ברזולוציה גבוהה הדמיה של דינמיקה גרעינית בתאים חיים תחת מתיחה Uniaxial המתח

עיצבנו בעבר מכשיר כדי להחיל זן מכני על תאים חסידים. בעבודה הנוכחית, עיצבנו מחדש את הגיאומטריה של תת-המצע והתאמנו אישית את ההתקנה להדמיה ברזולוציה גבוהה של תאי זן אלה. היתרון העיקרי של מערכת זו מתיחת תאים היא שהיא מספקת הדמיה תת תאית ברזולוציה גבוהה ב 100x של תאי המתח.

הפגנת ייצור התת-סטרטום תהיה ויקי, עוזרת מחקר מהמעבדה שלי. התחל בתכנון תבנית פולי דימימתילסילוקסאן באורך של באר אחת על-ידי ביצוע בפרוטוקול הטקסט הנלווה. לאחר מכן, מערבבים 20 חלקים של בסיס polydimethylsiloxane עם חלק אחד ריפוי סוכן ב חד פעמית.

לאחר ערבוב, מניחים את תערובת polydimethylsiloxane בוואקום de-gasser ב 0.8 בר במשך 30 דקות כדי להסיר את הבועות מן התערובת. לאחר מכן, יוצקים את תערובת polydimethylsiloxane לתוך התבנית ואת המנה. הסר את כל בועות נוספות בשלב זה על ידי de-gassing אותו שוב ב 0.8 בר ואקום במשך 30 דקות.

כאשר ביטול הגזים הושלם, אופים את הדגימות ב 80 מעלות צלזיוס על שולחן פילינג במשך שעתיים. לאחר מכן, להסיר בזהירות את הדגימות מהתנור ולתת להם להתקרר לטמפרטורת החדר. חותכים את הקצוות עם להב בעדינות לקלף את polydimethylsiloxane נרפא.

על פולידימתילסילוקסאן בקוטר 150 מילימטר, צייר רשת של שני סנטימטרים בשני סנטימטרים עם סמן. בתוך כל ריבוע, לצייר סנטימטר אחד על ידי ריבוע סנטימטר אחד, משאיר מרווח של 0.5 ס"מ מכל הצדדים. השתמש בלהב כדי לחתוך בזהירות לאורך הקווים ולקבל תאים מרובעים.

לאחר מכן, לנקות את הדגימות על ידי דגירה אותם 100% אצטון במשך ארבע שעות, 100% אתנול במשך ארבע שעות נוספות, ולאחר מכן במים autoclaved במשך ארבע שעות. מניחים את הדגימות המנוקות על נייר גיבוי של סרט פרפין בתוך צלחת פלסטיק בקוטר 150 מ"מ ומייבשים את הדגימה בתנור של 80 מעלות במשך ארבע שעות. בסיום, לאטום את הכלים עם סרט פרפין ולאחסן אותם בחדר קר עד לשימוש נוסף.

להכין תאים מולדים ולהשעות אותם במדיום התפשטות. זרע תאים אלה בצפיפות של 35, 000 תאים לס"מ מרובע על משטחי פלסטיק מצופים PDL. כוונן את נפח אמצעי ההתפשטות לשלושה מיליליטר לכל עשרה ס"מ בריבוע של שטח הפנים.

נפח נמוך יותר של מדיה עלול להוביל לגוש תאים, הנובע ממתח פנים, בעוד נפח גבוה יותר של מדיה במנות עלול לגרום לתקשורת לזלוג. ביום השלישי לאחר הזריעה, לקצור את התאים ול לספור אותם באמצעות hemocytometer. לאחר מכן, זרע 35, 000 תאים לכל צלחת polydimethylsiloxane עם 700 microliters של מדיום התפשטות.

לאחר מכן, הוסיפו מבנה פלסמי לתיוג מתחמי H2B של התא עם חלבון פלואורסצנטי ירוק על ידי ביצוע הוראות היצרן. לאחר 24 שעות, הר את דגימות polydimethylsiloxane עם תאים להיות מתוח על המכשיר זן uniaxial. לאחר מכן, לשנות את המדיום בכל הדגימות למדיום ההתברות.

למדוד את אורך תא התא ללא מעצורים ולהפוך את בורג מיקרומטר הבמה כדי להגדיל את אורך תא התא על ידי כמות הרצויה של המתח. השאירו את דגימות הפולידמימתילסילוקסאן המתוחות והבלתי מרוסנות באינקובטור ב-37 מעלות צלזיוס עד להדמיה. הכינו את חממת המיקרוסקופ להדמיה חיה על ידי קביעת טמפרטורת החממה ל-37 מעלות צלזיוס.

