הדמיה אינטגרין מתח וכוח הסלולר ברזולוציה כחיוניים עם חיישן המתח אינטגרטיבית

חיישן מתח אינטגרטיבי מבוסס DNA זה, או ITS, המרת אות כוח פלואורסצנטיות באופן מקומי מאפשר הדמיה ישירה של כוח תאי עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי. ל-ITS רזולוציה מרחבית גבוהה ורגישות גבוהה. סף ההפעלה ניתן לכוונון, ומאפשר תמונה סלקטיבית של מתח אונטגרין ברמות שונות.

לאחר קבלת ה- DNA החד-גדילי המותאם אישית, או ssDNA, מעניין, כדי להצטייד פפטיד RGD כדי quencher ssDNA thiolated, תחילה להוסיף 100 microliters של 0.5 טוחנת EDTA ב 400 microliters של מים על 450 microliters של פתרון TCEP מוכן טרי. לאחר מכן, הוסיפו 10 מיקרוליטרים של פתרון TCEP-EDTA ל-20 מיקרוליטרים של quencher DNA של תיול מילימולרי אחד ב-PBS עבור דגירה של 30 דקות בטמפרטורת החדר. כדי להצמיע אמין RGD עם סולפו-SMCC, להוסיף 40 microliters של 23 מילימטרים טריים sulfo-SMCC כדי 100 microliters של 11 מילימולרית טרי RGD אמין פתרון עבור דגירה 20 דקות בטמפרטורת החדר.

כדי להצטלב RGD אמין SMCC עם quencher ssDNA thiolated, לערבב את כל הנפח של פתרון quencher ssDNA thiolated עם כל הנפח של פתרון SMCC אמין RGD עבור דגירה של שעה אחת בטמפרטורת החדר. בסוף הדגירה, מעבירים את הפתרון לאחסון של ארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה. למחרת בבוקר, מערבבים נתרן כלורי טוחנת עם תספורת הדנ"א של תיול ומינוס 20 מעלות צלזיוס, מצונן, 100%אתנול ביחס של 1 עד 10 ל-25, ומניחים את התגובה במינוס 20 מעלות צלזיוס למשך כ-30 דקות.

כאשר הדנ"א זירז, לאסוף את ה-DNA על ידי צנטריפוגה, ולתלות מחדש את גלולה PBS למדידת ריכוז ה-DNA על ספקטרומטר. עבור חיישן מתח אינטגרטיבי, או ITS, סינתזה, מערבבים את פתרונות הדנ"א של הגדיל העליון והתחתון ביחס של 1.1 ל-1 טוחן, ודגירה את התגובה בן לילה בארבע מעלות צלזיוס לפני הנחת אליצים של התערובת במינוס 20 מעלות צלזיוס לאחסון לטווח ארוך. עבור קיבוע שלה, מעיל 29 מילימטר קוטר, צלחת פטרי תחתון זכוכית עם 200 microliters של 0.1 מיליגרם למיליליטר biotinylated סרום בסרום אלבומין, או BSA-ביוטין, במשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס.

כאשר BSA-ביוטין יש סופח פיזית על משטח הזכוכית, לשטוף את המנה שלוש פעמים עם 200 microliters של PBS טרי לכל לשטוף, ואחריו דגירה עם 200 microliters של 50 מיקרוגרם למיליליטר של חלבון אבידין במשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס. בסוף הדגירה, לשטוף את המנה שלוש פעמים עם PBS כפי שהוכח, ולהוסיף 200 microliters של 0.1-micromolar ITS עבור דגירה נוספת של 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס. בסוף הדגירה, לשטוף את המנה שלוש פעמים עם PBS, משאיר את הכביסה האחרונה בצלחת עד ציפוי התא.

כדי ליזום תרבות קרטוציטים של דגים, השתמשו בטווייזר שטוח קצה כדי לתלוש חתיכת קנה מידה מדג, וללחוץ בעדינות את הסולם על באר של צלחת פטרי עם תחתית זכוכית, כאשר הצד הפנימי של הסולם יוצר קשר עם הזכוכית. המתן כ-30 שניות עד שקנה הדגים ייצמד למשטח הזכוכית של המנה לפני שיכסה את הסולם במילימטר אחד של המדיום השונה של איסקוב. לאחר מכן, הדגירה את הסולם בתיבה כהה ולחה במשך שש עד 48 שעות בטמפרטורת החדר.

כדי צלחת keratocytes על פני השטח של ITS, להחליף את המדיום מן צלחת תרבות keratocyte עם פתרון ניתוק תא 1X עבור דגירה של שלוש דקות בטמפרטורת החדר. בסוף הדגירה, החלף את פתרון הניתוק במדיום שלם טרי, ונתק את התאים בצינורות עדינים. לאחר מכן, להתאים את התאים לריכוז המתאים לציפוי, וזרע אותם על צלחת מצופה ITS במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר לפני הדמיה.

להדמיית מתח מעין-בזמן אמת בתאים חיים, העבר את התאים לשלב של מיקרוסקופ פלואורסצנטי ובחר את המטרה 40 או 100 פעמים. בתוכנת ההדמיה, הגדר את זמן החשיפה לשנייה אחת ואת מרווח המסגרת של 20 שניות כדי לקבל וידאו של תמונות ITS. לאחר מכן, השתמש בתוכנה מתאימה לניתוח תמונות כדי להחסיר מסגרת קודמת של הווידאו ITS ממסגרת נוכחית כדי לחשב את אות ITS שהופק לאחרונה במרווח המסגרות האחרון.

אות ITS החדש המיוצר מייצג את המתח האטרגרי שנוצר במרווח המסגרת האחרון, ובכך מדווח על הכוח הסלולרי בזמן אמת. כאן, מיפוי מתח integrin מדגים את ההטבה של מתח integrin בשני מסלולי כוח במהלך נדידת keratocyte. הרזולוציה של מפת הכוח יכולה להיות מכוילת ל-0.4 מיקרומטר.

מתח איטגרין גבוה מתרכז בשוליים האחוריים של קרטוציטים דגים מוטילים. בתאים לא מוטיבציה, נוצרת תבנית מתח איטגרית ספציפית השונה למדי מזה שנצפה בקרטוציטים הנודדים במהירות. הידבקויות מוקד ואת המתח integrin של קרטוציטים דגים ניתן דימוי משותף כדי להעריך את הקשר בין מתח integrin ומבנה התא בתאים של עניין.

עם ITS, כוח הידבקות התא הופך גלוי עם רזולוציה ורגישות דומה הדמיה מבנית התא. טכניקה זו סוללת את הדרך לחקר יחסי מין של מבנה כוח בתאים.