הכנה ויישום של ביוסנסור בקטריאלי חדש לאיתור שוערת של שאריות ירי
9 במאי 2019
פרוטוקול מוצג באמצעות טכניקות ביולוגיה סינתטי כדי לסנתז סט של חיישנים ביולוגיים לניתוח שאריות ירי, כדי לבדוק את תפקוד המכשירים לשימוש המיועד שלהם באמצעות ספקטרוסקופיית הזריחה.
פרוטוקול זה מתאר את ההכנה והניתוח של biosensor ייחודי שתוכנן לזהות את הרכיבים הכימיים של שאריות ירייה. השימוש בביוסנסורים ליישומים משפטיים הוא ייחודי. הוא מייצג בעלות נמוכה, פשוט לשימוש חלופה מכשור מיוחד מאוד המשמש בדרך כלל במעבדות משפטיות.
ניתן להשתמש בשיטות הביולוגיה הסינתטיות המתוארות עבור כל מערכת המשתמשת בחלקי ביולוגיה סינתטיים סטנדרטיים. הניתוח הכימי המתואר חל על כל ביזנסור המבטא חלבון פלואורסצנטי אדום. הדגמת ההליך תהיה אנדריאה סולס ואל ריצ'רדסון, סטודנטים לתואר ראשון באוניברסיטת לונגווד.
כדי להתחיל בהליך זה, להוסיף עשרה microliters של ה-DNA פלסמיד J10060 מבודד בעבר לצינור microcentrifuge. הוסף שמונה מיקרוליטרים של מים, ומיקרוליטר אחד של כל אחד מהאנזימים EcoRI ו- NHEL מעורבב מראש עם מיקרוליטר אחד של חיץ. לדנ"א של האמרגן, הוסיפו עשרה מיקרוליטרים של רצפי דנ"א של מקדמים חישולים לצינור מיקרוצנטריפוגה טרי.
הוסף שמונה מיקרוליטרים של מים, ומיקרוליטר אחד של כל אחד מהאנזימים EcoRI ו- NHEL מעורבב מראש עם מיקרוליטר אחד של חיץ. באמצעות פיפטה להגדיר עשרה microliters, בעדינות pipette את הדגימות למעלה ולמטה לערבב. דגירה הדגימות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות.
לאחר מכן, מחממים ופעילים את האנזימים ב 80 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. לאחסן את ה-DNA מתעכל במקפיא עד מוכן להמשיך. ראשית, השתמש בדנ"א הפלסמיד והמקדם שעוכל בעבר כדי להגדיר את התגובה בצינור מיקרו-סטריפוגה על קרח, כמתואר בטבלה אחד מפרוטוקול הטקסט.
הקפד להוסיף את T4 DNA Ligase האחרון. פיפטה מעלה ומטה בעדינות כדי לערבב את התגובה, וצנטריפוגה בקצרה. דגירה בטמפרטורת החדר במשך עשר דקות.
לאחר מכן, מחממים ומפעילים ב 65 מעלות צלזיוס במשך עשר דקות. בצע את ההמרה כמפורט בפרוטוקול הטקסט. תחילה, הגדר את תערובות התגובה עבור PCR כמפורט בטבלה 2 של פרוטוקול הטקסט.
בעדינות פיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב את התגובות. באמצעות קצה פיפטה צהוב, לגרד מושבה של E.coli טרנספורמציה. העבר החלקה של E.coli זה על לוחית אגר LB-אמפילין חדשה שנוקטעה, ולאחר מכן הכנס את קצה פיפטה לתוך צינור PCR.
לנער את קצה פיפטה לערבב את E.Coli עם תערובת PCR. חזור על תהליך זה שלוש פעמים נוספות עבור מושבות נוספות. לאחר מכן, לטעון את צינורות PCR לתוך מכונת PCR, ולהתחיל תרמוסיקלינג כפי שמתואר בטבלה שלוש של פרוטוקול הטקסט.
כדי להתחיל לתייג את המספר המתאים של צינורות תרבות סטרילית כמפורט בטבלה הרביעית של פרוטוקול הטקסט. מוסיפים שני מיליליטר של מרק התרבות המוכן לכל צינור. הוסף את פתרון מלאי אנילייט לצינורות כמתואר בטבלה ארבע.
לאחר מכן, מניחים את כובעי הצמד על צינורות התרבות, כך שהם רופפים כדי לאפשר זרימת אוויר לתוך הצינור. וורטקס כל צינור תרבות. לאחר מכן, מניחים את הצינורות לתוך אינקובטור רועד ב 37 מעלות צלזיוס וב 220 סל"ד לפחות 24 שעות.
ראשית, השתמש במגבון מבוסס אתנול המיועד להסרת עופרת כדי לנגב את כל משטחי הידיים, כולל בין האצבעות. לאחסן את המגבונים בשקית איטום שכותרתו כראוי עד לניתוח. השתמשו במגבון מבוסס אלכוהול כדי לנגב משטחים גדולים לבדיקה.
