Name: וירוטסט, נקודת שימוש לאיתור וירוסים בדגימות מים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 32 s
Description: למד את שיטת VirWaTest לזיהוי נגיפי מעיים בדגימות מים באמצעות ריכוז חלבוני וחילוץ חומצות נוקליאיות. שיטה זו מציעה פתרון נייד וחסכוני לניטור איכות מים בהקשרים הומניטריים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

וירוטסט היה פרויקט מחקר במימון תוכנית HIF (קרנות חדשנות הומניטארית) של ELHRA (שיפור הלמידה & מחקר לסיוע הומניטארי). המחברים מכירים בצוותי השטיפה שיתפו פעולה באדיבות במחקר זה. הניתוח של דגימות באקוודור המומן על ידי אוקספם אקוודור והבימוי הטוב ביותר באוניברסיטה דה לאס אמריקאס (AMB). BRT. 17.01). S. Bofill-Mas הוא בחור סרה-צייד באוניברסיטת ברצלונה.

<ol><li>The Sphere Project. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22The+Sphere+Project%3A+Humanitarian+Charter+and+Minimum+Standards+in+Humanitarian+Response%22">The Sphere Project: Humanitarian Charter and Minimum Standards in Humanitarian Response</a>. , Practical Action Publishing. Rugby, UK. https://www.spherestandards.org/wp-content/uploads/2018/06/Sphere_Handbook_2011_English.pdf (2011).</li>
<li>Bartram, J., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBartram%2C+J+%22Water+Safety+Plan+Manual%3AStep-by-step+risk+management+for+drinking-water+suppliers%22">Water Safety Plan Manual:Step-by-step risk management for drinking-water suppliers</a>. , WHO Press. Geneva, Switzerland. http://apps.who.int/iris/handle/10665/75141 (2009).</li>
<li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Guidelines+for+Drinking-water+Quality%22">Guidelines for Drinking-water Quality</a>. , WHO Press. Geneva, Switzerland. http://whqlibdoc.who.int/publications/2011/9789241548151_eng.pdf?ua=1 (2011).</li>
<li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%2225+Years+Progress+on+Sanitation+and+Drinking+Water%22">25 Years Progress on Sanitation and Drinking Water</a>. , WHO Press. Geneva, Switzerland. http://apps.who.int/iris/bitstream/10665/177752/1/9789241509145_eng.pdf?ua=1 (2015).</li>
<li>Girones, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+detection+of+pathogens+in+water+-+The+pros+and+cons+of+molecular+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Research%22%5BJournal%5D)">Molecular detection of pathogens in water - The pros and cons of molecular techniques.</a> Water Research. 44 (15), 4325-4339 (2010).</li>
<li>Rodriguez-Manzano, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standard+and+new+fecal+indicators+and+pathogens+in+sewage+treatment+plants%2C+microbiological+parameters+for+improving+the+control+of+reclaimed+water%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Science+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Standard and new fecal indicators and pathogens in sewage treatment plants, microbiological parameters for improving the control of reclaimed water.</a> Water Science and Technology. 66 (12), 2517-2523 (2012).</li>
<li>Puig, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+adenoviruses+and+enteroviruses+in+polluted+waters+by+nested+PCR+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Detection of adenoviruses and enteroviruses in polluted waters by nested PCR amplification.</a> Applied and Environmental Microbiology. 60 (8), 2963-2970 (1994).</li>
<li>Carter, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enterically+infecting+viruses%3A+Pathogenicity%2C+transmission+and+significance+for+food+and+waterborne+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Enterically infecting viruses: Pathogenicity, transmission and significance for food and waterborne infection.</a> Journal of Applied Microbiology. 98 (6), 1354-1380 (2005).</li>
<li>Bofill-Mas, S., Pina, S., Girones, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Documenting+the+epidemiologic+patterns+of+polyomaviruses+in+human+populations+by+studying+their+presence+in+urban+sewage%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Documenting the epidemiologic patterns of polyomaviruses in human populations by studying their presence in urban sewage.</a> Applied and Environmental Microbiology. 66 (1), 238-245 (2000).</li>
<li>Bofill-Mas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+and+stability+of+human+adenoviruses+and+polyomavirus+JCPyV+in+wastewater+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Quantification and stability of human adenoviruses and polyomavirus JCPyV in wastewater matrices.</a> Applied and Environmental Microbiology. 72 (12), 7894-7896 (2006).</li>
<li>Rames, E., Roiko, A., Stratton, H., Macdonald, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technical+aspects+of+using+human+adenovirus+as+a+viral+water+quality+indicator%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Research%22%5BJournal%5D)">Technical aspects of using human adenovirus as a viral water quality indicator.</a> Water Research. 96, 308-326 (2016).</li>
<li>Calgua, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+application+of+a+one-step+low+cost+procedure+to+concentrate+viruses+from+seawater+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Development and application of a one-step low cost procedure to concentrate viruses from seawater samples.</a> Journal of Virological Methods. 153 (2), 79-83 (2008).</li>
<li>Bofill-Mas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cost-effective+method+for+microbial+source+tracking+using+specific+human+and+animal+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Cost-effective method for microbial source tracking using specific human and animal viruses.</a> Journal of Visualized Experiments. 58, 5-9 (2011).</li>
<li>International Organization for Standardization. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22ISO+10705-1%3A1995%3A+Water+quality+-+Detection+and+enumeration+of+bacteriophages+-+Part+1%3A+Enumeration+of+F-specific+RNA+bacteriophages%22">ISO 10705-1:1995: Water quality - Detection and enumeration of bacteriophages - Part 1: Enumeration of F-specific RNA bacteriophages</a>. , https://www.iso.org/standard/18794.html (1995).</li>
<li>Hernroth, B. E., Conden-Hansson, A. C., Rehnstam-Holm, A. S., Girones, R., Allard, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+factors+influencing+human+viral+pathogens+and+their+potential+indicator+organisms+in+the+blue+mussel%2C+Mytilus+edulis%3A+the+first+Scandinavian+report%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Environmental factors influencing human viral pathogens and their potential indicator organisms in the blue mussel, Mytilus edulis: the first Scandinavian report.</a> Applied and Environmental Microbiology. 68 (9), 4523-4533 (2002).</li>
<li>Pecson, B. M., Martin, L. V., Kohn, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+PCR+for+determining+the+infectivity+of+bacteriophage+MS2+upon+inactivation+by+heat%2C+UV-B+radiation%2C+and+singlet+oxygen%3A+Advantages+and+limitations+of+an+enzymatic+treatment+to+reduce+false-positive+results%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Quantitative PCR for determining the infectivity of bacteriophage MS2 upon inactivation by heat, UV-B radiation, and singlet oxygen: Advantages and limitations of an enzymatic treatment to reduce false-positive results.</a> Applied and Environmental Microbiology. 75 (17), 5544-5554 (2009).</li>
<li>Calgua, B., Barardi, C. R. M., Bofill-Mas, S., Rodriguez-Manzano, J., Girones, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+quantitation+of+infectious+human+adenoviruses+and+JC+polyomaviruses+in+water+by+immunofluorescence+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Detection and quantitation of infectious human adenoviruses and JC polyomaviruses in water by immunofluorescence assay.</a> Journal of Virological Methods. 171 (1), 1-7 (2011).</li>
<li>Bofill-Mas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cost-effective+method+for+microbial+source+tracking+using+specific+human+and+animal+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Cost-effective method for microbial source tracking using specific human and animal viruses.</a> Journal of Visualized Experiments. (58), e2820(2011).</li>
<li>Gonzales-Gustavson, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+efficiency+and+uncertainty+of+skimmed+milk+flocculation+for+the+simultaneous+concentration+and+quantification+of+water-borne+viruses%2C+bacteria+and+protozoa%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">Characterization of the efficiency and uncertainty of skimmed milk flocculation for the simultaneous concentration and quantification of water-borne viruses, bacteria and protozoa.</a> Journal of Microbiological Methods. 134, 46-53 (2017).</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

