Name: בתוך Vivo ישיר של תאים Glial תושב לתוך Interneurons על ידי הזרקת גרם של וקטורים ויראלי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 26 s
Description: חקור שיטה להמרת תאי גליה תושבים לתוך אינטרניורונים בוגרים בעכברים באמצעות וקטורים ויראליים מסוג AAV. השיטה מאפשרת יצירת נוירונים חדשים ישירות במוח לטיפולים עתידיים בהפרעות פסיכיאטריות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מרקלה בירטלה ממומנת על ידי האיחוד האירופי אופק 2020 תוכנית (H2020-MSCA-ITN-2015) תחת מארי Skłodowska-קירי רשתות הדרכה חדשנית וגרנט הסכם מס ' 676408. דניאלה רילנדר אוטקסון ממומנת על ידי מועצת המחקר השבדית (2017-01234).

<ol><li>Barker, R. A., Parmar, M., Studer, L., Takahashi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Trials+of+Stem+Cell-Derived+Dopamine+Neurons+for+Parkinson%27s+Disease%3A+Dawn+of+a+New+Era%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Human Trials of Stem Cell-Derived Dopamine Neurons for Parkinson's Disease: Dawn of a New Era.</a> Cell Stem Cell. 21 (5), 569-573 (2017).</li>
<li>Southwell, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interneurons+from+embryonic+development+to+cell-based+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Interneurons from embryonic development to cell-based therapy.</a> Science. 344 (6180), 1240622(2014).</li>
<li>Parmar, M., Torper, O., Drouin-Ouellet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-based+therapy+for+Parkinson%27s+disease%3A+A+journey+through+decades+toward+the+light+side+of+the+Force%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Cell-based therapy for Parkinson's disease: A journey through decades toward the light side of the Force.</a> European Journal of Neuroscience. , (2018).</li>
<li>Torper, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Reprogramming+of+Striatal+NG2+Glia+into+Functional+Neurons+that+Integrate+into+Local+Host+Circuitry%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">In Vivo Reprogramming of Striatal NG2 Glia into Functional Neurons that Integrate into Local Host Circuitry.</a> Cell Reports. 12 (3), 474-481 (2015).</li>
<li>Su, Z., Niu, W., Liu, M. L., Zou, Y., Zhang, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+conversion+of+astrocytes+to+neurons+in+the+injured+adult+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">In vivo conversion of astrocytes to neurons in the injured adult spinal cord.</a> Nature Communication. 5, 3338(2014).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ascl1+Converts+Dorsal+Midbrain+Astrocytes+into+Functional+Neurons+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Ascl1 Converts Dorsal Midbrain Astrocytes into Functional Neurons In Vivo.</a> Journal of Neuroscience. 35 (25), 9336-9355 (2015).</li>
<li>Guo, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+direct+reprogramming+of+reactive+glial+cells+into+functional+neurons+after+brain+injury+and+in+an+Alzheimer%27s+disease+model%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">In vivo direct reprogramming of reactive glial cells into functional neurons after brain injury and in an Alzheimer's disease model.</a> Cell Stem Cell. 14 (2), 188-202 (2014).</li>
<li>Grande, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+impact+on+direct+neuronal+reprogramming+in+vivo+in+the+adult+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Environmental impact on direct neuronal reprogramming in vivo in the adult brain.</a> Nature Communication. 4, 2373(2013).</li>
<li>Niu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+reprogramming+of+astrocytes+to+neuroblasts+in+the+adult+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">In vivo reprogramming of astrocytes to neuroblasts in the adult brain.</a> Nature Cell Biology. 15 (10), 1164-1175 (2013).</li>
<li>Weinberg, M. S., Criswell, H. E., Powell, S. K., Bhatt, A. P., McCown, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+Vector+Reprogramming+of+Adult+Resident+Striatal+Oligodendrocytes+into+Functional+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Viral Vector Reprogramming of Adult Resident Striatal Oligodendrocytes into Functional Neurons.</a> Molecular Therapy. 25 (4), 928-934 (2017).</li>
<li>Pereira, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+Reprogramming+of+Resident+NG2+Glia+into+Neurons+with+Properties+of+Fast-Spiking+Parvalbumin-Containing+Interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Direct Reprogramming of Resident NG2 Glia into Neurons with Properties of Fast-Spiking Parvalbumin-Containing Interneurons.</a> Stem Cell Reports. 9 (3), 742-751 (2017).</li>
<li>Rivetti di Val Cervo, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+functional+dopamine+neurons+from+human+astrocytes+in+vitro+and+mouse+astrocytes+in+a+Parkinson%27s+disease+model%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Induction of functional dopamine neurons from human astrocytes in vitro and mouse astrocytes in a Parkinson's disease model.</a> Nature Biotechnology. 35 (5), 444-452 (2017).</li>
<li>Crosson, S. M., Dib, P., Smith, J. K., Zolotukhin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helper-free+Production+of+Laboratory+Grade+AAV+and+Purification+by+Iodixanol+Density+Gradient+Centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+Methods+%26+Clinial+Development%22%5BJournal%5D)">Helper-free Production of Laboratory Grade AAV and Purification by Iodixanol Density Gradient Centrifugation.</a> Molecular Therapy Methods & Clinial Development. 10, 1-7 (2018).</li>
<li>Torper, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+induced+neurons+via+direct+conversion+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Generation of induced neurons via direct conversion in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (17), 7038-7043 (2013).</li>
<li>Kawaguchi, Y., Kubota, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+of+physiological+subgroupings+of+nonpyramidal+cells+with+parvalbumin-+and+calbindinD28k-immunoreactive+neurons+in+layer+V+of+rat+frontal+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Correlation of physiological subgroupings of nonpyramidal cells with parvalbumin- and calbindinD28k-immunoreactive neurons in layer V of rat frontal cortex.</a> Journal of Neurophysiology. 70 (1), 387-396 (1993).</li>
<li>Grealish, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+A9+dopamine+neuron+component+in+grafts+of+ventral+mesencephalon+is+an+important+determinant+for+recovery+of+motor+function+in+a+rat+model+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">The A9 dopamine neuron component in grafts of ventral mesencephalon is an important determinant for recovery of motor function in a rat model of Parkinson's disease.</a> Brain. 133 (Pt 2), 482-495 (2010).</li>
<li>Thompson, L., Barraud, P., Andersson, E., Kirik, D., Bjorklund, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+dopaminergic+neurons+of+nigral+and+ventral+tegmental+area+subtypes+in+grafts+of+fetal+ventral+mesencephalon+based+on+cell+morphology%2C+protein+expression%2C+and+efferent+projections%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Identification of dopaminergic neurons of nigral and ventral tegmental area subtypes in grafts of fetal ventral mesencephalon based on cell morphology, protein expression, and efferent projections.</a> Journal of Neuroscience. 25 (27), 6467-6477 (2005).</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

