטווח m/z מ500-700. מערבבים 1 μL של תערובת לדוגמה עם 1 μL של 2, 5-דיהידרוטסטוסטרון מטריצה לדוגמה חומצה (1% w/V ב 50% מימית). שימו לב לערכי m/z הצפויים ב-579 ו-535 עבור חומצות UDP-גלוקוריוני ו-UDP-xylose בהתאמה (איור 4).</li>
</ol>

<ol><li>Blaxter, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+promise+of+a+DNA+taxonomy%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+transactions+of+the+Royal+Society+of+London.+Series+B%2C+Biological%22%5BJournal%5D)">The promise of a DNA taxonomy.</a> Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological. 359 (1444), 669-679 (2004).</li>
<li>Wen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Species+identification+of+dried+shellfish+%28oyster%2C+clam+and+mussel%29+products+sold+on+the+Chinese+market%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Control%22%5BJournal%5D)">Species identification of dried shellfish (oyster, clam and mussel) products sold on the Chinese market.</a> Food Control. 90, 199-204 (2018).</li>
<li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+cob+and+cox1+genes+and+editing+of+the+corresponding+mRNAs+in+Dinophysis+acuminata+from+Narragansett+Bay%2C+with+special+reference+to+the+phylogenetic+position+of+the+genus+Dinophysis%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial cob and cox1 genes and editing of the corresponding mRNAs in Dinophysis acuminata from Narragansett Bay, with special reference to the phylogenetic position of the genus Dinophysis.</a> Applied and Environmental Microbiology. 74 (5), 1546-1554 (2007).</li>
<li>Sell, J., Spirkovski, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+DNA+differentiation+between+two+forms+of+trout+Salmo+letnica%2C+endemic+to+the+Balkan+Lake+Ohrid%2C+reflects+their+reproductive+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Ecology%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial DNA differentiation between two forms of trout Salmo letnica, endemic to the Balkan Lake Ohrid, reflects their reproductive isolation.</a> Molecular Ecology. 13, 3633-3644 (2004).</li>
<li>Karadjian, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+rearranged+mitochondrial+genome+in+Nycteria+parasites+%28Haemosporidia%29+from+bats%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Highly rearranged mitochondrial genome in Nycteria parasites (Haemosporidia) from bats.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (35), 9834-9839 (2018).</li>
<li>Morga, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+genes+from+flat+oyster+Ostrea+edulis+as+suitable+housekeeping+genes+for+quantitative+real+time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Fish+and+Shellfish+Immunology%22%5BJournal%5D)">Identification of genes from flat oyster Ostrea edulis as suitable housekeeping genes for quantitative real time PCR.</a> Fish and Shellfish Immunology. 29 (6), 937-945 (2010).</li>
<li>Delsuc, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+systematics+of+armadillos+%28Xenarthra%2C+Dasypodidae%29%3A+contribution+of+maximum+likelihood+and+Bayesian+analyses+of+mitochondrial+and+nuclear+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Phylogenetics+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Molecular systematics of armadillos (Xenarthra, Dasypodidae): contribution of maximum likelihood and Bayesian analyses of mitochondrial and nuclear genes.</a> Molecular Phylogenetics and Evolution. 28 (2), 261-265 (2005).</li>
<li>Wei, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+and+Biochemical+Characterization+of+UDP-Glucose+Dehydrogenase+from+Akkermansia+muciniphila%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+%26+Peptide+Letters%22%5BJournal%5D)">Discovery and Biochemical Characterization of UDP-Glucose Dehydrogenase from Akkermansia muciniphila.</a> Protein & Peptide Letters. 24 (8), 735-741 (2017).</li>
<li>Gu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+and+Biochemical+Characterization+of+the+UDP-Xylose+Biosynthesis+Pathway+in+Sphaerobacter+thermophilus%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+%26+Peptide+Letters%22%5BJournal%5D)">Discovery and Biochemical Characterization of the UDP-Xylose Biosynthesis Pathway in Sphaerobacter thermophilus.</a> Protein & Peptide Letters. 23 (12), 1103-1110 (2016).</li>
<li>Duan, X. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+characterization+of+the+UDP-xylose+biosynthesis+pathway+in+Rhodothermus+marinus%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Functional characterization of the UDP-xylose biosynthesis pathway in Rhodothermus marinus.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 99 (22), 9463-9472 (2015).</li>
<li>Vogelstein, B., Gillespie, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparative+and+analytical+purification+of+DNA+from+agarose%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Preparative and analytical purification of DNA from agarose.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (2), 615-619 (1979).</li>
<li>Song, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UDP-glucose+4-epimerase+and+%CE%B2-1%2C4-galactosyltransferase+from+the+oyster+Magallana+gigas+as+valuable+biocatalysts+for+the+production+of+galactosylated+products%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">UDP-glucose 4-epimerase and β-1,4-galactosyltransferase from the oyster Magallana gigas as valuable biocatalysts for the production of galactosylated products.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (6), 1600(2018).</li>
<li>Gainey, P. A., Phelps, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uridine+diphosphate+glucuronic+acid+production+and+utilization+in+various+tissues+actively+synthesizing+glycosaminoglycans%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Uridine diphosphate glucuronic acid production and utilization in various tissues actively synthesizing glycosaminoglycans.</a> Biochemical Journal. 128 (2), 215-227 (1972).</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