השיטה VirWaTest מאפשרת ריכוז של וירוסים וחומצות גרעין החילוץ מדגימות מים בנקודת השימוש על ידי משתמשים לא מנוסים. זהו פרוטוקול זול, מהיר ופשוט. הריכוז מבוסס על העיקרון של החיסון האורגני באמצעות חלב, שדרכו מצבם של ה-pH הנמוכים והמוליכות הגבוהה הופכים את חלבוני החלב הניגנב לתוך הרמה הנמוכה ביותר של וירוסים ספוח. כאשר המשקע משקע, קל לאסוף אותם, מה שמאפשר להתרכז 10 L של מים, ואילו הקשר המסורתי מסורתי לא יכול להתמודד עם כמויות גדולות של מים.
השיטה שונתה להיות מעשית בנקודת הדגימה מבלי להשתמש בציוד חש...

במהלך השלבים הראשונים של החירום ההומניטרי, גישה לאספקת מים נקיים, תברואה והיגיינה הם קריטיים להישרדות של אלה המושפעים. לכן, הניטור איכות המים הוא בעדיפות כדי למנוע התפרצויות המועברות במים. זה ידוע כי מים מזוהמים הוא לעתים קרובות מקור המחלות, אבל לעתים קרובות קשה לקבוע את המקורות של התפרצויות ויראלי כגון וירוס הפטיטיס (הכבד), אפילו עם זמינות של שיטות מעבדה קונבנציונאלי. השליטה על איכות המים מבוססת על כימות השקר1,2,3,4. עם זאת, הוא תועד בהרחבה כי אין מתאם בין העדר פרפור ונוכחות של פתוגנים מים ויראלי כגון רוטוירוס (רוב), norovirus (NoV), או מת5,6. לכן, שימוש בקריטריון איכות המים המבוססת על פרפור עלול לגרום להערכת הסיכונים הקשורים לנוכחות של פתוגנים ויראלי מים. מעקב אחר וירוסי מחוון, כגון אדנוירוסים אנושיים (hadv), או פתוגנים ספציפיים יהיה מועיל להגדיר את החשיפה לפתוגנים נגיפי וזיהוי המקור הפוטנציאלי של זיהום אנושי7,8, 9,10 ובאימות היעילות. של אמצעי התברואה11
עד עכשיו, גילוי של וירוסים בתרחישים אלה הסתמך על צוות מיומן ולוגיסטיקה מורכבת. VirWaTest (virwatest.org) מיועדת לפיתוח של שיטה פשוטה, במחיר נוח ונייד לריכוז ואיתור בעקבות וירוסים מדגימות המים בנקודת השימוש.
הריכוז וירוס מבוסס על העיקרון של לוקליזציה אורגנית של 10 L דגימות מים, אשר וירוסים משוחזרים בכרכים קטנים יותר12,13. Flocs נאספים והוסיף מאגר כי lyses וירוסים ומונע את חומצות גרעין מן השפלה כאשר הם מאוחסנים בטמפרטורת החדר עבור לא יותר מ 2 שבועות.
שיטת החילוץ חומצת גרעין מבוססת על השימוש חלקיקים מגנטיים שאליהם חומצות גרעין לקבל adsorbed. הם יכולים להיות מועברים ממאגר כביסה אחד למשנהו ולבסוף לתוך מאגר להתחמק על ידי שימוש בצנרת מגנטית אשר החלקיקים לצרף. נגיפי חומצות גרעין ויראלי שהושגו ניתן לשלוח למעבדת התייחסות שבה ניתן לבצע איתור באמצעות שיטות מולקולריות המבוססות על ה-PCR. עבור כל הפקת חומצת גרעין, שתי כמויות שונות נבדקו כדי לשלול עיכוב אנזימטי מקורו על ידי המדגם. לחילופין, עם זמינות מינימלית לציוד, ניתן להפעיל בדיקות PCR בנקודת השימוש. התהליך כולו נועד להתבצע באופן עצמאי מספק כוח (איור 1).
שיטת ה-PCR הכמותית לזיהוי האדב, המופרשת על-ידי בני אדם ונמצאה בדגימות שפכים בריכוזים גבוהים, הותאמה להפעלה בנקודת השימוש. HAdV משמשות כאינדיקטורים ויראליים אנושיים. ה-PCR לקוונפיקציה של MS2 בקטביאג כבר הותאם מאז MS2 משמש ב-VirWaTest כבקרת תהליך. ניתן להתאים אישית את השיטה לאיתור כל וירוס מעניין.
לאחר פיתוח, השיטה VirWaTest הוחלה על ידי המשתמשים בשתי הגדרות שונות ברפובליקת מרכז אפריקה (RCA) ואקוודור, מתן משוב על יישום הפרוטוקול במצבים אמיתיים.
לידיעתך, זהו הנוהל הראשון המאפשר ריכוז ואיתור של וירוסים בנקודת השימוש, ללא תלות בכל ספק כוח, ציוד גדול, ותנאי הקפאה/קירור. מומלץ לאסוף שתי משכפל של כל דגימת מים כדי להשיג תוצאות חזקות.