ב vivo ישיר מתיכנות ניתן להשיג באמצעות וקטורים FLEX AAV ביצור-המבטא זנים של העכבר. חשוב לציין כי הבדלים בין זני העכבר לגבי יעילות תכנות משנה נצפו. עבור ב vivo מתיכנות משני בסטריאטום, קו העכבר NG2-יצורים הוכיחה להיות יעיל יותר בהשוואה זנים אחרים. לפני שמתחילים להשתמש זן חדש של בעלי חיים, חשוב לבדוק את הקווים המנחים של ספק העכבר לגבי ביטוי היצור לאורך זמן, כמו גיל של בעלי חיים לעיתים קרובות משפיע על הספציפיות של הביטוי הזה חלבון. במחקרים שלנו, בעלי חיים שגילם עולה על 12 שבועות לא שימשו בvivo תכנות כפי שהיה סיכון לביטוי היצור בתאים שאינם NG2 glia. הנוכחות הקבועה וניטור של בעלי חיים בקרה מוזרק רק עם סינפסין-FLEX-GFP המבנה מומלץ. זה מאפשר ניטור של בעלי החיים עבור תאים GFP-חיוביים כי לא צריך להיות נוכח אם אין גנים מתיכנות מראש (מאשר) משמשים.
כדי לזהות את הנוירונים החדשים שעוצבו מחדש, שיטת זיהוי ספציפית לנוירונים, כמו זו המתוארת בפרוטוקול זה, היא בעלת חשיבות עליונה. זה מאפשר זיהוי והבחנה נכונה של הנוירונים מתוכנת התכנות מתוך התאים האנדוגניים המקיפים כי הוא מאוד רלוונטיות כאשר תכנות מחודש באזור הומונושא.
חשוב גם למקד את המבנה הנכון עבור הזרקה ויראלי. לכן, הניתוח הסטרטקאני להזרקה ויראלי חשוב וצריך להתקרב אליו בדיוק, במיוחד כאשר מסמנים את המבנים הקטנים יותר של המוח.
בעבר הצגנו11 כי זה לא אמין כדי לחזות את התוצאה של vivo תכנות מבוסס על ניסויים באמצעות התכנות מחוץ גופית באמצעות אותם גורמים תכנות משנה. לכן יש לבחון את כל גורמי העניין בvivo. בידינו, שילובים רבים גורמים שונים לתת את אותו סוג של נוירונים (כלומר, interneurons11 ב vivo) למרות העובדה כי גנים אלה היו מעורבים בפיתוח של נוירונים אחרים.
כל תא מהדק תיקון עבור נוירונים מתוכנת מתכנתו היא טכניקה עדינה עיבוד רקמות חשוב לתוצאה טובה. Perfusion עם פתרון קרבס קר משפר את איכות הרקמה. גם, נוירונים שתוקנה צריך להיות מטופלים בזהירות. גם אם התבגרות וזהות פנוטימית של נוירונים מתוכנת שניתן להעריך במידת מה באמצעות מהדק טלאי תא שלם, תאים אלה אינם מקבילים באופן מלא לעמיתיהם האנדוגניים שלהם. סוגים נוספים של ניתוח, כגון רצף הגנום (למשל, רצפי RNA) יש להשתמש כדי לאשר עוד זהות תא מתוכנת.
הטכניקה המתוארת במסמך זה יכולה להיחשב לפיתוח טיפולים עתידיים שבהם נדרש תחליף עצבי במוח. למרות שvivo תכנות עדיין בשלבים המוקדמים שלה ואת התרגום לבני אדם עדיין לא מראש, טכניקה זו יכולה לספק שיטה כדי להעריך את התפקוד הגנטי האקסוגני במוח וללמוד תא התבגרות בvivo.

המטרה הכוללת של שיטה זו היא להמיר ביעילות את המוח תושב glia ב vivo לתוך הנוירונים פונקציונלי מסוג אחד ספציפיים כגון parvalbumin-הביע interneurons. זה מספק צעד קדימה לקראת הפיתוח של טיפול חלופי החלפת התא עבור מחלות המוח ללא צורך מקור תא אקסוסוגני. זה גם יוצר כלי לחקור את מתגי הגורל התא באתרו.
המוח יש רק קיבולת מוגבלת ליצירת נוירונים חדשים. לכן, במחלות נוירולוגיות, יש צורך של מקורות תא אקסוגני לתיקון המוח. בשביל זה, מקורות שונים של תאים נחשפו למחקר אינטנסיבי במהלך השנים, כולל תאים מרקמות ראשוני, תאי גזע הנגזרים תאים ותאים מתוכנת מחדש1,2,3. מחדש ישירות של תאי המוח תושב לתוך הנוירונים היא גישה האחרונות שיכול לספק שיטה אטרקטיבית לתיקון המוח כפי שהוא משתמש בתאים של החולה ליצירת נוירונים הרומן בתוך המוח. עד היום, מספר דיווחים הראו vivo תכנות מחדש באמצעות משלוח וקטורי ויראלי במוח4,5,6,78,9 באזורי מוח שונים כגון הקליפה, חוט השדרה, סטריאטום והמוח המאמצע5,10,11, כמו גם במוח השלם ולגירסה5,8,11,12. הן נוירונים מעכבות ומרגש הושגו4,8, אבל הפנוטיפ מדויק או פונקציונליות של תאים אלה עדיין לא נותחו בפרוטרוט.
בפרוטוקול זה, אנו מתארים התכנות יעיל יותר וזיהוי תא ספציפי של vivo נוירונים מתוכנת. אנו מספקים פרוטוקול להערכה תפקודית של ההבשלה העצבית והאפיון הפנוטיפ המבוסס על פונקציונליות ותכונות אימונוהיסטוכימיה.
השתמשנו inducible וקטור AAV של היצורים וכתבת GFP כדי לזהות את הנוירונים vivo מתוכנת. בחירה זו של וקטורים ויראלי יש את היתרון של הדבקה הן חלוקת תאים בלתי מפרידים של המוח, הגדלת מספר תאים ייעודיים, כחלופה לשימוש של רטרו וירוס7,8. כתבת FLEX (GFP) ספציפית לעצב-מסינפסין, אפשרה לנו לזהות במיוחד את הנוירונים שנוצרו לאחרונה. מחקרים קודמים השתמשו היזמים ספציפיים למשנה עבור ב vivo תכנות7,9, כי גם לאפשר את הביטוי של גנים התיכנות מראש וכתבים בסוגי תאים ספציפיים. עם זאת, שיטה זו מחייבת זיהוי נוסף של נוירונים מתוכנת על ידי ניתוח לאחר המוות של הביטוי המשותף של כתב וסמנים עצביים. השימוש בכתב מסוים בעצב, כגון האחד המתואר לעיל, מאפשר זיהוי ישיר. זה מספק הוכחה ישירה של המרה מוצלחת ומאפשר זיהוי תא חי הנדרש עבור מהדק-מלחציים הפיזיולוגיה.