הפרוטוקול המוצג מאפשר זיהוי גנטי של דגימות צדפה ללא הפניה עם פנוטיפ דומה משוקי פירות ים אזוריים על ידי השוואה של הגנים COX1 ו-ND עם מאגר הגנום ה-DNA צדפה זמין בפומבי. המשמעות של שיטה זו טמונה בפשטותו, כמו רק תגובת PCR אחת נדרשת להערכת הספרייה cDNA וירטואלי. שני COX1 מיטוכונדריאלי שמרו וגנים ND הוהוגדל מספריית cDNA אשר נוצר על ידי שעתוק הפוכה של תמציות RNA מכל צדפה. השיטה של בידוד RNA (שלב 2.1) היה פשוט יותר על ידי שפשוף הרקמה הצדפה בחנקן נוזלי. לאחר ברצף את הגנים COX1 ו-ND של כל אחד מהדוגמה, מספר הרצף גילה כי כמה דגימות ...

הקניית החומר הביולוגי שניתן לטפל בהן, עלולה להיות מאתגרת עקב זמני משלוחים ארוכים, הסקת מסקנות יזמות או תקנות מכס ספציפיות למדינה. כחלופה, החומר הביולוגי הנדרש ניתן גם לאיסוף מדגימות זהות בדרך כלל. עם זאת, דוגמאות אלה עשויות להשתנות באופן משמעותי ברמת ה-גנוטיפ, ולכן השוואות בעלות התייחסות דיגיטלית מאוחסנת מאותו מינים מעובדים לעתים קרובות קשות או אפילו חסרות תועלת עקב אי התאמה של החומר החדש ממקור עם שיטות הגברה קיימות של הדנ א. רצף הגנים שנשמרים במיוחד של דגימות בודדות הוא כלי נפוץ ורב עוצמה לזיהוי מינים1, כגון גנים מיטוכונדריאלי שימור המשמשים לעתים קרובות גנים התייחסות להערכת איכות של ספריות cdna2 ,3,4,5,6 הרציונל הבסיסי של שיטה זו הציגה הוא כי שימור גבוה של רצפי גנים מיטוכונדריאלי בדגימות הצדפה אנונימי בודדים לעומת רצפים המקביל של הגנום התייחסות מעיד כי גנים אחרים עשויים גם להראות רמה נמוכה של סטייה, בהינתן שיעור מהיר בדרך כלל של האבולוציה מיטוכונדריאלי ביחס ל-DNA גרעיני7, המאפשר הגברה ובידוד של מגוון רחב של גנים רלוונטיים מדעית ותעשייתית על ידי שימוש בפומבי נתוני רצף נתונים זמינים כהפניה.
המטרה הכוללת של השיטה המתוארת היא להציג זרימת עבודה ממוטבת ליצירת הצדפה כמעט רציף cDNA הספרייה אשר ניתן להשתמש בה כמו DNA תבנית עבור שיבוט של גנים צדפה. ברצף וירטואלי, רצף הגנום דה נובו הוא שפרקו; במקום זאת, משתמשים ברצף הפניה מוכר ומאוחסן באופן דיגיטלי כדי לנצל או לעצב צבעי יסוד לייצור cDNAs שבסופו של דבר מהווים ספריה (או יתווספו לקיים מראש). המטרה היא לייצר ספריית cDNA מתכנסת, כלומר דמיון בין רצפי ה-Dna שנוצרו ואת רצף ההתייחסות יכול להיות מדורגת מפני התפצלות נמוך עד גבוה. יתרון מרכזי של שימוש בציטוכרום C אוקסידאז משנה 1 (COX1) ו NADH Dehydrogenase (ND) כמו גנים התייחסות היא כי אפילו מאוד גיאוגרפית ופרד דגימות הצדפות ניתן לפרופיל בשל שימור גבוה של גנים אלה מיטוכונדריאלי. לאחר הוכיחה את הגישה עם סמנים אלה מבוססים, אנו לאחר מכן להדגים את היישום שלה לשני מועמדים אנזימים אשר מעורבים בביוסינתזה נוקלאוטיד סוכר ועשויים להיות בעלי רלוונטיות תעשייתית8,9, 10. הפוטנציאל הביוטכנולוגי של הצדפה באוקיינוס השקט עדיין לא נחקר. לפיכך, אנו מאמינים כי שיטה מתכנס זו להכנת ספריית cDNA כמעט ברצף יהיה גם מתאים לחוקרים שאינם מומחים המעוניינים ליצור cDNA מחומר זה ביולוגי רלוונטי.