<table><tbody><tr><td>5x HOT FIREPol Probe qPCR Mix Plus (ROX)</td><td>Solis BioDyne</td><td>08-14-00001</td><td>כולל 5x HOT FIREPol Probe qPCR Mix Plus של Solis Biodyne (תערובת qPCR), 50 תגובות</td></tr><tr><td>8 רצועות מיקרו-צינורות עם כובעים</td><td>dD Biolab</td><td>840637</td><td>פרופיל נמוך, קירות דקים, מותאמים לסוללות PCR כמותיות ואיכותיות</td></tr><tr><td>ומתאמי מתח לבוחש מגנטי</td><td>GenIUL</td><td>900011674</td><td>כולל מתח לרכב 12V מתאם</td></tr><tr><td>תמיכת דלי</td><td>GenIUL</td><td>900011648</td> דלי <td>תמיכת אלומיניום</td></tr><tr><td>, 10 ליטר</td><td>Cater4You</td><td>10LTR</td><td>פוליפרופילן, עמיד בפני חבלה,</td></tr><tr><td>צינור צנטריפוגה בצבע שקוף, 50 מ"ל</td><td>LabBox</td><td>CTSP-E50-050</td><td>פוליפרופילן, סטרילי, בוגר, עם חצאית</td></tr><tr><td>חומצת לימון 1-הידרט, 500 גרם</td><td>PanReac AppliChem</td><td>1410181211</td><td>טהור, דרגת פארמה, 1 קילוגרם</td></tr><tr><td>בקבוק PET שקוף</td><td>LabBox</td><td>FPET-500-088</td><td>צבע שקוף, PET, פקק אינו כלול</td></tr><tr><td>חלב רזה Difco, 500 גרם</td><td>Becton Dickinson</td><td>232100</td><td>מגן</td></tr><tr><td>DNA/RNA מיובש, 250 מ"ל</td><td>Zymo Research</td><td>R1100-250</td><td>מדיום שימור DNA/RNA, 250 מ"ל</td></tr><tr><td>בקר פיפטה Easy9 LabBox</td><td></td><td>EAS9-001-001</td><td>0.3 &mu; מסנן m, פיפטות מ-0.1 עד 100 מ"ל, מחזיק פיפטה סיליקון הניתן לחיטוי</td></tr><tr><td>צינור אפנדורף, 0.5 מ"ל</td><td>אפנדורף</td><td>0030121023</td><td>פוליפרופילן,</td></tr><tr><td>צינור אפנדורף נעילה בטוחה, 2 מ"ל</td><td>אפנדורף</td><td></td><td>0030120094 פוליפרופילן,</td></tr><tr><td>צינור אפנדורף נעילה בטוחה, 5 מ"ל</td><td>dD Biolab</td><td>999542</td><td>פוליפרופילן, סטרילי,</td></tr><tr><td>אתנול מדורג 96% V/V, 1 ליטר</td><td>Panreac AppliChem</td><td>361085-1611</td> עבור פינצטה מעבדה <td>UV, IR&nbsp; ו-HPLC</td></tr><tr><td></td><td>LabBox</td><td>FORS-007-002</td><td>קצה דק, מעוקל, L= 120 מ"מ</td></tr><tr><td>מערבל מגנטי</td><td>GenIUL</td><td>900017000</td> סמן <td>מופעל על ידי סוללה</td></tr><tr><td></td><td>dD Biolab</td><td>929203</td><td>שחור, קצה עדין במיוחד, עמיד במים, ייבוש מהיר, לפלסטיק וכלי זכוכית</td></tr><tr><td>מיקרו רוטה-מתלה למיקרו-צינורות</td><td>dD Biolab</td><td>37782</td><td>4 מודולים, אורך x רוחב x גובה = 208 x 100 x 100 מ"מ</td></tr><tr><td>Mini8 PCR בזמן אמת Cycler</td><td>Coyote Biosciences, סין</td><td>Mini-8</td><td>נייד, עובד עם ספקי כוח 12V או סוללות חיצוניות, שני ערוצים, קיבולת ל-8 צינורות</td></tr><tr><td>NucliSens Lysis Buffer</td><td>Biomerieux</td><td></td><td>200292 ריאגנטים לעד 48 בידודים, אחסן בטמפרטורת הסביבה</td></tr><tr><td>פיפטה סרולוגית עם קצה פתוח, 10 מ"ל</td><td>Deltalab</td><td>900136N</td><td>סטרילי, עטוף בנפרד (נייר / פלסטיק)</td></tr> <tr><td>מכסה בורג PE PP28</td><td>LabBox</td><td>TP28-004-020</td><td>לבקבוקי PET</td></tr><tr><td>רצועת מחוון pH</td><td>LabBox</td><td>WSPH-001-001</td><td>טווח pH 2.8 עד pH 4.4, 50 רצועות