<table><tbody><tr><td><ריאגנטים חזקים>ריאגנטים לשיבוט AAV5 והכנת וקטור ויראלי</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PAAV-CA-FLEX</td><td>AddGene</td><td>38042</td><td></td></tr><tr><td>Ascl1</td><td>AddGene</td><td>67291</td><td>NM_008553.4</td></tr><tr><td>Lmx1a</td><td>AddGene</td><td>33013</td><td>NM_0033652.5</td></tr><tr><td>Nurr1</td><td>AddGene</td><td>35000</td><td>NM_013613.2</td></tr><tr><td>GFP-syn</td><td>AddGene</td><td>30456</td><td></td></tr><tr><td>LoxP (FLEX) רצף 1</td><td></td><td></td><td>GATCTccataacttcgtataaagtatcctatac gaagttatatcaaaataggaagaccaatgcttc accatcgacccgaattgccaagcatcaccatcg acccataacttcgtataatgtatgctatacgaa gttatactagtcgggaaggcgaagacgcgga agaggctctaga</td></tr><tr><td>LoxP (FLEX) רצפים 2</td><td></td><td></td><td>tactagtataacttcgtataggatactttatac gaagttatcattgggattcttcctattttgatc caagcatcaccatcgaccaccctagtccacatct caccatcgacccataacttcgtatagcatacat tatacgaagttatgtccctcgaagaggttcgaaa ttcgtttaaacGGTACCCTCGAC</td></tr><tr><td>pDP5</td><td>פלסמיד מפעל</td><td>PF435</td><td></td></tr><tr><td>pDP6</td><td>פלסמיד מפעל</td><td>PF436</td><td></td></tr><tr><td>פוספט-חוצץ מלח (PBS)</td><td>תרמו פישר Scientific</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>FBS (סרום בקר עוברי)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10500064</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין סטרפטומיצין</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (מדיום הנשר המותאם של Dulbecco)+ Glutamax</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td> 61965026-DPBS <td></td></tr><tr><td>(מלח מאגר הפוספט של Dulbecco)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td>14190094</tr><tr><td>תאי HEK293</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>85120602-1VL</td><td></td></tr><tr><td>צלוחיות</td><td>BD Falcon</td><td>10078780</td><td>175 סמ"ר</td></tr><tr><td>Tris H-CL</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10812846001</td><td> עבור מאגר TE השתמש ב-10 מ"מ, pH 8.0; עבור מאגר ליזה השתמש ב-50 מ"מ, pH 8.5; עבור מאגר IE השתמש ב-20 מ"מ, pH 8.0; עבור מאגר פליטה השתמש ב-20 מ"מ, pH 8.0 </td></tr><tr><td>EDTA</td><td>EDTA: Invitrogen</td><td>EDTA: AM9260G</td><td> עבור מאגר TE השתמש ב-1 מ"מ EDTA </td></tr><tr>מים <td></td><td></td><td>אולטרה-טהורים</td><td> ראה מערכת מים אולטרה-טהורים </td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>SigmaAldrich</td><td>C5080</td><td>2.5 מ'</td></tr><tr><td>Dulbecco&acute; s תמיסת מלח חוצצת פוספט (DPBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190136</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td> לשימוש HBS 140 מ"מ; עבור מאגר ליזה השתמש ב-150 מ"מ; עבור מאגר IE השתמש ב-15 מ"מ; עבור מאגר פליטה השתמש ב-250 מ"מ </td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266-100G</td><td> עבור מאגר ליזה: 1 מ"מ </td></tr><tr><td>צינורות איטום אולטרה-צנטריפוגה Beckman</td><td>Coulter</td><td>Quick-Seal&reg; &nbsp; צינור</td><td></td>פוליפרופילן</tr><tr><td>OptiPrep&trade; &nbsp; שיפוע צפיפות בינוני</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>D1556-250 מ"ל</td><td></td></tr><tr><td>מזרק 10 מ"ל-18 גרם מחט</td><td>BD</td><td>305064</td><td></td></tr><tr><td>בקבוקי זכוכית מעבדה</td><td>VWR?</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מסנן חילופי אניונים</td><td>מעבדת PALL</td><td>MSTG25Q6</td><td> יחידת Acrodisc עם קרום מוסטנג Q </td></tr><tr><td>יחידת מסנן צנטריפוגלי</td><td>Merck</td><td>Z740210-24EA</td><td> Amicon Ultra-4 </td></tr><tr><td>מכשיר ללא אנדוטוקסין ערכות בידוד DNA פלסמיד</td><td>תרמו פישר מדעי</td><td>A33073</td><td></td></tr><tr><td>Na2PO4</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>S7907</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>H7523</td><td>15 מ"ל</td></tr><tr><td>פלקון צינור</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>קורנינג 352196</td><td></td></tr><tr><td>פלקון צינור</td><td>תרמו פישר מדעי</td><td>קורנינג 352070</td><td></td></tr><tr><td>בקבוקוני זכוכית</td><td>Novatech</td><td>30209-1232</td><td> CGGCCTCAGFGAGCGA </td></tr><tr><td>פריימר קדימה לרצף</td><td></td><td></td> חזרה מסוף הפוך (ITR) <td> GGAACCCCTAGTGATGGAGTT </td></tr><tr><td>פריימר הפוך לרצף חזרה על מסוף הפוך (ITR)</td><td> CACTCCCTCTCTGCGCGCTCCTCG </td>5&acute;<td></td><td></td></tr><tr><td> FAM / 3&אקוטי; בדיקה BHQ1</td><td>Jena Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.22 מ"מ מסנן</td><td>Merck</td><td>SLGV004SL</td><td>Millex-GV מסנן</td></tr> <tr><td><חזק>ציוד AAV5 הכנת וקטור ויראלי</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מקפיא -20 & deg; C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מקפיא -80 מעלות; מקרר C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>+4 & deg; חדר</td> ויראלי C <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AAV</td> מערכת מים טהורים במיוחד Merck Milli-Q&reg;<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td> מערבל מערבולת IQ 7000</td><td></td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>444-0004</td><td></td></tr><tr><td>אולטרה-צנטריפוגה</td><td>בקמן קולטר</td><td>בקמן אופטימה LE-80K אולטרה-צנטריפוגה</td><td></td></tr><tr><td>אוטוקלאב</td><td>Tuttnauer</td><td>2540 EL</td><td></td></tr><tr><td>תגובת שרשרת פולימראז (PCR)</td> <td>BioRad</td><td>C1000 Touch Thermal Cycler</td><td></td></tr><tr><td>PCR כמותי (qPCR)</td> <td>Roche</td><td>LightCycler&reg; 480 מערכת</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>סורוול ST16</td><td></td></tr><tr><td>אמבט מים</td><td>תרמו פישר מדעי</td><td>TSGP02</td><td></td></tr><tr><td><חזק>דגם בעלי חיים</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NG2-Cre עכברי</td><td>ג'קסון</td><td>NG2-CrexB6129, מלאי #008533</td><td></td></tr><tr><td><חזק>ריאגנטים להזרקת גורמי תכנות מחדש למוח</ תמיסת מלח חזקה ב>מים</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Apoteket AB</td><td></td><td>70%</td></tr> <tr><td>אתנול</td><td>Solveco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isolfurane</td><td>Apoteket AB</td><td></td><td> יש לדלל לתמיסה של 1% במים חמים. </td></tr><tr><td>וירקון</td><td>וירודרם</td><td>7511&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital</td><td>Apoteket AB</td><td>P0500000</td><td> i.p. לפרוצדורה סופנית במינון של 60 מ"ג/מ"ל. </td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>Merck</td><td>S0389-500G</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blu</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Retrobeads</td><td>Lumafluor</td><td>R170</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorphine</td><td>Apoteket AB</td><td></td><td></td></tr><<tr><td>STRONG>ציוד להזרקת גורמי תכנות מחדש למוח</חזק></td><td></td><td></td><td> מבית RSG Solingen. </td></tr><tr><td>מספריים</td><td>VWR</td><td>233-1552</td><td>מבית ביוכימיה.