<table><tbody><tr><td><חזק>כימיקלים:</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1% טריטון X-100</td><td>Solarbio</td><td>9002-93-1</td><td>*מפיצים חלופיים אפשריים</td></tr><tr><td>2,5-חומצה דיהידרוקסיבנזואית</td><td>אלפא Aesar</td><td>490-79-9</td><td>*מפיצים חלופיים אפשריים</td></tr><tr><td>אצטוניטריל</td><td>Merck</td><td>75-05-8</td><td>*מפיצים חלופיים אפשריים</td></tr><tr><td>Agarose עבור ביולוגיה מולקולרית</td><td>Biowest Chemicals</td><td>111860</td><td>*מפיצים חלופיים אפשריים</td></tr><tr><td>Ampicilin</td><td>Solarbio</td><td>69-52-3</td><td>*מפיצים חלופיים אפשריים</td></tr><tr><td>כלורופורם</td><td>לינגפנג, שנחאי</td><td>67-66-3</td><td>*מפיצים חלופיים אפשריים</td></tr><tr><td>DEPC מים</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0601</td><td></td></tr><tr><td>אתנול</td><td>ג'ינהואדה, גואנגג'ואו</td><td>64-17-5</td><td>*מפיצים חלופיים אפשריים</td></tr><tr><td>מגיב גואנידיניום תיוציאנט-פנול</td><td>מגיב Invitrogen</td><td>15596018</td><td>TRIzol מגיב</td></tr><tr><td>אימידזול</td><td>אנרגיה כימית</td><td>288-32-4</td><td>*מפיצים חלופיים אפשריים</td></tr><tr><td>איזופרופיל אלכוהול</td><td>נאנג'ינג מגיב כימי</td><td>67-63-0</td><td>*מפיצים חלופיים אפשריים</td></tr><tr><td>איזופרופיל ובטא;- D-thiogalactopyranoside</td><td>Solarbio</td><td>367-93-1</td><td>*מפיצים חלופיים אפשריים</td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Solarbio</td><td>25389-94-0</td><td>*מפיצים חלופיים אפשריים</td></tr><tr><td>LB</td><td>Agar Thermo Fisher</td><td>22700025</td><td>*מפיצים חלופיים אפשריים</td></tr><tr><td>LB Broth</td><td>Thermo Fisher</td><td>10855021</td><td>*מפיצים חלופיים אפשריים</td></tr><tr><td>מתנול</td><td>ג'ינהואדה, גואנגג'ואו</td><td>67-56-1</td><td>*מפיצים חלופיים אפשריים</td></tr><tr><td>MgCl2 hexahydrate</td><td>Xilong Huagong</td><td>7791-18-6</td><td>*מפיצים חלופיים אפשריים</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Xilong Huagong</td><td>7647-14-5</td><td>*מפיצים חלופיים אפשריים</td></tr><tr><td>NAD+</td><td>Duly Biotech</td><td>53-84-9</td><td>*מפיצים חלופיים אפשריים</td></tr><tr><td>פניל-מתיל-סולפוניל פלואוריד</td><td>מקלין</td><td>329-98-6</td><td>*מפיצים חלופיים</td></tr><tr><td>אפשריים Tris</td><td>Solarbio</td><td>77-86-1</td><td>*מפיצים חלופיים אפשריים</td></tr><tr><td>UDP-גלוקוז</td><td>Wuhu Nuowei Chemicals</td><td>28053-08-9</td><td>*מפיצים חלופיים אפשריים</td></tr><tr><td>חומצה UDP-גלוקורונית</td><td>SIGMA</td><td>63700-19-6</td><td>*מפיצים חלופיים אפשריים</td></tr><tr><td><חזק>כלים/מכשירים: </חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MALDI-TOF ספקטרומטר מסה</td><td>Bruker</td><td>Autoflex</td> <td>* מפיצים חלופיים אפשריים</td></tr><tr><td>מחמם בלוק מתכת</td><td>Long Yang Scientific Instruments</td><td>Thermoshaker HB20</td> <td>* מפיצים חלופיים אפשריים</td></tr><tr><td>PCR thermocycler</td><td>Hema</td><td>9600</td> <td>* מפיצים חלופיים אפשריים</td></tr><tr><td><חזק>אנזימים וערכות:</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 פעמים; מאגר קשירה</td><td>Thermo Scientific</td><td>B69</td> <td>* מפיצים חלופיים אפשריים</td></tr><tr><td>5 פעמים; PrimeSTAR buffer</td><td>Takara</td><td>9158A</td><td></td></tr><tr><td>אלקליין פוספטאז</td><td>ThermoFisher FastAP</td><td>EF0654</td><td>*מפיצים חלופיים אפשריים</td></tr><tr><td>COX קדימה פריימר</td><td></td><td>Genscript ATGTCAACAAATCATTG</td><td></td></tr><tr><td>COX פריימר הפוך</td><td>Genscript</td><td>ACTTGACCAAAAAACATAAGACATG</td><td></td></tr><tr><td>Cutsmart Buffer</td><td>NEB</td><td>B7204S</td><td>*חלופה מפיצים אפשריים</td></tr><tr><td>dNTP mix</td><td>Invitrogen</td><td>18427088</td><td></td></tr><tr><td>MgUGD קדימה פריימר</td><td>Genscript</td><td>ACATATGACCCTCTCCAAGATCTGTTGT</td><td></td></tr><tr><td>MgUGD פריימר הפוך</td><td>Genscript</td><td>ACTCGAGACTCTGTGAGGCGGTGGAG</td><td></td></tr><tr><td>MgUXS קדימה פריימר</td><td>Genscript</td><td>CCATATGGCAGAATCCTCACAATCAC</td><td></td></tr><tr><td>MgUXS פריימר הפוך</td><td>Genscript</td><td>ACTCGAGCACATTTTTGAATTTGCAGACGT</td><td></td></tr><tr><td>ND קדימה פריימר</td><td>Genscript</td><td>ATGAGATGGCAATTATTTTTTAAT</td><td></td></tr><tr><td>ND פריימר הפוך</td><td>Genscript</td><td>ATGTATTTTGGAAAAATCTCCAC</td><td></td></tr><tr><td>PCR Cleanup Kit</td><td>AxyGen</td><td>AP-PCR-250</td><td>*מפיצים חלופיים אפשריים</td></tr><tr><td>pET-30a(+) וקטור</td><td>Merck Millipore</td><td>69909</td><td></td></tr></tbody></table>