לחבילה</td></tr><tr><td>מבחנה מפלסטיק</td><td>Quimikals</td><td>300913</td><td>כולל מכסה</td></tr><tr><td>פוליאתילן פסטר פיפטה</td><td>LabBox</td><td>PIPP-003-500</td><td>בוגר, 7 מ"ל נפח כולל, </td></tr><tr><td>בקבוק בורג פוליפרופילן לא סטרילי עם מכסה בורג,</td> מכסה בורג <td>Deltalab</td><td>409726</td> 150 מ"ל, <td>סטרילי, מדורג עד 100 מ"ל</td></tr><tr><td>בקבוק בורג פוליפרופילן עם מכסה בורג, 60 מ"ל</td><td>Deltalab</td><td>409526G</td><td>מכסה בורג, סטרילי, מדורג עד 50 מ"ל</td></tr><tr><td>אבקת אבקת חומר ניקוי</td> <td>-</td><td></td> <td>סבון אבקה רגיל לשטיפת בגדים</td></tr><tr><td>כבלי חשמל למערבל מגנטי</td><td>GenIUL</td><td></td><td>900011692 חיבור בין סוללות לבוחשים מגנטיים</td></tr><tr><td>QuickPick כלי מגנטי</td><td>BioNobile</td><td>24001</td><td>כלי כף יד לחלקיקים מגנטיים</td></tr><tr><td>טיפים לאיסוף מהיר בקופסה</td><td>BioNobile</td><td>24296</td><td>RNase, חיטוי, 96 יחידות</td></tr><tr><td>QuickPick XL gDNA חלקיקים מגנטיים</td><td>BioNobile</td><td></td><td>SN51100 3.2 מ"ל</td></tr><tr><td>מלחי ים</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>S9883-500G</td><td>תערובת מלח מלאכותית הדומה מאוד להרכב המלחים המומסים של מי האוקיינוס</td></tr><tr><td>צינורות סיליקון</td><td>LabBox</td><td>SILT-006-005</td><td>גליל של 5 מטרים, פנימי&nbsp; &oslash; x חיצוני&nbsp; &oslash;= 6 x 10 מ"מ</td></tr><tr><td>כדורי נתרן הידרוקסיד, 98.5 - 100.5%</td> <td>כדורי 28244295 כימיקלים VWR</td><td></td><td>, 1 ק"ג</td></tr><tr><td>פלטפורמה סיבובית סולארית</td><td>SOL-EXPERT Group</td><td>70020</td><td>צלחת אקרילית, 10 סל"ד, תומכת בעד 300 גרם</td></tr><tr><td>SOLIScript ערכת בדיקה חד-שלבית</td><td>Solis BioDyne</td><td>08-57-00250</td><td>כוללת את 5x One-Step Probe Mix של Solis Biodyne (qPCR Mix) ו-40x One-Step SOLIScript Mix (אנזים טרנסקריפטאז הפוך), 250 תגובות</td></tr><tr><td>SPEEDTOOLS ערכת מיצוי וירוס RNA</td><td>BioTools</td><td>21.141-4197</td><td>כולל מאגר BAW של BioTools (מאגר כביסה 1), מאגר BAV3 (מאגר כביסה 2 ו-3) ומאגר BRE (מאגר</td></tr> סילוק).<tr><td>SpinBar מגנט ערבוב אוקטהדרלי</td><td>dD Biolab</td><td>045926</td><td>טבעת ציר, L x&nbsp; &oslash; = 38 x 8 מ"מ,</td></tr><tr><td>פיפטה סרולוגית עם קצה סרט כחול, 10 מ"ל</td><td>Deltalab</td><td>PN10E1</td><td>סטרילי, עטוף בנפרד (נייר/פלסטיק)</td></tr> <tr><td>פיפטה סרולוגית עם קצה סרט, 50 מ"ל</td><td>Deltalab</td><td>900043</td><td>סטרילי, עטוף בנפרד (נייר/פלסטיק)</td></tr> <tr><td>Termi-DNA-Tor - מסיר</td> <td>חומצות גרעיןBioTools</td><td>22001-4291</td><td>מסיר חומצות גרעין, חיידקים, פטריות ומיקופלזמה מחומר ומשטחים, 450 מ"ל</td></tr><tr><td>מגיב לביולוגיה מולקולרית של מים, 1L</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W4502-1L</td><td>ללא נוקלאז ופרוטאז, 0.1 &mu; m שקית</td></tr><tr><td>Whirl-Pak מסוננת, 540 מ"ל</td><td>Deltalab</td><td>200361</td><td>תיק רגיל תחתון יציב</td></tr><tr><td></td><td>LabBox</td><td>BZIP-080-100</td><td>פוליאתילן, L x W = 120 x 80 מ"מ</td></tr></tbody></table>