</td></tr><tr><td>פינצטה</td><td>VWR</td><td>232-0007</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים</td><td>VWR</td><td>232-0120</td><td></td></tr><tr><td>מחזיק אזמל</td><td>VWR</td><td>RSGA106.621</td><td>מספר 20.</td></tr><tr><td>אזמל</td><td>VWR</td><td>RSGA106.200</td><td></td></tr><tr><td>מסגרת סטריאוטקסית</td><td>Stoelting Europe</td><td>51500D</td><td></td></tr><tr><td>מוטות אוזניים לעכבר</td><td>Stoelting Europe</td><td>51648</td><td>5 ul</td></tr><tr><td>מזרק עם מחט נשלפת</td><td>Hamilton Company</td><td>65</td><td> 0,75 קוטר פנימי ו-1.5 קוטר חיצוני. </td></tr><tr><td>מכלי זכוכית</td><td>Stoelting</td><td>50811</td><td></td></tr><tr><td>חולץ נימי זכוכית</td><td>חברת Sutter</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>מקדחה דנטלית</td><td>Agnthos AB</td><td>1464</td><td></td></tr><tr><td>מכונת גילוח</td><td>Agnthos AB</td><td>GT420</td><td></td></tr><tr><td>תא איזופלורן ומשאבה</td><td>Agnthos AB</td><td>8323101</td><td>2 מ"ל</td></tr><tr><td>מזרקים</td><td>Merck</td><td>Z118400-30EA</td><td>25G</td></tr><tr><td>נידלס</td><td>מרק</td><td>Z192414&nbsp; מתאם עכבר אולדריץ'</td><td></td></tr><tr><td>וחולדה יילודים לפראם סטריאוטקסי</td><td>Stoelting</td><td>51625</td><td></td></tr><tr><td>כרית חימום</td><td>Braintree scientific, inc</td><td>53800M</td><td> מבית Covidien 2187. </td></tr><tr><td>גזה כותנה</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>22-037-902</td><td></td></tr><tr><td>צינור גומי</td><td>Elfa Distrelec</td><td>HFT-A-9.5/4.8 PO-X BK 150</td><td></td></tr><tr><td>צמר גפן</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>18-366-473</td><td></td></tr><tr><td><חזק>ריאגנטים להקלטות מהדק תיקון שלם</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4-H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2-6 H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2-6 H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8106</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4-7 H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>230391</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>גלוקוז</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021</td><td> ראה מערכת מים אולטרה-טהורים </td></tr><tr><td>מים</td><td></td><td></td> טהורים <td>הכן 1 או 2M.</td></tr><tr><td>KOH</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P5958-500G</td><td></td></tr><tr><td>K-D-גלוקונאט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>G4500&nbsp; Sigma</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>KOH-EGTA (חומצה אטילן גליקול-ביס-N-טטרקטית)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>E3889&nbsp; סיגמא</td><td></td></tr><tr><td>KOH- חומצה הפס (N-2-הידרוקסיאתיל פיפרזין-N'-2-חומצה אתנסולפונית)</td><td>סיגמא-אולדריץ</td>' <td>H7523</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Mg2ATP</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>ו-3GTP</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>G8877</td><td></td></tr><tr><td>ביוציטין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>B4261</td><td></td></tr><tr><td>פיקרוטוקסין</td><td>Merck</td><td>P1675&nbsp; סיגמא</td><td></td></tr><tr><td>CNQX</td><td>Merck</td><td>C239&nbsp; סיגמא</td><td></td></tr><tr><td>קרח</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><חזק>ציוד להקלטות מהדק תיקון שלם</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>בורוסיליקט פיפטה זכוכית</td><td>Sutter Company</td><td>B150-86-10</td><td></td></tr><tr><td>חולץ נימי זכוכית</td><td>חברת סאטר</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>Leica VT1000 S</td><td></td></tr><tr><td>WaterBath</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>TSGP02</td><td></td></tr><tr><td>Clampfit תוכנה</td><td>מכשירים מולקולריים</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multiclamp תוכנה</td> מכשירים <td>מולקולריים</td><td></td><td></td></tr><tr><td><חזקים>ריאגנטים לאימונוהיסטוכימיה</חזק></td><td></td><td></td><td> שימוש בריכוז של 4%.&nbsp; זהירות:&nbsp; PFA הוא מקבע רב עוצמה. יש להימנע מבליעה וממגע עם העור. </td></tr><tr><td>פרפורמלדהיד (PFA)</td><td>Merck Millipore</td><td>1040051000</td><td> שימוש בריכוז של 0.1%. </td></tr><tr><td>טריטון X-100</td><td>פישר 10254640 מדעי</td><td></td><td> חמור.השתמש בריכוז של 1: 400. </td></tr><tr><td>Serum</td><td>Merck Millipore</td><td>S30-100ML</td><td> מרכיבים מחדש את האבקה במי Milli-Q ל-1 מ"ג/מ"ל. Aliquot ואחסון ב-20&deg; ג,&nbsp; רגיש לאור. יש להשתמש בריכוז של 1:500. </td></tr><tr><td>4&prime;,6-Diamidino-2&prime;-phenylindole dihydrochloride (DAPI)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9542</td><td> 1: 600 ב-KPBS-T. </td></tr><tr><td>streptavidin- Cy3</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>434315</td><td>1:5000, ארנב.</td></tr><tr><td>Anti-GAD65/67</td><td>Abcam</td><td></td><td>1:2000, עכבר.</td></tr><tr><td>Anti-PV</td><td>Sigma</td><td>P3088</td><td>1:200, עז.</td></tr><tr><td>אנטי-צ'אט</td><td>מרק</td><td>AB143</td><td>1:5000, ארנב.</td></tr><tr><td>Anti-NPY</td><td>Immunostar</td><td>22940</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3786</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>NIST200B</td><td>1:1000, עוף.</td></tr><tr><td>אנטי-GFP</td><td>Abcam</td><td>ab13970</td><td></td></tr><tr><td>פתרון הרכבה</td><td>Merck</td><td>10981</td><td> פוליוויניל אלכוהול הרכבה מדיום עם DABCO&reg;, אנטי דהייה </td></tr><tr><td>OCT</td><td>Agar Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9012-100ML</td><td></td></tr><tr><td>מים</td><td></td><td></td><td></td>מזוקקים</tr><tr><td>תמיסת נגד הקפאה</td><td>Tissue Pro Technology</td><td>AFS05-1000N, 1000 מ"ל/ea.</td><td></td></tr><tr><td><חזק>ציוד לאימונוהיסטוכימיה</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך</td><td>Leica</td><td>DMI6000 B</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ קונפוקלי</td><td>Leica</td><td>TCS SP8 מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי.</td><td></td></tr><tr><td>פריזמה</td><td>GraphPad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Leica</td><td>SM2010R</td><td></td></tr></tbody></table>