אסטרטגיה מתכנס לדור של ספריית דנ א בלתי מופנה מצדפות פסיפיק

A Converging Strategy for the Generation of a Virtually Sequenced cDNA Library from Unreferenced Pacific Oysters

הגישה לחומר ביולוגי של מינים התייחסות, אשר שימשו בעבר ניסויים מרכזיים כגון בפיתוח של קווי התא הרומן או פרויקטים ברצף הגנום, הם לעתים קרובות קשה לספק למחקרים נוספים או צדדים שלישיים בשל ה consumptive הטבע של הדגימות. למרות שעכשיו נרחב מופץ על חופי האוקיאנוס השקט של אסיה, אוסטרליה וצפון אמריקה, בודדים האוקיינוס השקט דגימות מגוונות מבחינה גנטית ולכן הם לא מתאימים ישירות כמו חומר מתחיל עבור ספריות גנים. במאמר זה, אנו מדגימים את השימוש בדגימות של צדפות האוקיינוס השקט שהתקבלו משוקי פירות ים אזוריים כדי ליצור ספריות cDNA. ספריות אלו הושוו לגנום הצדפות הזמין בציבור, והספרייה הקרובה ביותר נבחרה באמצעות התייחסות מיטוכונדריאלי גנים ציטוכרום C אוקסידאז I (COX1) ו-NADH דהידרוגנאז (ND). ההתאמה של הספרייה cdna שנוצר מומחש גם על ידי שיבוט וביטוי של שני גנים קידוד האנזימים של החומצה udp גלוקוראז (אויח) ו-udp-xylose אבד סטנדרטים (uxs), אשר אחראים על הביוסינתזה של udp-קסיפסיד מ UDP-גלוקוז.