וירוטסט, נקודת שימוש לאיתור וירוסים בדגימות מים

VirWaTest, A Point-of-Use Method for the Detection of Viruses in Water Samples

וירוסים מופרשים על ידי בני אדם ובעלי חיים עלולים לזהם מקורות מים ולהוות סיכון לבריאות האדם כאשר מים זה משמש לשתייה, השקיה במזון, כביסה, וכו '. מחוון חיידקים בצואה קלאסית לא תמיד לבדוק את הנוכחות של פתוגנים ויראלי כך גילוי פתוגנים נגיפי אינדיקטורים נגיפי הוא רלוונטי כדי לאמץ מדדים של הקלה בסיכון, במיוחד בתרחישים הומניטאריים ובתחומים שבו התפרצויות ויראליות המועברות במים תכופים.
כיום, מספר בדיקות מסחריות המאפשרות כימות של חיידקים אינדיקטור צואה (פרפור) זמינים לבדיקה בנקודת השימוש. עם זאת, בדיקות מסחריות כאלה אינן זמינות לאיתור וירוסים. איתור וירוסים בדגימות מים סביבתיים דורש ריכוז של כמה ליטרים לתוך כרכים קטנים יותר. יתר על כן, לאחר מרוכז, זיהוי של וירוסים מסתמך על שיטות כגון הפקת חומצת גרעין וזיהוי מולקולרי (למשל, תגובת שרשרת פולימראז [PCR] מבוסס assays) של genomes ויראלי.
השיטה המתוארת כאן מאפשרת ריכוז של וירוסים מ 10 דגימות מים L, כמו גם את החילוץ של חומצות גרעין נגיפי בנקודת השימוש, עם ציוד פשוט ונייד. זה מאפשר בדיקות של דגימות מים בנקודת השימוש עבור מספר וירוסים והוא שימושי בתרחישים הומניטאריים, כמו גם בכל הקשר שבו מעבדה מצויד אינה זמינה. לחילופין, השיטה מאפשרת התמקדות בווירוסים המצויים בדגימות מים והובלת הריכוז למעבדה בטמפרטורת החדר לצורך ניתוח נוסף.

פיתוח שיטות
הליך זה פותח במעבדה של וירוסים מזהמים של מים ומזון עם שיתוף הפעולה של המלון. הוא כולל שלושה צעדים שונים. הראשון, ריכוז החלקיקים הנגיפי, הוא עיבוד של שיטת החלב המגנב שתוארה קודם לכן12,17,18. השיטה המקורית שונתה כדי להיות בלתי תלויה באספקת חשמל, פשוטה יותר וללא שלבים צנטריפוגה.
<p class="jove_content" fo:k...

כאן אנו מציגים את VirWaTest, המהווה שיטה פשוטה, במחיר סביר ונייד לריכוז ואיתור של וירוסים מדגימות המים בנקודת השימוש.

Viruses excreted by humans and animals may contaminate water sources and pose a risk to human health when this water is used for drinking, food ...