בתוך vivo ישיר של תאים glial תושב לתוך interneurons על ידי הזרקת גרם של וקטורים ויראלי

In Vivo Direct Reprogramming of Resident Glial Cells into Interneurons by Intracerebral Injection of Viral Vectors

המרת התושב גליה במוח לתוך הנוירונים פונקציונלי מסוג אחד ספציפי ב vivo מספק צעד קדימה לקראת התפתחות של טיפולים חלופיים החלפת תאים תוך יצירת כלים גם לחקור את גורל התא באתרו. עד כה, ניתן היה להשיג נוירונים באמצעות vivo תכנות מדויק, אבל הפנוטיפ המדויק של נוירונים אלה או איך הם בוגרים לא נותחו בפרוטרוט. בפרוטוקול זה, אנו מתארים המרה יעילה יותר הזיהוי הספציפי לתא של vivo מתוכנת נוירונים, באמצעות מערכת וקטורים מבוססי AAV ויראלי. אנו מספקים גם פרוטוקול להערכה תפקודית של ההבשלה העצבית של התאים שתיכנתו. על-ידי הזרקת וקטורים מסוג ' היפוך כריתה ' (FLEX), המכיל את גנים הכתב המתיכנות מראש והסינפסין לסוגי תאים ספציפיים במוח המשמשים כיעד לתיכנות מדויק של התא. טכניקה זו מאפשרת זיהוי קל של הנוירונים החדשים שעוצבו מחדש. התוצאות מראות כי הנוירונים שהתקבלו מתוכנת מחדש פונקציונלית בוגרת לאורך זמן, לקבל אנשי קשר סינפטית ולהציג מאפיינים אלקטרולוגיים של סוגים שונים של האינטרנוירונים. באמצעות שעתוק הגורמים Ascl1, Lmx1a ו Nurr1, רוב התאים התיכנתו יש מאפיינים של מהיר העולה, parvalbumin המכיל באינטרנוירונים.

ההזרקה של וקטורים AAV משמש בהצלחה תכנות מחודש NG2 glia התאים לתוך נוירונים בתוך NG2-העכבר סטריאטום (איור 1A). כדי במיוחד היעד NG2 glia, FLEX וקטורים עם התכנות מתיכנות/כתבת גנים, מוכנסים לכיוון antisense ומוקף על ידי שני זוגות של מקבילים, הטרוטיפקס אתרים loxP (איור 1B). כל אחד משלושת הגנים מתיכנות מראש (Ascl1, Lmx1a ו Nurr1) ממוקם תחת השליטה של היזם לונים בכל מקום על וקטורים בודדים. על מנת להבטיח ביטוי GFP מוגבל הנוירונים מתוכנת מראש ממקור התא ביטוי, GFP הוא ממוקם תחת השליטה של תא העצב-סינפסין יזם ספציפי, (גם וקטור FLEX).
השימוש בשילוב של התכנות מראש ובנייה עיתונאי מאפשר את הדור של נוירונים GFP-חיוביים בסטריאטום העכבר (איור 1C, C '). השימוש של העיתונאי לבנות ללא נוכחות של גנים מתיכנות מראש לא להניב נוירונים GFP-חיוביים (איור 1D).
הנוירונים שאינם מתוכנת על-ידי הביוציטוטין מתמלאים לאחר שלאחר המוות מכתימה (איור 2 א). אם ההמרה תצליח, צריכה להיות. מורפולוגיה נרחבת במבנה העצבי ההקלטות האלקטרופיזיולוגיות של הנוירונים מתוכנת להראות נוכחות של קשרים פונקציונליים פוסט-סינפטית עם צעדי פעילות ספונטנית (איור 2B, C). זה יכול להיות חסום עם GABAergic גאבה או glutamatergic חוסם (Picrotoxin או CNQX), מציע הן מרגש ומעכבות קלט סינפטית לנוירונים מתוכנת. התרחשות של פעילות ספונטנית עולה עם הזרקת הזמן ויראלי הזרקה (איור 2D), המציין התבגרות הדרגתית.
פוטנציאל הפעולה המושרה קיים בנוירונים פונקציונליים. פוטנציאל הפעולה יגדל במספר לאורך זמן לאחר ההמרה (איור 2E). זה מעיד על התבגרות. בתפקוד עצבי בתוך תא עצב בלתי מפותח, הזרם יגרום ליותר או לא מעט מאוד פוטנציאל פעולה (איור 2F).
דפוסי הירי של תא העצב הוא סוג תא ספציפי כפי שהוא תלוי בגורמים כגון המבנה של התאים וביטוי הערוץ15. את דפוסי מוקלט ב vivo הנוירונים הניתנים לדפוס ניתן להבדיל לקבוצות ולעומת זה של תת-סוגי נוירוגניים עצביים, למשל מהיר המבהנוירונים (תא סוג B, איור 3B) או סוגי תאים אחרים (איור 3b, C, D ). הבדלים אלקטרופיסיולוגיים שנצפו ניתן לאשר על ידי נוכחות של סמנים ספציפיים לסוג וביטוי משותף עם GFP (איור 3E-H). בסך הכל, מידע זה מציין כי הנוירונים המתוכנת מחדש המצויים בסטריאטום יש תכונות של סוגים שונים של אינטרנוירונים, כגון Parvalbumin-, צ'אט-ו-NPY-ביטוי interneurons, כמו גם שלאטאת זהות תא העצב המדיום קוצני (DARPP32 +) ( איור 3E -H).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59465/59465fig1.jpg"> איור 1: ב vivo תכנות של תושב NG2 glia לתוך נוירונים. (A) ייצוג סכמטי של וירוס aav בתיווך בvivo תכנות מחודש של סטריאטNG2 glia. (ב) ייצוג סכימטי של AAV5 FLEX בנייה המשמשים בvivo תכנות, שבו ביטוי הגנים מוסדר על ידי ביטוי היצור בתאי ממוקדות. (C ו- c) בvivo הנוירונים שעברו תוכנת העצב, כתוצאה מ-Syn-gfp + הזרקה לתוך הסטריאטום. (ד) העדר נוירונים מתוכנת תכנות כאשר לא מוסיפים לתוך הקוקטייל הנגיפי, ורק מבנה העיתונאי מוזרק בvivo. סולם ברים = 100 מ"מ (C), 25 מ"מ (ג), 25 מ"מ (ד). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59465/59465fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59465/59465fig2.jpg"> איור 2: ב vivo מתוכנת נוירונים הם פונקציונליים ולהראות התבגרות לאורך זמן. (א) מראה מורפולוגיה עצבית בוגרת, כולל שיוט דנדריטי. רשמים מראה (ב) פעילות מעכבות (GABAergic) כי הוא נחסם עם PICROTOXIN, נגבההיריב קולטן (ג) פעילות מרגש נחסם עם CNQX, היריב קולטן אמפא. (ד) מספר הנוירונים עם הפעילות הפוסט-סינפטית גדל לאורך זמן. (ה) נוירונים שתוקנו להראות ירי חוזרות כבר ב 5 שבועות לאחר ההזרקה (w.p.i.) ולהמשיך להראות כי ב 8 ו 12 W.p.i. (F) המושרה התוצאה פעולה פוטנציאל ו-postsynaptic של תא עצב בוגר, מראה מעטים הסינפטיות אירועים ובעלי פוטנציאל פעולה מועטים בהשוואה ל-B ו-D בסרגל קנה מידה = 25 מ"מ <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59465/59465fig2large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי לצפות בגירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59465/59465fig3v2.jpg"> איור 3: ב Vivo הנוירונים מתוכנת להראות אימונוהיסטוכימיה ו אלקטרופיזיולוגיה תכונות של סטריאטאל interneurons. (A-D) דפוסי ירי של vivo מתוכנת הנוירונים יכול להיות מסוגים שונים: (א) סוג דומה לעצב בינוני אנסוגני קוצני (DARPP32 +); (ב) דומה מהיר העולה (PV +) interneurons; (ג) בדומה להנוירונים בולטים בעלי הסף הנמוך (npy +); (ד) נוירונים יורים עם היפרפולריזציה גדולה (צ'אט +). (E-ח) תמונות confocal וקד מראה שיתוף לוקליזציה של GFP ו-סמנים הביננוירונים PV (E), צ'אט (F), npy (G), ו תא ההקרנה סמן DARPP32 (H). כל ברים בקנה מידה = 50 מ"מ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59465/59465fig3v2large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>