איור 1 מציג סקירה סכמטית של שיטת ההכנה המתוארת של ספריית cdna המתכנסת הנגזרת מאנשי הצדפות באוקיינוס השקט. איור 2 מראה את רצפי הגנים COX1 ו-ND של דגימה ממרחק הקשורים הצדפה עם התפצלות גבוהה מתוך COX1 ו nd רצפי גנים של חומר הייחוס. איור 3 מראה את רצפי הגנים COX1 ו-ND של מדגם צדפה הקשורים היטב עם חריגה נמוכה מרצפי הגנים COX1 ו-nd של חומר הייחוס. איור 4 מציג את היישום המוצלח של ספריית cdna כדי לשכפל את הגנים...

אנו מתארים אסטרטגיה כיצד להשתמש בדגימות RNA מתוך דגימות הצדפה הפסיפיק, ולהעריך את החומר הגנטי על ידי השוואה עם נתוני הגנום זמין בפומבי כדי ליצור ספריית cDNA כמעט רציף.

The access to biological material of reference species, which were used previously in key experiments such as in the development of novel cell lines or ...

שאלת המפתח שאנו רוצים להתייחס אליה בשיטה זו היא כיצד נוכל להשתמש בדגימות RNA מחומר שנרכש בשוקי מזון מקומיים לשיבוט גנים רלוונטיים ביוטכנולוגיה? כאן, אנו משתמשים צדפות האוקיינוס השקט כמקרה מבחן להדגמת גישה זו ויישום נוסף פוטנציאלי. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא כי גנום קונבנציונלי או רצף cDNA של דגימות צדפות ניתן לעקוף.במקום זאת, רצפים של ציטוכרום c אוקסידאז subunit אני NADH דהידרוגנאז הושוו עם רצפי התייחסות זמינים לציבור מן הצדפה האוקיינוס השקט כדי לבחור את הדגימה הקשורה ביותר. ה- cDNA שהוכן מדגימה זו יכול לשמש ישירות לשיבוט של גנים רלוונטיים ביוטכנולוגיה, אשר ניתן לבחור באמצעות מידע הרצף הציבורי. הדגמת ההליך יהיו יונגמיי ליו ויוקוואן לי, שני סטודנטים לתארים מתקדמים מהמרכז לחקר הגליקומיקה והביו-הנדסה הגליקנית באוניברסיטה החקלאית של נאנג'ינג.כדי להכין דגימת רקמת צדפה, השתמש אזמל מעוקר לחתוך כ 100 מיליגרם של רקמה רכה הומוגנית מהמרכז הגיאומטרי המשוער של כל דגימת צדפה. מעבירים את הדגימה למרגמה מלאה ב-50 מיליליטר של חנקן נוזלי. טוחנים את רקמת הצדפה הקפואה לאבקה דקה.שוקלים 75 מיליגרם של הרקמה הקפואה של כל דגימה לתוך צינור צנטריפוגה סטרילי 1.5 מיליליטר, ומערבבים עם מיליליטר אחד של ריאגנט מיצוי גואנידיניום תיוצ'יאנט-פנול. השלב הקריטי ביותר של הליך זה הוא שלב החילוץ RNA. על מנת למזער השפלה RNA, זה חיוני כדי להפחית את הזמן בין קצירת רקמת הצדפה ואת מיצוי RNA.צנטריפוגה המדגם ב 14, 000 פעמים g וארבע מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. מעבירים את העל-טבעי לצינור צנטריפוגה חדש של 1.5 מיליליטר, מוסיפים 200 מיקרוליטרים של כלורופורם ומערבבים היטב על מערבל מערבולת במשך 10 עד 15 שניות עד שהתערובת הופכת ללבנה חלבית. לאחר מכן, צנטריפוגה במשך 15 דקות כפי שנעשה בעבר.עם פיפט 200 מיקרוליטר, בזהירות להעביר את השכבה המים העליונה, מבלי להפריע interphase, לתוך צינור צנטריפוגה 1.5 מיליליטר חדש. מוסיפים 500 מיקרוליטרים של אלכוהול isopropyl לתוך צינור צנטריפוגה, ולהפוך בעדינות כדי לערבב את הדגימות. ואז להשאיר את הדגימות על קרח במשך 20 דקות.