וירוסים אנטיים נמצאים בעיקר במאגרים ימיים שונים, כולל מי תהום, מים שקטים, נחלים, נהרות ומים r. הם קשורים עם סיכונים בריאותיים אחראים לזיהומים בבני אדם. וירוסים אנטריים גורמים בדרך כלל לגסטרואנטריטיס ומועברים בעיקר דרך המסלול הצואה-אוראלי.מחלות אחרות המועברות במים גורמות לצהבת חריפה על ידי נגיף הפטיטיס A ווירוסי הפטיטיס E, עם תמותה קשורה משמעותית במיוחד לגבי הפטיטיס E אצל נשים בהריון. פרוטוקולים בפועל לניטור איכות המים המוצעים להקשרים הומניטריים תוכננו כדי לשמור על חיידקים כגון E.Coli כאינדיקטור לזיהום צואה. אבל זה כבר ידוע כי אין מתאם עם מיקרואורגניזמים אחרים כגון וירוסים כי הם עמידים יותר לתהליכי הפעלה רבים.עד כה, זיהוי וירוסים במסגרות משבר הומניטרי בוצע על ידי התאמת הפרוטוקולים הקיימים לתנאי הקשרים אלה, ומשלוח דגימות למעבדות ייחוס לגילוי מולקולרי של וירוסים. יש צורך בשיטות לגילוי פתוגנים ויראליים ואינדיקטורים ויראליים בנקודת המבט כדי להפחית את הסיכונים לבריאות הציבור, למנוע התפרצויות ולהגדיל את היעילות של התערבויות הומניטריות. אנו מציעים שיטה לגילוי וירוסים בדגימות מים באורך 10 ליטר המחולקת לשלושה שלבים: ריכוז ויראלי, מיצוי חומצת גרעין וזיהוי ויראלי.כל השלבים הללו הותאמו משיטות הנמצאות כיום בשימוש במעבדה שלנו, ו ניתן לבצעם בנקודת המבט באמצעות רייגנטים וציוד ניידים, המייצרים את התלויים באספקת החשמל ובמקפיאים. כמו כן, נוספה לשיטה פתרון משמר המצדיק את יציבות חומצות הגרעין למשלוח למעבדות ייחוס במידת הצורך. השיטה שאנו מציעים נקראת VirWaTest ופותרה בשיתוף GenIUL ואינטרמון אוקספם.לפני תחילת, יש לשקול את מספר הדגימות שיש לבדוק להכנת רייגנטים וחומרים. מומלץ לאסוף שני שכפולים של כל דגימת מים על מנת להשיג תוצאות מייצגות. ניתן לבדוק מספר דגימות בו זמנית אם כמות החומר המתאימה זמינה.יש להכין חומרים וריג'ים לפני שהם מועברים או נשלחים למקום שבו נדרשת השיטה. רשימת החומרים והציוד הקטן שיש לארוז מתוארת בטבלה 1. הכן מלאי MS2 בקטריופאג' להתווסף לכל דגימת מים כבקרת תהליך על ידי ביצוע שיטת ISO המתאימה.לאחר מכן להפיץ 10 microliters של השעיה המכיל 10 עד 10 יחידות platforming מראש עשה לתוך צינורות 10 מ"ל ולתת את המים להתייבש. יהיה צורך בצינור אחד לכל דגימת מים. בנוסף, להכין צינור אחד המכיל 10 mLs של מים מזוקקים סטריליים לכל מדגם שנאסף.לתסכת החלב הרפרוף שהועתק מראש, הכינו צינור המכיל את החלב הרפוי, שקית ניילון רוכסן המכילה את מלח הים ובקבוק פלסטיק המכיל את המים המזוקקים. להתאמת חומציות, הכינו צינור המכיל את חומצת לימון, צינור המכיל את הנתרן הידרוקסיד, ושני מיכלי פלסטיק עם 25 ו -50 מ"ל של מים מזוקקים. כדי שכל דגימת מים תיבדק, הכינו שקית מיזוג על ידי הוספת מלחי הים וחומצת לימון לשקית ניילון רוכסן, ותמיסת שימור על ידי הוספת מאגר התיזה, וחומר משמר חומצת גרעין, לצינור 5 מ"ל.לבסוף, להכין ארבעה שקיות נטרול, הוספת חומר ניקוי כוח לארבע שקיות פלסטיק רוכסן. כדי שכל דגימת מים תחולק, הכינו צינור אחד של חמישה מ"ל המכיל חלקיקים מגנטיים ואתנול, ושלושה צינורות 2 מ"ל המכילים 500, 600 ו-200 מיקרוליטר של מאגרי כביסה אחד, שניים ושלושה, בהתאמה, וצינור אחד המכיל חיץ אלוטיון. שתי עקירות שונות של חומצות גרעין ניתן לנתח בו זמנית בכל מבחן PCR אם נעשה שימוש בתרמוציקלר ניואל.לכל בדיקות PCR, הכינו מי ביולוגיה מולקולרית. הכינו מיקסים המכילים שני פריימרים והוכחה אחת ספציפית לכל וירוס מטרה בהתאם לנפחים ולריכוזים המתוארים בפרוטוקול. עבור כל וירוס, להוסיף את הנפחים שצוינו לתוך צינורות אחד עד שמונה של מגש צינורות.חותכים את הרצועה, מחלקים אותה לשתי רצועות. צינורות 1 עד 5 וצינורות 6 עד 8. עבור כל וירוס, מתלי DNA יבשים אוויר המכילים 10 עד 5, 10 עד 7, ו 10 עד 9 ועותקים ידועים שנעשו מראש לצינורות שש, שבע ושמונה.פרוטוקול ריכוז זה מבוסס על העיקרון של flocculation אורגני שבו pH נמוך ומצב מוליכות גבוהה מניע את חלבוני חלב רזה להתארגן flocs הנגיפים לספוג. לאחר flocs הם התיישבו, הם יכולים להיות שנאספו בקלות. לאסוף דגימת מים 10 ליטר בדלי שטוח התחתון מסופק עם מכסה.אם אוספים מצינור, תן למים לרוץ במשך כמה שניות לפני איסוף המים. חשוב להשתמש בדליים ברורים כדי לדמיין כדורי. חפשו חלל שטוח במקום רענן הרחק מאור שמש ישיר שים ערבוב מגנטי המחובר לסוללה מתחת לתמיכה בדלי והניח את הדלי המכיל את דגימת המים על כל תמיכה.לשקול מחדש את חומצת לימון ואת נתרן הידרוקסיד לנער עד שהם מומסים לחלוטין. יוצקים 500 מ"ל של מים מזוקקים לתוך שקית סטנד-אפ ומ מניחים את השקית על בוחש מגנטי. מוסיפים את תכולת שקית מלח הים ואת תכולת צינור חלב דל שומן אחד ומערבבים במשך חמש דקות במהירות בינונית.