וירוטסט, נקודת שימוש לאיתור וירוסים בדגימות מים

וירוסים אנטיים נמצאים בעיקר במאגרים ימיים שונים, כולל מי תהום, מים שקטים, נחלים, נהרות ומים r. הם קשורים עם סיכונים בריאותיים אחראים לזיהומים בבני אדם. וירוסים אנטריים גורמים בדרך כלל לגסטרואנטריטיס ומועברים בעיקר דרך המסלול הצואה-אוראלי.

מחלות אחרות המועברות במים גורמות לצהבת חריפה על ידי נגיף הפטיטיס A ווירוסי הפטיטיס E, עם תמותה קשורה משמעותית במיוחד לגבי הפטיטיס E אצל נשים בהריון. פרוטוקולים בפועל לניטור איכות המים המוצעים להקשרים הומניטריים תוכננו כדי לשמור על חיידקים כגון E.Coli כאינדיקטור לזיהום צואה. אבל זה כבר ידוע כי אין מתאם עם מיקרואורגניזמים אחרים כגון וירוסים כי הם עמידים יותר לתהליכי הפעלה רבים.

עד כה, זיהוי וירוסים במסגרות משבר הומניטרי בוצע על ידי התאמת הפרוטוקולים הקיימים לתנאי הקשרים אלה, ומשלוח דגימות למעבדות ייחוס לגילוי מולקולרי של וירוסים. יש צורך בשיטות לגילוי פתוגנים ויראליים ואינדיקטורים ויראליים בנקודת המבט כדי להפחית את הסיכונים לבריאות הציבור, למנוע התפרצויות ולהגדיל את היעילות של התערבויות הומניטריות. אנו מציעים שיטה לגילוי וירוסים בדגימות מים באורך 10 ליטר המחולקת לשלושה שלבים: ריכוז ויראלי, מיצוי חומצת גרעין וזיהוי ויראלי.

כל השלבים הללו הותאמו משיטות הנמצאות כיום בשימוש במעבדה שלנו, ו ניתן לבצעם בנקודת המבט באמצעות רייגנטים וציוד ניידים, המייצרים את התלויים באספקת החשמל ובמקפיאים. כמו כן, נוספה לשיטה פתרון משמר המצדיק את יציבות חומצות הגרעין למשלוח למעבדות ייחוס במידת הצורך. השיטה שאנו מציעים נקראת VirWaTest ופותרה בשיתוף GenIUL ואינטרמון אוקספם.

לפני תחילת, יש לשקול את מספר הדגימות שיש לבדוק להכנת רייגנטים וחומרים. מומלץ לאסוף שני שכפולים של כל דגימת מים על מנת להשיג תוצאות מייצגות. ניתן לבדוק מספר דגימות בו זמנית אם כמות החומר המתאימה זמינה.

יש להכין חומרים וריג'ים לפני שהם מועברים או נשלחים למקום שבו נדרשת השיטה. רשימת החומרים והציוד הקטן שיש לארוז מתוארת בטבלה 1. הכן מלאי MS2 בקטריופאג' להתווסף לכל דגימת מים כבקרת תהליך על ידי ביצוע שיטת ISO המתאימה.

לאחר מכן להפיץ 10 microliters של השעיה המכיל 10 עד 10 יחידות platforming מראש עשה לתוך צינורות 10 מ"ל ולתת את המים להתייבש. יהיה צורך בצינור אחד לכל דגימת מים. בנוסף, להכין צינור אחד המכיל 10 mLs של מים מזוקקים סטריליים לכל מדגם שנאסף.

לתסכת החלב הרפרוף שהועתק מראש, הכינו צינור המכיל את החלב הרפוי, שקית ניילון רוכסן המכילה את מלח הים ובקבוק פלסטיק המכיל את המים המזוקקים. להתאמת חומציות, הכינו צינור המכיל את חומצת לימון, צינור המכיל את הנתרן הידרוקסיד, ושני מיכלי פלסטיק עם 25 ו -50 מ"ל של מים מזוקקים. כדי שכל דגימת מים תיבדק, הכינו שקית מיזוג על ידי הוספת מלחי הים וחומצת לימון לשקית ניילון רוכסן, ותמיסת שימור על ידי הוספת מאגר התיזה, וחומר משמר חומצת גרעין, לצינור 5 מ"ל.

לבסוף, להכין ארבעה שקיות נטרול, הוספת חומר ניקוי כוח לארבע שקיות פלסטיק רוכסן. כדי שכל דגימת מים תחולק, הכינו צינור אחד של חמישה מ"ל המכיל חלקיקים מגנטיים ואתנול, ושלושה צינורות 2 מ"ל המכילים 500, 600 ו-200 מיקרוליטר של מאגרי כביסה אחד, שניים ושלושה, בהתאמה, וצינור אחד המכיל חיץ אלוטיון. שתי עקירות שונות של חומצות גרעין ניתן לנתח בו זמנית בכל מבחן PCR אם נעשה שימוש בתרמוציקלר ניואל.