צנטריפוגה ב 14, 000 פעמים g וארבע מעלות צלזיוס במשך שמונה דקות, ולהסיר את supernatant. תן את הכדור במיליליטר אחד של 75%אתנול, וצנטריפוגה ב 14, 000 פעמים g וארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. הסר את כל העל-טבעי, וחזור על הכביסה באתנול.יבש את כדורי במשך שש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, ממיסים את גלולת ה-RNA המיובשת ב-25 מיקרוליטרים של מים שטופלו ב-DEPC, ומרחיקים את הצינור על הקרח. השתמש בדגימות ה-RNA תוך 24 שעות.כדי ליצור ספריית cDNA, תחילה להכין תערובת תגובה עבור כל דגימת RNA בצינור PCR 300 מיקרוליטר על ידי הוספת פתרונות על פי כתב היד. הוסף מיקרוליטר אחד של דגימת RNA שחולצו לתוך הצינור. הדגירה את התערובת בתרמוצ'ילי PCR במשך 60 דקות ב 42 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן להגדיל את הטמפרטורה ל 95 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות.אחסן את ספריית cDNA שנוצרה עד 12 חודשים במינוס 20 מעלות צלזיוס. ראשית, להוסיף מיקרוליטר אחד של ספריית cDNA שנוצר צינורות המכילים תערובות PCR, מוכן על פי כתב היד. מקם את צינורות PCR לתוך התרמוצ'ילר PCR, ולבצע את הגברה PCR עם שלב denaturation הראשונית 35 מחזורי תגובה PCR המורכב שלב חישול, צעד התארכות, צעד denaturation על פי כתב היד.לאחר המחזורים, לבצע צעד אחד סיום התארכות במשך חמש דקות. השתמש בחמישה מיקרוליטרים של מוצר PCR כדי לאמת את האיכות על ידי אלקטרופורזה ג'ל agarose. שימו לב לגן COX1 או ND המוגבר כרצועה אחת ב-759 או 748 זוגות בסיסים, בהתאמה.כדי לטהר את שאר המוצר PCR, להוסיף 100 microliters של מאגר מחייב DNA המכיל ריכוזים גבוהים של מלחים chaotropic לכל מדגם. מערבולת בקצרה כדי לערבב את התוכן. מניחים עמוד טיהור לתוך צינור צנטריפוגה שני מיליליטר.פיפטה תערובת התגובה לתוך הטור. מניחים את הצינור עם העמוד רכוב בצנטריפוגה ב 14, 000 פעמים גרם במשך דקה אחת בטמפרטורת החדר. לאחר השלכת הסינון מצינור הצנטריפוגה שני מיליליטר, לשטוף פעמיים עם 700 ו 400 microliters של פתרון כביסה W2 על ידי צנטריפוגה ב 14, 000 פעמים גרם.לאחר מכן, מחממים מיליליטר אחד של מים deionized ל 65 מעלות צלזיוס בתנור בלוק מתכת. העבר את העמודה לצינור צנטריפוגה חדש של 1.5 מיליליטר, ולצינור פיפטה 25 מיקרוליטר של המים שחומם מראש למרכז קרום העמוד הלבן. תן את הממברנה להשרות במשך דקה אחת בטמפרטורת החדר.לאחר מכן, צנטריפוגה הצינור עם העמוד ב 14, 000 פעמים גרם במשך דקה אחת בטמפרטורת החדר. יש להשליך את העמודה ולאחסן את מוצר ה-PCR המטוהר למשך עד 12 חודשים במינוס 20 מעלות צלזיוס. באופן אופציונלי, ניתן להשתמש בפרימרים ההפוכים COX1 או ND גם עבור רצף דו-כיווני.עבור רצף סנגר, השתמש ב- COX1 או ב- ND קדימה הרלוונטי. לאחר אחזור תוצאות הרצף, השווה את הרצפים עם רצף הגנום של זן הייחוס של צדפות האוקיינוס השקט באמצעות הכלי המקוון NCBI Nucleotide BLAST. השתמשו בפרימרים קדמיים והפוךים בהתאמה של גנים MgUGD ו-MgUXS כדי להגביר ולטהר על ידי PCR כפי שנעשה בעבר.