פרוטוקול זה מתכוון לייצר האינטרנוירונים מתוכנת באופן ישיר ב-vivo, באמצעות מערכת ויראלי מבוססי AAV במוח וכתבת ה-GFP FLEX סינפסין, המאפשרת זיהוי תאים וניתוח נוסף בvivo.

בתוך Vivo ישיר של תאים Glial תושב לתוך Interneurons על ידי הזרקת גרם של וקטורים ויראלי

Converting resident glia in the brain into functional and subtype-specific neurons in vivo provides a step forward towards the development of alternative ...

פרוטוקול זה מראה כי ניתן ליצור נוירונים חדשים ישירות במוח מן גליה תושב, כי אלה תאים מתוכנתים מחדש להתבגר לתוך נוירונים תת-סוג ספציפי. היתרון העיקרי הוא וירוס AAV תלוי cre המאפשר מיקוד ספציפי של NG2-גליה ואת כתב GFP כי תוויות נוירונים מתוכנתים מחדש לניתוח. יצירת נוירונים חדשניים במוח עלולה להוביל להתפתחות עתידית לטיפולים בהחלפת תאים במוח.בפרוטוקול שלנו אנו מייצרים את האינטראורונים החיוביים של פרבלבומין שיש להם השלכות על הפרעות פסיכיאטריות. תכנות מחדש של Vivo יכול להיות מיושם על אזורים ומעגלים אחרים במוח תלוי מה פנוטיפ עצבי ומצב נוירולוגי אתה רוצה למקד. הדגמת ההליך תהיה ג'ני ג'והנסון: טכנאית, מריה פריירה: סטודנטית לשעבר לדוקטורט, ומרסלה בירטלה: סטודנטית לדוקטורט במעבדה שלנו.כדי לייצר וקטור ויראלי AAV5, זרע HEK293T תאים עם בינוני תרבות סטנדרטית בחמישה בקבוקונים T175. כאשר התאים מגיעים ל-50 עד 70%, הכן את התמהיל הבא להתהוות. בצינור צנטריפוגה 50 מיליליטר, להוסיף כמויות טוחנת שווה של פלסמיד וקטור, ו pDG סדרת עוזר plasmid.הוסף מאגר Tris-EDTA לנפח סופי של 144 מיקרוליטר ולאחר מכן הוסף מים אולטרה-חמים כדי לגרום לנפח כולל של 1296 מיקרוליטרים ולערבב. לאחר מכן, מוסיפים 144 מיקרוליטרים של 2.5 כלוריד סידן טוחן ומערבבים. לאחר מכן, להוסיף 1.92 מיליליטר של HBS לפתרון DNA ומערבולת מיד.דגירה בטמפרטורת החדר בדיוק 60 שניות. לאחר מכן, להעביר את הפתרון 28 מיליליטר של תאים טריים תרבות בינוני ומערבבים. החלף את המדיום בבקבוקים עם המדיום המכיל תערובת transvection.חכה שלושה ימים, ותעביר את התקשורת לבזבוז. הוסף חמישה מיליליטר של חיץ קציר לכל בקבוקון, ולאחר מכן להוסיף עוד ארבעה מיליליטר של DPBS לכל בקבוק כדי לשטוף את התאים הנותרים ואת הבריכה עם פתרון התא. צנטריפוגה התאים שנקטפו ב 1, 000 x גרם במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס.לאחר צנטריפוגה, להסיר את supernatant ולהמיס את גלולה ב 15 מיליליטר של חיץ תמוגה. להקפיא את צינור צנטריפוגה 50 מיליליטר על קרח יבש במשך 15 דקות ולאחסן במקפיא מינוס 20 מעלות צלזיוס. לפני השימוש, להפשיר את התא שנקטף lysate באמבט מים ב 37 מעלות צלזיוס.בהליך זה, לבצע טיהור AAV על ידי אולטרהצנטריפוגה שיפוע יוד ולהשתמש צינורות תקרה אולטרהצנטריפוגה עם צנטריפוגה ב 350, 000 x g במשך שעה אחת ו 45 דקות בטמפרטורת החדר. כדי לחלץ את AAV המכיל שלב, להכניס מזרק 10 מיליליטר עם מחט מד 18 בערך שני מילימטרים מתחת לגבול 40 עד 60% פאזה עם השיקוע פונה כלפי מעלה לסגת. הקפד לעצור לפני שהגיע רצועת החלבון לאחר חמישה עד שישה מיליליטר של וקטור ויראלי כבר מופק.לאחר מכן, לטהר ולרכז את שיפוע יודיקסנול מדולל באמצעות מסנן חילופי אניון, על ידי דחיפת אותו דרך בקצב לא מהר יותר מאשר טיפה אחת לשנייה. לאחר מכן, לדחוף שלושה מיליליטר של מאגר IE לאט דרך המסנן כדי לשטוף אותו. לאחר מכן, החלק את התערובת ליחידת סינון צנטריפוגלית עם אחד עד שני מיליליטר של מאגר אלוטיון.הוסף DPBS להתקן לנפח סופי של ארבעה מיליליטר. צנטריפוגה ב 2, 000 x גרם בטמפרטורת החדר עד פחות מ 0.5 מיליליטר של DPBS נשאר במסנן. לאחר מכן, להסיר נוזל מתחתית הצינור, מילוי מחדש עם ארבעה מיליליטר של DPBS, צנטריפוגה שוב.חזור על שלב זה פעמיים נוספות, ודא כי נפח וקטור מרוכז על המסנן הוא כ 200 microliters לאחר הצנטריפוגה האחרונה. הסר את 200 וקטור מרוכז מיקרוליטר באמצעות פיפטה, ולדחוף אותו דרך מסנן 0.22 מיקרומטר כדי לעקר. לאחר מכן, aliquot 200 microliters לתוך בקבוקון זכוכית עם הכנס שלובים.