השתמש בהחלפת כותנה לחה עם אתנול כדי לנגב את כל המשטחים הקטנים כדי להיבדק. לובש כפפות נקיות באמצעות מספריים כי כבר ניקה עם אלכוהול, לחתוך קטע כי הוא כ סנטימטר מרובע אחד ממרכז הניגוב. לאחר מכן, מניחים את חתיכת לחתוך של לנגב, או צמר גפן ספוגית, ישירות לתוך צינור תרבות המכיל שני מיליליטר של חיידקי החיישן, ולהבטיח כי הוא שקוע לחלוטין במרק.
הכינו את הספקטרומטר לאיסוף הגשה פלואורסצנטית באורך הגל המתאים לגרסת RFP, עם אורך גל של 500 ננומטר. לאחר מכן, השתמש מערבל מערבולת לנער את הצינורות. מעבירים בזהירות כל על-טבעי לפחית בנפח נמוך, ואוסף את עוצמת הפליטה.
באמצעות מערבל מערבולת, לנער את הצינורות. מעבירים 200 מיקרוליטרים של המרק לגם בצלחת הטובה. הקלט אילו דגימות נכנסו לכל באר של צלחת זו.
הגדר את מד הקמח כדי לאסוף את עוצמת הפליטה באורך הגל המתאים עבור גרסה RFP. ספקטרום הפלואורסצנטיות עבור גרסה RFP מייצגת מראה הן את השליטה השלילית והן את הספקטרום בשתי רמות שונות של אנילייט שנוספו. האות הפלואורסצנטי המרבי עבור וריאנט RFP המשמש בעבודה זו נצפה ב 575 ננומטר.
נתונים מייצגים נאספים עבור אותה קבוצת פתרונות, הן מהספקטרומטר הנייד והן מהנוהורמטר. יש מגמה כללית של הפלואורסצנטיות עולה כמו הריכוז של אנילייט עולה. ראוי לציין כי בריכוזים גבוהים, מעל 800 חלקים למיליארד עבור חיישן העופרת, התגובה יורדת בשל הרעילות של עופרת בריכוז כה גבוה.
ניתוח של דגימות ספוגית אתנול מבפנים של מעטפת מחסנית 40 קליבר בילה מספק הוכחת תוצאות עקרוניות. התוצאות החיוביות מכל אחד משלושת חיידקי החיישן מצביעות על בדיקה חיובית לשאריות ירייה. ניתן להשתמש בביוסנסורים שהוכנו בפרוטוקול זה גם בנפרד כדי לזהות זיהום בדגימות מזון, מים או סביבה.
טכניקה זו סוללת את הדרך לחוקרים לפתח biosensors באמצעות טכניקות ביולוגיה סינתטית סטנדרטית עבור מגוון רחב של אניליטים כימיים שונים. ציוד מגן אישי צריך להיות משוחק, אנליסטים צריכים לשטוף ידיים ולחטא משטחים לאחר טיפול E.coli. פסולת צריכה להיות autoclaved, וכל פסולת המכילה מתכת כבדה יש לטפל בהתאם.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מתאר את הסינתזה של חיישנים ביולוגיים (biosensors) בקטריאליים שנועדו לזיהוי שאריות ירי. באמצעות טכניקות של ביולוגיה סינתטית, החיישנים הביולוגיים מציעים חלופה זולה לשיטות פורנזיקה מסורתיות.
מרכיבי מחקר מרכזיים
תחום מדעי
- מדע פורנזי
- ביולוגיה סינתטית
- ביוטכנולוגיה
רקע
- ביוסנסורים מספקים גישה חדשנית לזיהוי רכיבים כימיים ביישומים פורנזיים.
- ניתוח פורנזי מסורתי מסתמך לעיתים קרובות על מכשור יקר ומורכב.
- ניתן להתאים שיטות של ביולוגיה סינתטית ליישומים שונים באמצעות חלקים סטנדרטיים.
- חלבונים פלואורסצנטיים משמשים בדרך כלל בתכנון ביוסנסורים לצורך זיהוי ויזואלי.
מטרת המחקר
- פיתוח חיישן ביולוגי (biosensor) חסכוני לניתוח שאריות ירי.
- הדגמת התפקוד של החיישנים הביולוגיים באמצעות ספקטרוסקופיה של פלואורסצנציה.
- מתן פרוטוקול שניתן ליישום במערכות של חיישנים ביולוגיים אחרים.
שיטות שהשתמשו בהן
- סינתזה של ביו-חיישנים בקטריאליים באמצעות טכניקות של ביולוגיה סינתטית.
- ספקטרוסקופיה של פלואורסצנציה לבדיקת תפקוד הביו-חיישנים.
- הכנת ביו-חיישנים לזיהוי רכיבים כימיים ספציפיים.
- הדגמת הפרוצדורה על ידי סטודנטים לתואר ראשון.
תוצאות עיקריות
- הביוסנסורים זיהו בהצלחה רכיבים של שאריות ירי.
- ספקטרוסקופיה של פלואורסצנציה הדגימה ביעילות את התפקוד של הביוסנסורים.
- הפרוטוקול ניתן להתאמה ליישומים שונים של ביוסנסורים.
- סטודנטים לתואר ראשון ביצעו את ההליך בהצלחה.