לאחר מכן, להביא יעד טבילת שמן 100x לעמדה המרכזית, כמו התור האובייקטיבי לא יהיה נגיש מאוחר יותר. ברגע בעמדה, לבטל את המטרה לדפוק אותו בחזרה יחד עם טבעת אובייקטיבית, כך המטרה ניתן לקרב את התאים. לאחר מכן, להוסיף טיפת שמן למטרה.

בעזרת מחזיק מודפס בהתאמה אישית, מצפים את המחזיק בשומן ואקום בשולי החלון ומ מניחים כיסוי זכוכית בעובי אפס מספר על המשטח העליון של המחזיק. תדביק את חלון הפלסטיק לשלב המיקרוסקופ. לאחר מכן, בורג שלב תרגום Z על הבמה מיקרוסקופ להעביר אותו למיקום Z העליון ביותר.

הסר 500 microliters של המדיום מן צלחת polydimethylsiloxane מתוח להיות בתמונה, ולהוסיף מדיום זה על כיסויי הזכוכית בחלון פלסטיק לבן. לאחר מכן, השתמש בזוג פינצטה סטרילית כדי לנתק בזהירות את התא המרובע מצלחת polydimethylsiloxane. החזק את התקן המתח במצב זקוף כך שהתאים פונים כלפי מעלה, מעל חלון הפלסטיק הלבן והפוך בזהירות את התקן המתח, כדי לאפשר לכל מדיום נוסף לרדת ישירות באמצע כיסוי הזכוכית כשהתאים פונים כלפי מטה.

מקם את החלק התחתון של התקן המתח על במת התרגום Z באמצעות קלטת דו-צדדית כדי להחזיק אותו במקומו. תוך כדי התבוננות דרך העינית תחת שדה בהיר, לאט מאוד להביא את התקן המתח למטה ולהזיז את המטרה למעלה כדי להתמקד בתאים. בצעו את צעד ההתמקדות באיטיות, לסירוגין בין הורדת שלב תרגום Z לבין העלאת המטרה.

אם שלב התרגום Z מוריד יותר מדי, התאים יכולים לדחוס ומכאן למות. אם אנחנו מעלים את המטרה גבוהה מדי, זה יכול לשבור את כיסוי הזכוכית ולגרום למדיום לדלוף. סרוק את לוחית הפולי דימימתילסילוקסאן בכיווני X ו- Y כדי למצוא תא שיש לו גרעין פלואורסצנטי, באמצעות תפרחת ב 488 ננומטר עירור.

כמו כן, ודא שלתא יש מורפולוגיה מתאימה בעת התבוננות בדגימה תחת שדה בהיר. הקלט תמונות רחבות-שדה או פתח-חור של הגרעין עם 488 ננומטרים של עירור באורך גל ותא עם עירור שדה בהיר במרווחים של 30 שניות למסגרת למשך כולל של 30 דקות לפחות. הגיאומטריה שעוצבה מחדש של תת-האסטרטום polydimethylsiloxane ומערך ההדמיה המוצג בסרטון זה ממזערים את המרחק בין התאים לבין המטרה.

זה מאפשר הדמיה לשגות זמן של גרעיני תאים המסומן באופן פלואורסצנטי באמצעות מטרה טבילת שמן 100x. כדי למדוד את התנודות הגרעיניות, תחילה לתכנן את האזור הגרעיני לעומת הזמן. לאחר מכן, לחץ על הנתונים באמצעות פולינום מסדר שלישי.

ולבסוף, תנודות שיורית העלילה ולחשב סטיית תקן של התנודות שיורית. התנודות הגרעיניות של תאי האחווה אוליגודנדרוציטים, בעקבות אינדוקציה כימית של התברואה עם ובלי זן מתיחה של 10%, מראות כי עם אינדוקציה כימית בלבד, משרעת של תנודות גרעיניות הראתה ירידה משמעותית ב 48 שעות, אבל לא ב 24 שעות. מצד שני, אינדוקציה כימית יחד עם זן מתיחה 10% הראו ירידה משמעותית ב 24 שעות, אשר נשאר קבוע ללא הפחתה נוספת ב 48 שעות.

הדבר החשוב ביותר שיש לזכור הוא כי מרחק העבודה של המטרה שנבחרה צריך להיות שווה או גדול יותר מעומק תא התא בתוספת עובי הכיסוי. ניתן לעצב מחדש את תת-המצע כך שישלב רשת, דבר שיקל על הדמיית אותו תא לפני ואחרי יישום של זן, שכן סוג של ערכת נתונים לפני ואחרי מפחית את הרעש המגיע משגיאה ניסיונית. באמצעות הגדרת הדמיה זו, ניתן לדמיין תופעות תת-תאיות רבות בתאים חיים חסידיים, כגון לוקליזציה של חלבונים או דינמיקה של רכיבים תאיים, תוך שניות מיישום הזן המכאני.