לכל בדיקות PCR, הכינו מי ביולוגיה מולקולרית. הכינו מיקסים המכילים שני פריימרים והוכחה אחת ספציפית לכל וירוס מטרה בהתאם לנפחים ולריכוזים המתוארים בפרוטוקול. עבור כל וירוס, להוסיף את הנפחים שצוינו לתוך צינורות אחד עד שמונה של מגש צינורות.

חותכים את הרצועה, מחלקים אותה לשתי רצועות. צינורות 1 עד 5 וצינורות 6 עד 8. עבור כל וירוס, מתלי DNA יבשים אוויר המכילים 10 עד 5, 10 עד 7, ו 10 עד 9 ועותקים ידועים שנעשו מראש לצינורות שש, שבע ושמונה.

פרוטוקול ריכוז זה מבוסס על העיקרון של flocculation אורגני שבו pH נמוך ומצב מוליכות גבוהה מניע את חלבוני חלב רזה להתארגן flocs הנגיפים לספוג. לאחר flocs הם התיישבו, הם יכולים להיות שנאספו בקלות. לאסוף דגימת מים 10 ליטר בדלי שטוח התחתון מסופק עם מכסה.

אם אוספים מצינור, תן למים לרוץ במשך כמה שניות לפני איסוף המים. חשוב להשתמש בדליים ברורים כדי לדמיין כדורי. חפשו חלל שטוח במקום רענן הרחק מאור שמש ישיר שים ערבוב מגנטי המחובר לסוללה מתחת לתמיכה בדלי והניח את הדלי המכיל את דגימת המים על כל תמיכה.

לשקול מחדש את חומצת לימון ואת נתרן הידרוקסיד לנער עד שהם מומסים לחלוטין. יוצקים 500 מ"ל של מים מזוקקים לתוך שקית סטנד-אפ ומ מניחים את השקית על בוחש מגנטי. מוסיפים את תכולת שקית מלח הים ואת תכולת צינור חלב דל שומן אחד ומערבבים במשך חמש דקות במהירות בינונית.

התאימו את ה-pH של חלב הרזה באמצעות חומצת לימון ונתרן הידרוקסידי ל-pH בין 3.4 ל-3.6. מכבים את המערבב המגנטי ומוודאים שה-flocs גלויים. פנס עשוי לסייע בהדמיית הפלוקים.

זרוק מגנט ערבוב לתוך המים. קבעו את המערבב המגנטי במהירות המרבית והפעילו אותו. הוסף 10 mLs של מים מזוקקים לצינור מבוקר תהליך.

להפוך אותו כמה פעמים ויוצקים את הפתרון לתוך המים. יוצקים את תכולת שקית מיזוג הדגימה למים ומערבבים במשך חמש דקות. ודא את ה- pH של דגימת המים, אשר צריך להיות בין 3.4 ו 3.6.

התאם את ה- pH במידת הצורך. מוסיפים 100 מ"ל של תותב חלב דל שומן מראש, לאטום את הדלי עם המכסה ולהשאיר את המים תוך ערבוב במשך שמונה שעות במהירות מינימלית. לאחר שמונה שעות, לכבות את stirrer מגנטי ולאפשר flocs להתיישב לפחות חמש שעות נוספות.

עם מערכת המבוססת על שימוש בבקר פיפטה, צינור פלסטיק, וכמה פיפטים, להשליך את supernatant, דואג לא להפריע flocs על קרקעית הדלי. כאשר מפלס המים עומד להגיע למגנט המרגש, לסחוט את צינור הפלסטיק כדי לעצור את זרימת המים ולהרחיק את פיפטה מן הדלי. מנערים את הדלי כדי למחזר את הלוקים ויוצקים אותם לתוך שקית ניילון בסטנד-אפ.

אפשרו ל-flocs להסתפק בשעה נוספת. בזהירות שאף את המים על טבעי באמצעות פיפטה הימנעות להפריע flocs. שאף את flocs באמצעות פיפטה ולהעביר אותם לתוך צינור חרוט.

שימו לב לנפח הסופי של ריכוז הדגימה והעברת 1 מ"ל לצינור המכיל את הפתרון המשמר. ההשעיה יכולה לשמש לביצוע מיצוי חומצת הגרעין בשטח, או למשלוח למעבדת ייחוס לניתוח נוסף. יש לטפל במים שהושלכו בעת איסוף הלוקים לפני סילוקם.