לאחר הדגירה מוצרי PCR מטוהרים עם חיץ עיכול, להכין את וקטור pET-30a predigested על ידי המסת 500 ננוגרם של pET-30a בצינור צנטריפוגה 1.5 מיליליטר, ולהוסיף מים deionized למעלה עד 16 microliters. לאחר מכן, הוסיפו שני מיקרוליטרים של מאגר עיכול מרוכז פי 10 ומיקרוליטר אחד לכל אחד מ-20 היחידות המצילות אנדונוקלאס Nde1 ו-Xho1 לתוך הצינור. להחגירה את התערובת ב 37 מעלות צלזיוס במשך שלוש שעות.לאחר מכן, מוסיפים מיקרוליטר אחד של פוספטאז אלקליין יחידה אחת, ודגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך שעה נוספת. לאחר מכן, מניחים את הצינור בתנור בלוק מתכת שחומם מראש ב 75 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות כדי להשבית את הפוספטזה אלקליין. לאחר טיפוח תאי E.coli BL21 הנושאים את הגנים MgUGD ו- MgUXS, מעבירים את התרבות למדיום LB של 400 מיליליטר בבקבוק רועד של שני ליטרים, ומ מניחים אותו על שייקר במהירות של 200 סל"ד בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.לאחר שלוש שעות, לבדוק את הצפיפות האופטית על פוטומטר באורך גל של 600 ננומטר, ולוודא שהוא מגיע לספיגה של כ 0.5. לאחר מכן להפחית את טמפרטורת השייקר ל 20 מעלות צלזיוס. הוסף 400 microliters של IPTG טוחן אחד כדי לגרום לביטוי של חלבונים רקומביננטי במשך שלוש שעות.לאחר קצירת התאים, לשבש את התאים על ידי sonication במשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס. צנטריפוגה ב 14, 000 פעמים g וארבע מעלות צלזיוס במשך 20 דקות, ולאסוף את supernatant בצינור חדש לבדיקת הפעילות. לאחר בדיקה פעילות, להרווה את התגובות על ידי הוספת 20 microliters של מתנול ו 40 microliters של כלורופורם לתערובות MgUXS ו MgUGD.מערבולת תערובות מדגם, וצנטריפוגה ב 14, 000 פעמים גרם במשך שש דקות וארבע מעלות צלזיוס. לאסוף את השכבה הממימייה העליונה של כל צינור בצינורות חדשים עבור ספקטרומטריית מסה MALDI-TOF. בניסוי זה, יישור רצף של רצפי הגנים COX1 ו- ND של דגימה מפוצלת מאוד הושוו עם זן הצדפות הפסיפי התייחסות.החצים האדומים מראים הבדלי נוקלאוטיד בין רצף ההתייחסות לבין רצף דגימות cDNA שהתקבלו. הרצפים של הגנים COX1 ו- ND של דגימת צדפות קשורה קשר הדוק מראים סטייה נמוכה מזן הצדפות הפסיפי התייחסות. ספקטרומטריית המסה MALDI-TOF מציגה יישום מוצלח של ספריית cDNA לשיבוט הגנים הרלוונטיים לתעשייה MgUGD ו- MgUXS.תמונת הג'ל מזהה גם חומצה UDP-glucuronic ו UDP-xylose שנוצר על ידי הפעולה אנזימטית של MgUGD ומטוהרים ברציפות MgUGD ו MgUXS. שיטה זו אינה דורשת התאמה מושלמת בין רצף הייחוס לבין רצפי הסמן המתקבלים ואותה לתת לחוקר ביטחון לעבוד עם צדפות לא קשורות. באופן עקרוני, שיטה זו יכולה להיות מיושמת על כל מדגם ביולוגי שלא הותר עבורו רצפים ממין ייחוס קרוב זמינים לציבור.שיטה זו מאפשרת לחוקרים שאינם מומחים לגשת בקלות לחומר גנטי בעל חשיבות ביולוגית פוטנציאלית וסוללת את הדרך עבור מדענים נוספים לעבוד עם דגימות ביולוגיות נגישות אך מזוהות באופן לא שלם.