להזרקת גורמי תכנות מחדש, הצב עכבר הרדמה במסגרת הסטריאוטוקסית. לנהל משככי כאבים מתאימים בתחילת הניתוח, ואז להביא את קצה נימי הזכוכית של מחט ההזרקה ממש מעל bregma. ודאו שהטיפ נימי ישר לחלוטין בשני מטוסי ה-A-P וה-M-L.אפס הן את ערכי M-L והן את ערכי ה- A-P ל- 0.0 ב מונה הקואורדינטות הדיגיטליות. כדי לוודא שראש החיה נמצא במצב שטוח לחלוטין, השתמש ב מונה הקואורדינטות הדיגיטליות כדי למדוד את ערך הקואורדינטות D-V כאשר זרוע ה- A-P נמצאת בפלוס 2.0 ומינוס 2.0 וכן כאשר זרוע ה- M-L נמצאת בפלוס 2.0 ומינוס 2.0. התאימו את גובה השן ואת האוזן בהתאם.לאחר מכן, הרם מעט את המזרק וקדח חור באמצעות תרגיל שיניים בנקודות הציון של ההזרקה. התחל לקדוח באתר, עובד בצורה מעגלית ועדינה. לאחר מכן, מניחים חתיכת גזה כותנה על החתך הפתוח לשטוף את המזרק עם תמיסת מלח.לאחר שטיפה, לצייר בועת אוויר ולאחר מכן microliter אחד של פתרון המכיל את הווקטור ויראלי. ודא כי הפתרון הוויראלי ניתן לדמיין בקלות מתחת לבועת האוויר. לאחר מכן, מנמיך את המזרק, מתקדם לאט לעומק הרצוי, וודא שהמסלול נקי ממשברי עצם.לאחר מכן, להזריק מיקרוליטר אחד של הפתרון הנגיפי בקצב של 0.4 microliters לדקה. כאשר ההזרקה נעשית, לאפשר שתי דקות עבור דיפוזיה לפני נסיגת מזרק. לאחר דיפוזיה, לאט לסגת המזרק עד קצה נימי הוא נסוג לחלוטין מהמוח, ואז בזהירות לתפור את החתך ולהסיר את החיה מן המסגרת stereotaxic.לפקח על החיה בתחנה לאחר הניתוח עד ההכרה היא חזרה. בעלי חיים נשמרים עד 12 שבועות לאחר הזרקת וירוס כדי לאפשר גליה תושב לתכנת מחדש לתוך נוירונים בוגרים. כדי להכין פרוסות מוח לאלקטרופיזיולוגיה באמצעות רטט, חותכים את המוח מהחלק הסטראלי ביותר עד לרמה הסטריאטית במהירות גבוהה.לאחר מכן חתך את הסטריאטום ב-275 מיקרומטר ב-0.1 מילימטרים לשנייה. לאחר כל קטע, להסיר בזהירות את הצד striatal לא מוזרק ולהעביר את הצד מוזרק לתוך בקבוקון עם רשת תחתונה מחומצן CREB להחליק באמבט המים בטמפרטורת החדר. שמור את הבקבוקון בטמפרטורת החדר עד שכל החלקים נחתכים.לאחר מכן, לאט להגדיל את הטמפרטורה של אמבט המים ל 37 מעלות צלזיוס ולהשאיר אותו במשך 30 דקות, ולאחר מכן לכבות את התנור ולתת לו להתקרר לטמפרטורת החדר. לאחר העברת קטע רקמה אחד לתא הקלטה לאלקטרופיזיולוגיה, הר את פיפטה הזכוכית על האלקטרודה המתעדת והורד אותה לתוך הפתרון. בדוק שוב את ההתנגדות של האלקטרודה.לאחר מכן, לאט להתקרב לתא מתוכנת מחדש עם פיפטה, שמירה על לחץ חיובי קל באלקטרודה, כדי למנוע חיבור הקצה, ולבדוק כי התא הוא GFP חיובי לפני תיקון. כאשר התא תוקן, לשמור על התא מהדק הנוכחי ממינוס 60 עד מינוס 70 מילי-וולט, ולהזריק 500 זרמי אלפיות שנייה ממינוס 20 פלוס 90 picoamperes עם 10 מרווחים picoampere כדי לגרום פוטנציאל פעולה. זה מעיד על התבגרות עצבית ותכנות מחדש מוצלח.לאחר מכן, לעבור מלחצי מתח ולמדוד את הנתרן פנימה ועיכוב תיקון זרמי אשלגן בשלבים depolarizing של 10 מיליבולטים. הנה פוסט נרשם ביוצטין מלא נוירון מתוכנת מחדש אשר מראה מורפולוגיה עצבית בוגרת ואת קוצים דנדריטי. כאן, הקלטות אלקטרופיזיולוגיות של הנוירונים מתוכנתים מחדש להראות את נוכחותם של קשרים תפקודיים postsynaptic עם אמצעי פעילות ספונטניים.עקבות להראות את הפעילות מעכבות כי הוא חסום עם picrotoxin, אנטגוניסט קולטן GABAA ואת פעילות סינפלורציה כי הוא חסום עם CNQX, אנטגוניסט קולטן אמפא. הנוירונים המדבקים כבר מראים פעילות פוסט-סינפטית בחמישה שבועות לאחר ההזרקה, וממשיכים בשמונה ו-12 שבועות לאחר ההזרקה. מספר הנוירונים עם פוטנציאל הפעולה המושרה הנוכחי גם עולה עם הזמן.ניתוח מפורט יותר חשף מספר דפוסי ירי ברורים שבהם רוב התאים מראים פעילות ספינג מהירה הדומה ל- parvalbumin interneurons. ניתוח אימונוהיסטוכימי ב 12 שבועות נוספים הראה ביטוי שותף של הכתב GFP ואת parvalbumin. בעקבות הליך זה ניתן לבחון את ביטוי הגן עם טכניקת מחפש טלאי או להעריך את הקישוריות הסינפטית התלת מימדית עם מעקב חד-סינפטי ו- iDISCO.כעת, לאחר שניתן לתכנת מחדש את גליה תושבת לפרבלבומין המבטאת אינטרפרונים, התחלנו לחקור אם אלה אותנטיים וניתן להשתמש בהם ככלי טיפולי. זכור לפעול לפי הפרוטוקולים וההנחיות שנקבעו בעת טיפול בבעלי חיים ושימוש בנגיף AAV.