מוסיפים את תכולת שקית חומר הנטרול לדלי המכיל את המים שהושלכו. מערבבים את המים ומשאירים אותם למשך 30 דקות. ואז להיפטר המים מטופלים כמו פסולת כללית.

החלקיקים המגנטיים יכולים להיות מועברים מצינור אחד לאחר באמצעות פיפטה מגנטית. להתרגל לפעולה של פיפטה מגנטית לפני ביצוע החילוץ. מסדרים את הצינורות המכילים את הריג'נט הנדרש לחילוץ במדף.

כלומר, משמאל לימין:מאגר כריכה, מאגרי כביסה ומאגר אלוטיון. מעבירים 1 מ"ל של תרכיז מדגם לצינור המכיל את מאגר הכריכה באמצעות פיפטה פלסטיק חד פעמית. להפוך את הצינור עשר פעמים כדי לייעל את הפתרון.

הדגירה את הפתרון בטמפרטורת החדר במשך עשר דקות תוך ערבוב רציף או באמצעות מסלול סולו או באופן ידני. לאסוף את החלקיקים המגנטיים באמצעות פיפטה מגנטית וקצה נקי שניתן לעשות בו שימוש חוזר עבור שלושת מאגרי הכביסה ולשחרר את החלקיקים המגנטיים לתוך הצינור המכיל חיץ כביסה אחד. לשטוף אותם על ידי בעדינות לנער את הפתרון עם הקצה במשך שלושים שניות ולאסוף אותם.

חזור על הליך כביסה זה עבור מאגרי כביסה 2 ו-3. לאסוף את החלקיקים המגנטיים במאגר כביסה שלוש ולשחרר אותם לתוך הצינור המכיל את מאגר elution. ואז להשליך את הקצה.

הדגירה את הפתרון בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות תוך ערבוב רציף באמצעות מסלול סולו. החלף את הקצה על פיפטה מגנטית על ידי כל אחד ולאסוף את כל החלקיקים המגנטיים ממאגר elution. השלך את הקצה עם החלקיקים המחוברים.

חומצת הגרעין נשארת במאגר האלוטיון, אשר צריך להיות מאוחסן לניתוח נוסף או משלוח. השתמש חמש צינורות ורצועה שלוש צינור מוכן לזהות אדנווירוסים אנושיים. הוסף מים, PCR לערבב, תוספת חומצה גרעינית צינורות אחד עד חמש על פי הפרוטוקול.

לאחר מכן, להוסיף מים PCR לערבב צינורות שש עד שמונה. שים את שתי הרצועות בתרמוציקלר ובחר את הריצה המתאימה. לאחר סיום הריצה, לאסוף את התוצאות ולנתח נתונים שהושגו.

רק כאשר בדיקות ויראליות גרמו שלילי, זיהוי MS2 צריך להתבצע. השתמש ברצועות צינור שהוכנו לזיהוי MS2 ובחר את הפרופיל התרמי המתאים עבור PCR. מיצוי חומצת הגרעין המגנטית VirWaTest הושווה QIAgen RNA ויראלי, חיקה אותו על ידי בדיקת דגימות מים זינק עם אדנווירוסים אנושיים MS2.

בדיקת הפחתה p-value מראה התאוששות ויראלית גבוהה משמעותית באמצעות VirWaTest מאשר QiAgen כשיטת מיצוי עבור שני הווירוסים שנבדקו. השיטה שפותחה לריכוז ויראלי נבדקה בשטח בשיתוף צוותי שטיפת אוקספם הממוקמים בבנגוי, הרפובליקה המרכז אפריקאית ובפדרנאלס, אקוודור, שאספו דגימות מים, ריכזו אותן על ידי יישום שיטת הריכוז המפותחת, ושלחו אותן למעבדה בברצלונה להפקת חומצות גרעין וכימות ויראלי. באקוודור התגלו אדנווירוסים אנושיים בכל הדגימות שנבדקו, בעוד שדגימות אחת מתוך חמש שנאספו והתרכזו בבנגוי נמצאו חיוביות לאדנווירוסים אנושיים.

השיטה שפותחה הוכיחה להיות שימושי כאשר הוא הוערך על ידי צוותי לשטוף של Oxfam Intermon בבנגוי, הרפובליקה המרכז אפריקאית ועל ידי צוות אחר Pedernales, אקוודור. VirWaTest עשוי להיות חלק מערכת התראה מוקדמת או עשוי לשמש בחקירת התפרצות על ידי ארגונים המעורבים בתברואה מים. ציוד זה מקל על ניתוח פתוגנים נגיפיים במים ושיפור ניהול בטיחות המים במטרה לצמצם תקריות של מחלות ויראליות בהקשרים של משבר הומניטרי.