a-converging-strategy-for-generation-virtually-sequenced-cdna-library

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

בניה של ספריה fosmid עם הדנ"א הגנומי הסביבה מבודדים רצף העומק האנכי של פיורד hypoxic עונתיות מתואר. הספרייה שיבוט המתקבל הוא הרים את 384 גם צלחות בארכיון עבור סידור במורד וסינון תפקודית על ידי יישום של מערכת המושבה אוטומטיות קטיף.

הכנס גדול הסביבה הגנום ספריית הפקה

כאן אנו מתארים שיטה להכנת שני יחיד לקרוא לזווג Illumina סוף mRNA-Seq ספריות לניתוח רצפי גנים הביטוי מבוסס על הגברה T7-RNA ליניארי. פרוטוקול זה דורש רק 10 ננוגרם של רנ"א הכל החל ומייצר ספריות עקבי מאוד המייצגים תמלילי כולו.

יחיד קרא מותאמים mRNA-Seq סוף Illumina ספריות מ -10 ננוגרם RNA סך הכל

אנו מתארים את ההכנה של ספריות ה-DNA המינימרקטים ולכידת אקסון הבא המבוסס על הכלאה לזיהוי של מוטציות סרטן קשור מפתח בדגימות גידול קליניים על ידי רצף "הדור הבא" מקביל מסיבי. רצף אקסון ממוקד מציע יתרונות של תפוקה גבוהה, עלות נמוכה, וכן כיסוי רצף עמוק, ובכך מניב רגישות גבוהה לאיתור מוטציות בתדירות נמוכה.

זיהוי שינויים גנטיים סומטי בדגימות גידול על ידי לכידת אקסון וריצוף מקביל מסיבי

אנו מתארים מערכת ביצית Xenopus וכובע בעלי חיים לשיבוט ביטוי של גנים המסוגלים לעורר תגובה באקטודרם מוכשר, ודנים בטכניקות לניתוח מאוחר יותר של גנים כאלה. מערכת זו שימושית בזיהוי פונקציונלי של מגוון רחב של תוצרי גנים.

שיבוט פונקציונלי שימוש<em&gt; Xenopus</emמערכת ביטוי ביצית&gt;

פרוטוקול זה מתאר שיטת ה-pre-mRNA מיפוי 3' עיבוד אתרי קצה.

3' סיום רצף ספריית הכנה עם א-seq2

שיטות ליצירת ספריות gRNA בקנה מידה גדול צריך להיות פשוט, יעיל וחסכוני. אנו מתארים פרוטוקול לייצור של ספריות gRNA מבוסס על עיכול אנזימטי של יעד ה-DNA. שיטה זו, CORALINA (ספריית gRNA מקיף הדור באמצעות פעילות נוקלאז מבוקר) מציג אלטרנטיבה סינתזה יקר oligonucleotide מותאם אישית.

פרוטוקול אוניברסלי עבור gRNA בקנה מידה גדול ספריית הפקה מכל מקור ה-DNA

זיהום במהלך רצף גנומית של אורגניזמים מיקרוסקופיים עדיין בעיה גדולה. כאן, אנו מראים שיטה רצף הגנום של דובוני מים מן להצטננות עם עמוד 50 קטנה כמו של ה-DNA גנומי ללא הגברה הגנום כולו כדי למזער את הסיכון של זיהום.

הגנום קלט ultralow רצף ספריית הכנה מ להצטננות Tardigrade

אנו מציגים את פרוטוקול מסך משתיק קול פשוט בהתכה שמרים. שיטה זו היא יעילה ללא מוטגן, סלקטיבי מוטציות מתרחשות לעיתים קרובות באתר גנומית יחיד.  הפרוטוקול מתאים לבידוד מדכאי על פגמים צמיחה בתרבות נוזלי שנגרמות על ידי מוטציה או תרופה.

מסך משתיק קול עמוק רצף-בסיוע, ספונטני ב ביקוע שמרים שמר הביקוע

אנו מציגים פרוטוקול להרכבה מודולרית מבוססת קריספר (CRISPRmass), שיטה לבנייה בתפוקה גבוהה של ספריית פלסמיד UAS-cDNA/ORF בדרוזופילה תוך שימוש במשאבי cDNA/ORF הזמינים לציבור. CRISPRmass ניתן ליישם על עריכת ספריות פלסמיד שונות.

הרכבה מודולרית מבוססת CRISPR לבניית ספריית פלסמיד UAS-cDNA/ORF

מאמר זה מציג פרוטוקול לביצוע פרופיל טרנסקריפטומי מרחבי מקיף של RNA מארח, ויראלי, פטרייתי ומיקרוביום מקטעי רקמה משובצים בפרפין קבוע פורמלין באמצעות Stereo-seq, המאפשר מיפוי ברזולוציה גבוהה של טרנסקריפטומים מגוונים תוך שמירה על ארכיטקטורת רקמות.

פרופיל מרחבי מקיף של טרנסקריפטומים אגנוסטיים למינים באמצעות סטריאו-רצף

למד שיטה ליצירת ספריית cDNA מצדפות פסיפיק מקומיות ללא ריצוף קונבנציונלי. השיטה מאפשרת שיבוט גנים ביוטכנולוגיים רלוונטיים באמצעות השוואת רצפי COX1 ו-NADH עם מסדי נתונים ציבוריים.

אסטרטגיה מתכנס לדור של ספריית דנ א בלתי מופנה מצדפות פסיפיק

גלה סרטונים נוספים