מסקנות
- ביו-חיישנים בקטריאליים מהווים כלי מבטיח לניתוח פורנזי.
- גישה זו מציעה חלופה פשוטה וזולה יותר לשיטות מסורתיות.
- המחקר מדגיש את הפוטנציאל של ביולוגיה סינטטית ביישומים פורנזיים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית לדרג ניהולי
חיישנים ביומטריים חיידקיים כגון MicRoboCop מציעים פלטפורמה מודולרית וזולה לזיהוי אנליטים כימיים ספציפיים, התומכת בתיקוף מטרות בשלבים מוקדמים ובצמצום סיכונים מכניסטיים במו"פ של ביו-פרמה. יכולתם להפיק אותי פלואורסצנציה כמותיים בתגובה למטרות מוגדרות מאפשרת בדיקה חזקה של היפותזות ופיתוח של בדיקות (assays). גישה זו מגבירה את הביטחון החזוי ותומכת בתעדוף תיקי פיתוח על ידי אספקת מערכות זיהוי ניתנות להרחבה ולשימוש חוזר, הניתנות להתאמה לאנליטים מגוונים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה של מטרות כימיות או ביולוגיות באמצעות ספציפיות הנדסית בתכנון ביו-חיישנים.
- תומך בתיקוף תפקודי של מבנים של ביולוגיה סינתטית לזיהוי אנליטים.
- מסייע בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי אספקת קריאות כמותיות וישירות של מעורבות המטרה.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מכין זני ביוסנסורים מאושרים לשילוב בתהליכי סינון בסריקה רחבה (high-throughput screening).
- מספק פלטי פלואורסצנציה סטנדרטיים וניתנים לשחזור עבור פיתוח בדיקות כמותיות.
- מאפשר הערכה מהירה של תכולת אנליטים בדגימות או תרכובות, עם פוטנציאל לפלטפורמה ניתנת להרחבה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מספק גישור משלב הגילוי לשלב התיקוף הפרה-קליני עבור זיהוי אנליטים סביבתיים או רעילים.
- תומך בהתאמה של סממנים ביולוגיים תרגומיים כאשר הוא מותאם למטרות כימיות הרלוונטיות למחלה.
- מציע הפחתת סיכונים חזויה עבור יישומים של אבחון או ניטור מבוססי חיישנים ביולוגיים.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
פלטפורמה זו של חיישנים ביולוגיים משתלבת ברצף שבין הגילוי לשלב הפרה-קליני, ובכך מאפשרת בדיקה מוקדמת של היפותזות, סטנדרטיזציה של בדיקות והמשכיות תרגומית לזיהוי אנליטים כימיים.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בזיהוי מונחה-השערה של אנליטים ספציפיים באמצעות מערכות E. coli מהונדסות.
- סריקה: מספק פלטי פלואורסצנציה כמותיים וניתנים לשחזור לצורך בדיקת מוכנות של האסיי והערכת תרכובות.
- אנליטיקה: מאפשר מדידה ישירה של ריכוז האנליט באמצעות עוצמת הפלואורסצנציה, ובכך תומך בניתוח השוואתי.
- מחקר תרגומי: ניתן להתאמה לצורך תיקוף פרה-קליני של זיהוי מבוסס ביו-סנסור בדגימות סביבתיות או ביולוגיות.
- שימוש חוזר ארגוני: ניתן להגדיר מחדש את הפלטפורמה עבור מטרות מגוונות, מה שתומך בתועלת רחבה עבור מו"פ.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי ומפחית עמימות מכניסטית בזיהוי אנליטים.
- ערך תפעולי: מספק תהליכי עבודה של ביו-סנסורים בסטנדרט אחיד, ניתנים להרחבה ושחזירה.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת החלטות ה-go/no-go ואת היעילות ההונית על ידי אפשור סריקה מהירה בעלות נמוכה.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכונים ובקידום של פלטפורמות זיהוי מבוססות ביו-סנסורים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בביולוגיה סינתטית ובאנליזה מבוססת פלואורסצנציה.
- נדרשת גישה למכשור סטנדרטי לביולוגיה מולקולרית ולתשתית גילוי פלואורסצנציה.
- נדרש תקינה בין-צוותית להכנת ביו-סנסורים ולפרוטוקולי בדיקה.
- התאמה לאנליטים או לסוגי דגימות שונים עשויה לדרוש תכנון מחדש ותיקוף של הקונסטרקט.
- מגבלות זמן התגובה עשויות להשפיע על ההתאמה לתרחישי גילוי מהיר.
שאלות נפוצות בתחום הביו-פארמה
Chapters in this video
0:04
Title
0:47
Restriction Enzyme Digestion
1:50
Ligation
2:29
Colony PCR
3:14
Titrating E. coli to Check Function of Device
3:54
Using E. coli as Chemical Sensor for GSR
4:44
Fluorescence Analysis Using Portable Spectrometer
5:09
Fluorescence Analysis Using 96-well Plate Reader
5:34
Results: Analysis of the Biosensor and Presumptive Detection of Gunshot Residue
6:29
Conclusion