התאימו את ה-pH של חלב הרזה באמצעות חומצת לימון ונתרן הידרוקסידי ל-pH בין 3.4 ל-3.6. מכבים את המערבב המגנטי ומוודאים שה-flocs גלויים. פנס עשוי לסייע בהדמיית הפלוקים.זרוק מגנט ערבוב לתוך המים. קבעו את המערבב המגנטי במהירות המרבית והפעילו אותו. הוסף 10 mLs של מים מזוקקים לצינור מבוקר תהליך.להפוך אותו כמה פעמים ויוצקים את הפתרון לתוך המים. יוצקים את תכולת שקית מיזוג הדגימה למים ומערבבים במשך חמש דקות. ודא את ה- pH של דגימת המים, אשר צריך להיות בין 3.4 ו 3.6.התאם את ה- pH במידת הצורך. מוסיפים 100 מ"ל של תותב חלב דל שומן מראש, לאטום את הדלי עם המכסה ולהשאיר את המים תוך ערבוב במשך שמונה שעות במהירות מינימלית. לאחר שמונה שעות, לכבות את stirrer מגנטי ולאפשר flocs להתיישב לפחות חמש שעות נוספות.עם מערכת המבוססת על שימוש בבקר פיפטה, צינור פלסטיק, וכמה פיפטים, להשליך את supernatant, דואג לא להפריע flocs על קרקעית הדלי. כאשר מפלס המים עומד להגיע למגנט המרגש, לסחוט את צינור הפלסטיק כדי לעצור את זרימת המים ולהרחיק את פיפטה מן הדלי. מנערים את הדלי כדי למחזר את הלוקים ויוצקים אותם לתוך שקית ניילון בסטנד-אפ.אפשרו ל-flocs להסתפק בשעה נוספת. בזהירות שאף את המים על טבעי באמצעות פיפטה הימנעות להפריע flocs. שאף את flocs באמצעות פיפטה ולהעביר אותם לתוך צינור חרוט.שימו לב לנפח הסופי של ריכוז הדגימה והעברת 1 מ"ל לצינור המכיל את הפתרון המשמר. ההשעיה יכולה לשמש לביצוע מיצוי חומצת הגרעין בשטח, או למשלוח למעבדת ייחוס לניתוח נוסף. יש לטפל במים שהושלכו בעת איסוף הלוקים לפני סילוקם.מוסיפים את תכולת שקית חומר הנטרול לדלי המכיל את המים שהושלכו. מערבבים את המים ומשאירים אותם למשך 30 דקות. ואז להיפטר המים מטופלים כמו פסולת כללית.החלקיקים המגנטיים יכולים להיות מועברים מצינור אחד לאחר באמצעות פיפטה מגנטית. להתרגל לפעולה של פיפטה מגנטית לפני ביצוע החילוץ. מסדרים את הצינורות המכילים את הריג'נט הנדרש לחילוץ במדף.כלומר, משמאל לימין:מאגר כריכה, מאגרי כביסה ומאגר אלוטיון. מעבירים 1 מ"ל של תרכיז מדגם לצינור המכיל את מאגר הכריכה באמצעות פיפטה פלסטיק חד פעמית. להפוך את הצינור עשר פעמים כדי לייעל את הפתרון.הדגירה את הפתרון בטמפרטורת החדר במשך עשר דקות תוך ערבוב רציף או באמצעות מסלול סולו או באופן ידני. לאסוף את החלקיקים המגנטיים באמצעות פיפטה מגנטית וקצה נקי שניתן לעשות בו שימוש חוזר עבור שלושת מאגרי הכביסה ולשחרר את החלקיקים המגנטיים לתוך הצינור המכיל חיץ כביסה אחד. לשטוף אותם על ידי בעדינות לנער את הפתרון עם הקצה במשך שלושים שניות ולאסוף אותם.חזור על הליך כביסה זה עבור מאגרי כביסה 2 ו-3. לאסוף את החלקיקים המגנטיים במאגר כביסה שלוש ולשחרר אותם לתוך הצינור המכיל את מאגר elution. ואז להשליך את הקצה.הדגירה את הפתרון בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות תוך ערבוב רציף באמצעות מסלול סולו. החלף את הקצה על פיפטה מגנטית על ידי כל אחד ולאסוף את כל החלקיקים המגנטיים ממאגר elution. השלך את הקצה עם החלקיקים המחוברים.חומצת הגרעין נשארת במאגר האלוטיון, אשר צריך להיות מאוחסן לניתוח נוסף או משלוח. השתמש חמש צינורות ורצועה שלוש צינור מוכן לזהות אדנווירוסים אנושיים. הוסף מים, PCR לערבב, תוספת חומצה גרעינית צינורות אחד עד חמש על פי הפרוטוקול.לאחר מכן, להוסיף מים PCR לערבב צינורות שש עד שמונה. שים את שתי הרצועות בתרמוציקלר ובחר את הריצה המתאימה. לאחר סיום הריצה, לאסוף את התוצאות ולנתח נתונים שהושגו.רק כאשר בדיקות ויראליות גרמו שלילי, זיהוי MS2 צריך להתבצע. השתמש ברצועות צינור שהוכנו לזיהוי MS2 ובחר את הפרופיל התרמי המתאים עבור PCR. מיצוי חומצת הגרעין המגנטית VirWaTest הושווה QIAgen RNA ויראלי, חיקה אותו על ידי בדיקת דגימות מים זינק עם אדנווירוסים אנושיים MS2.בדיקת הפחתה p-value מראה התאוששות ויראלית גבוהה משמעותית באמצעות VirWaTest מאשר QiAgen כשיטת מיצוי עבור שני הווירוסים שנבדקו. השיטה שפותחה לריכוז ויראלי נבדקה בשטח בשיתוף צוותי שטיפת אוקספם הממוקמים בבנגוי, הרפובליקה המרכז אפריקאית ובפדרנאלס, אקוודור, שאספו דגימות מים, ריכזו אותן על ידי יישום שיטת הריכוז המפותחת, ושלחו אותן למעבדה בברצלונה להפקת חומצות גרעין וכימות ויראלי. באקוודור התגלו אדנווירוסים אנושיים בכל הדגימות שנבדקו, בעוד שדגימות אחת מתוך חמש שנאספו והתרכזו בבנגוי נמצאו חיוביות לאדנווירוסים אנושיים.השיטה שפותחה הוכיחה להיות שימושי כאשר הוא הוערך על ידי צוותי לשטוף של Oxfam Intermon בבנגוי, הרפובליקה המרכז אפריקאית ועל ידי צוות אחר Pedernales, אקוודור. VirWaTest עשוי להיות חלק מערכת התראה מוקדמת או עשוי לשמש בחקירת התפרצות על ידי ארגונים המעורבים בתברואה מים. ציוד זה מקל על ניתוח פתוגנים נגיפיים במים ושיפור ניהול בטיחות המים במטרה לצמצם תקריות של מחלות ויראליות בהקשרים של משבר הומניטרי.