in-vivo-direct-reprogramming-resident-glial-cells-into-interneurons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

כאן אנו מציגים את הזריקה תוך גולגולתי של וקטורים AAV תיוג הניאון של גליה נוירונים בקליפת המוח הראייתית.

הזרקה תוך גולגולתי של Adeno הקשורים וקטורים ויראליים

סרטון זה מדגים פרוטוקול להערכת ההבשלה והתכנות מחדש של תאי גלייה לתאי עצב בפרוסת סטריאטום של עכבר נגוע. הניסוי מודד את פוטנציאל הממברנה במנוחה ואת התגובה להזרקות זרם באמצעות סמנים פלואורסצנטיים ספציפיים לנוירונים וטכניקות אלקטרופיזיולוגיות. קפיצות מתח במהלך מדידות אלה מצביעות על הבשלה עצבית מוצלחת ותכנות מחדש.

הקלטות אלקטרופיזיולוגיות של תאי עצב מתוכנתים מחדש בפרוסת מוח של עכבר

מקור: Pereira, M. et al., In vivo Direct Reprogramming של תאי גליה תושבים לאינטרנוירונים על ידי הזרקה תוך מוחית של וקטורים ויראליים. J. Vis. Exp. (2019)סרטון זה מדגים הזרקה סטריאוטקסית של נגיף הקשור לאדנו לקליפת המוח של עכבר טרנסגני כדי להעביר תכנות מחדש של עצבים תלויי Cre וגנים מדווחים פלואורסצנטיים לתאי גליה.

הזרקה סטריאוטקסית של וקטורים ויראליים לתכנות מחדש של תאי גליה במודל עכבר

מיקוד תאי מוח תושב לשושלת תכנות מחדש ישיר מציע נקודות מבט חדשות לתיקון מוח. כאן אנו מתארים פרוטוקול של איך להכין את התרבויות מועשרים עבור pericytes מוח תושב מהמבוגר קליפת המוח האנושית ולהמיר אותם לתאי עצב הנגרמים על ידי ביטוי בתיווך רטרווירוס של שעתוק גורמי Sox2 וAscl1.

שושלת תכנות מחדש של תאי שמקורם בpericyte של המוח האנושי למבוגרים לנוירונים מושרה

כאן אנו מדגימים טכניקה להתמרה עצבית נרחבת על ידי הזרקה תוך-חדרית של נגיף הקשור לאדנו למוח העכבר היילוד.  שיטה זו מספקת דרך מהירה וקלה להשיג ביטוי לכל החיים של טרנסגנים המועברים באופן ויראלי.

הזרקת נגיפי Intracerebroventricular של ילודים עכבר המוח לתמרה עצבית מתמשכת ונרחבת

בהתבסס על הנדסת חוץ גופית ויראלי של מראש עצבי, שיתוף ההשתלה שלהם למוח פראי סוג ולזווג הערכה מורמטרית של "מבחן" ו "שליטה" נגזרים, שיטה זו מאפשרת דוגמנות מדויקת של בקרת vivo gene של הנאוקורטילית עצב מורפולוגיה בדרך פשוטה ובמחיר סביר.

השתלת השתלות מהונדסים של הנדסה עצבית בVivo לימודי נוירוארכיטקטורה

כאן אנו מציגים פרוטוקול, שנועד להשתמש כלים גנטיים כדי לתמרן את הפעילות של הושלתי בקליפת המוח הפנימי מושתלים לתוך הקליפה של עכברים לידתיים מוקדם.

השתלת כימוגנטית מהונדס בקליפת המוח ושלתי לתוך המוחות המוקדמים של העכבר לנטאל

אנו מתארים פרוטוקול לתכנת מחדש פיברובלסטים אנושיים שמקורם בעור לתאי אב עצביים המושרים (iNPCs), ואת הבידול הבא שלהם לאסטרוציטים המושרים (iAs). שיטה זו מובילה לייצור מהיר וניתן לשחזור של iNPCs ו- iAs בכמויות גדולות.

אין ויטרו מידול למחלות נוירולוגיות באמצעות המרה ישירה מפיברובלסטים לתאי אב עצביים ובידול לאסטרוציטים

אנו מתארים את ההשתלה התוך-פרנכימלית של תאי אב עצביים אנושיים שעברו התמרות עם וקטור מדווח כפול המבטא חלבון פלואורסצנטי ירוק-לוציפראז (GFP) במוח העכבר. לאחר ההשתלה, אות הלוציפראז נמדד שוב ושוב באמצעות תאים מושתלים in vivo bioluminescence ותאים מושתלים המבטאים GFP שזוהו בחתכי מוח באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.

השתלה תוך-מוחית ומעקב ביולומינסנציה In Vivo של תאי אב עצביים אנושיים במוח העכבר

כאן אנו מתארים פרוטוקול מפורט ליצירת תרביות מועשרות מאוד של אסטרוציטים שמקורם באזורים שונים במערכת העצבים המרכזית של עכברים לאחר הלידה ואת המרתם הישירה לנוירונים פונקציונליים על ידי ביטוי כפוי של גורמי שעתוק.

בידוד ותכנות מחדש ישיר של נוירונים של אסטרוציטים של עכברים

חקור שיטה להמרת תאי גליה תושבים לתוך אינטרניורונים בוגרים בעכברים באמצעות וקטורים ויראליים מסוג AAV. השיטה מאפשרת יצירת נוירונים חדשים ישירות במוח לטיפולים עתידיים בהפרעות פסיכיאטריות.

בתוך Vivo ישיר של תאים Glial תושב לתוך Interneurons על ידי הזרקת גרם של וקטורים ויראלי

גלה סרטונים נוספים