virwatest-point-use-method-for-detection-viruses-water

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

שיעור התחלופה של וירוסים במערכות ימיים מים מתוקים ניתן לאמוד על ידי ירידה וטכניקה הישנותם. הנתונים לאפשר לחוקרים להסיק ששיעורי התמותה וירוס בתיווך של חיידקים במערכות מים.

הערכת הפקה חליפין וירוס במערכות Aquatic

המחקר מתאר שיטה חסכונית לזיהוי מקור הזיהום צואה / שתן או זיהום חנקות במים באמצעות כימות qPCR עבור הספציפי של נגיפי DNA, adenoviruses אדם / חזירי / שור ו polyomaviruses, כפי שהוצע כלים MST.

חסכונית שיטת מעקב אחר מקור מיקרוביאלית באמצעות וירוסים אדם ובעלי חיים ספציפיים

פרוטוקול זה מתאר את השימוש זרימת משיק חלול סיבים מערכת ultrafiltration מדגם ריכוז דיסוציאציה חום כמו צעדים חלופיים עבור זיהוי של...

שינוי שיטת EPA 1623 שמשתמש תזרים משיק הולו סיבים Ultrafiltration ומחממים צעדים ניתוק לזהות waterborne<em&gt; Cryptosporidium</em&gt; ו<em&gt; Giardia spp.</em

Source: Fout, G. S., Cashdollar, J. L. EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. II. Total Culturable Virus Assay. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the use of a total culturable virus assay to quantify infectious viruses in water samples. It outlines host cell inoculation, observation of cytopathic effect, and statistical quantification of infectious virus concentration.

Quantifying Infectious Viruses in Water Samples Using an In Vitro Total Culturable Virus Assay

פותחה גישה לזיהוי תנאי ריכוז נגיפי אופטימליים עבור דגימות מים בנפח קטן באמצעות קוצים של אדנו-וירוס אנושי. הטכניקות המתוארות כאן משמשות לזיהוי פרמטרי ריכוז עבור מטרות נגיפיות אחרות, ומיושמות על ניסויים בריכוז נגיפי בקנה מידה גדול.

נוהל נפח קטן לריכוז נגיפי ממים

שיטת EPA 1615 משתמשת במסנן אלקטרו-פוזיטיבי כדי לרכז אנטרו-וירוסים ונורו-וירוסים במי הסביבה ובמי השתייה. כתב יד זה מתאר את הליך איסוף הדגימות לניתוחי שיטה 1615.

EPA שיטת המדידה של 1615. Enterovirus ומופע norovirus במים על ידי תרבות וRT-qPCR. I. איסוף דגימות וירוסים

כאן אנו מציגים נוהל למדידת סך כל הנגיפים הניתנים לתרבית באמצעות קו תאי הכליה של הקוף הירוק של באפלו. הנוהל מספק כלי סטנדרטי למדידת הופעת נגיפים זיהומיים במי הסביבה ובמי השתייה.

מדידת שיטת EPA 1615. של enterovirus ואת מופע norovirus במים על ידי תרבות RT-qPCR. II. Assay וירוס culturable סה&quot;כ

כאן אנו מציגים הליך לכימות אנטרו-וירוס ונורו-וירוס במי סביבה ושתייה באמצעות PCR כמותי של שעתוק הפוך. התאוששות הנגיף הממוצעת ממי תהום עם הליך סטנדרטי זה משיטת EPA 1615 הייתה 20% עבור נגיף הפוליו ו-30% עבור נורו-וירוס עכברים.

EPA שיטת המדידה של 1615. Enterovirus ומופע norovirus במים על ידי תרבות וRT-qPCR. חלק שלישי. איתור וירוסים על ידי RT-qPCR

אניון להחליף שיטה מבוססת-שרף, הותאם לנוזל הוכח bioaerosol מבוסס-impingement דגימה של וירוסים. כאשר יחד עם זיהוי מולקולרי במורד הזרם, השיטה מאפשרת גילוי נתיישב ורגיש של וירוסים bioaerosols.

זיהוי של וירוסים Bioaerosols באמצעות אניון Exchange שרף

ריכוז הנגיף מדגימות מים ושפכים סביבתיים הוא משימה מאתגרת, המתבצעת בעיקר לזיהוי וכימות נגיפים. בעוד מספר שיטות ריכוז וירוסים פותחו ונבדקו, אנו מדגימים כאן את היעילות של ultrafiltration ו flocculation חלב דל שומן עבור וירוסים RNA עם סוגי דגימה שונים.

ריכוז חלקיקי הנגיף מדגימות מים ושפכים סביבתיים באמצעות חלב דל שומן ואולטרה-סינון

למד את שיטת VirWaTest לזיהוי נגיפי מעיים בדגימות מים באמצעות ריכוז חלבוני וחילוץ חומצות נוקליאיות. שיטה זו מציעה פתרון נייד וחסכוני לניטור איכות מים בהקשרים הומניטריים.

וירוטסט, נקודת שימוש לאיתור וירוסים בדגימות מים

גלה סרטונים נוספים