Name: המשך תלת-מימדי של ביוריאמים מהונדסים עם מעשה-זה-בעצמך ביורינטר (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: למד הדפסה תלת-ממדית של ביוריאמים מהונדסים באמצעות מדפסת ביתית זולה ודיו ביולוגי מבוסס אלגינט. שיטה זו מאפשרת יצירת מודלים לפיתוח טיפולים אנטיבקטריאליים חדשים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכת על ידי מענק AOARD (לא. FA2386-18-1-4059), הארגון ההולנדי למחקר מדעי (NWO/OCW) במסגרת הגבולות של תוכנית ננו מדעים, ואת החומרים המתקדמים NWO-NSFC תוכנית (No. 729.001.016). המחברים מכירים בסיוע מעבדה של רמון ואן דר ואלק ורולנד קיפר.

1. המרה של מדפסת תלת-ממדית מסחרית לביורימטר תלת-ממדי
<ol><li>הסר את הבלטת ממד ואת החימום של מדפסת תלת-ממדית מסחרית (טבלת חומרים) ממסגרת המדפסת, ונתק את החיווט השולט ברכיבים אלה מלוח המעגלים הראשי (איור 1a). מאחר שהחיישן השולט בטמפרטורה התפעולית של המדפסת צריך להיות פונקציונלי לקיים תקשורת עם תוכנת המדפסת, הסר מתוכנת ההדפסה את האלגוריתם העכב את ההדפסה עד שתגיע לטמפרטורה המבצעית.</li>
	<li>לחבר טיפ פיפטה (200 μL) באמצעות אבובים סיליקון (קוטר פנימי של 1 מ"מ) ל-5 מזרק mL שנטען למשאבת מזרק. הקצה את עצת הפיפטה על הראש של מדפסת תלת-ממדית כתחליף לדגם1Bהמקורי.</li>
	<li>אם נעשה שימוש ביותר מסוג אחד של דיו ביולוגי, יש לטעון מערכות אבובים נוספות וקצות פיפטה למדפסת.</li>
</ol>2. הכנת מצע להדפסת תלת מימד
<ol><li>הוסף 4 מ ל של 5 M CaCl2 פתרון ל 400 mL של 1% w/v אגר מומס לוריא ברטני ציר (LB) בינונית, בתוספת עם אנטיביוטיקה המתאים השראות (כאן 34 μg/mL כלוראמנקול ו 0.5% rhamnose).</li>
	<li>לחלק 20 מ ל של הפתרון LB-אגר לתוך כל 150 mm x 15 מ"מ צלחת פטרי. יבש 30 דקות בטמפרטורת החדר עם המכסה חצי פתוח. הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול באמצעות אחסון מצעים אלה ב -4 ° c עד מספר ימים.</li>
</ol>3. הכנה לביו-דיו
<ol><li>להכין תמיסת נתרן קילוף פלסטיצידיות (3% w/v), וחום לנקודת רתיחה שלוש פעמים כדי לחטא את הפתרון. החנות ב-4 ° צ' עד לשימוש.</li>
	<li>לגדול E. COLI MG1655 PRO ΔcsgA ompR234 (e. coli ΔcsgA) חיידקים נושאים פלמידים pSB1C3-ירוק פלורסנט (gfp) (הביטוי gfp)2 או PSB1C3-gfp-csga (קונסטיטוטיב ביטוי gfp, Rhamnose-inducible csga ביטוי) לילה ב 37 ° צ' עם טלטול ב 250 סל ד ב 50 mL של LB בינונית המכילה 34 μg/mL כלוראמנול ו 0.5% rhamnose.</li>
	<li>צנטריפוגה את תרבות התא עבור 5 דקות ב 3,220 x g כדי גלולה החיידקים. . הסר את הסופרנטאנט</li>
	<li>מחדש להשעות את הגלולה בקטריה 10 מ ל של LB בינונית ולהוסיף 10 מ ל של נתרן קילוף פלסטיצידיות (3% w/v).</li>
</ol>4. תהליך הדפסה תלת-ממדי
<ol><li>התקן ופתח את תוכנת ההדפסה התלת-ממדית (טבלת חומרים) במחשב. חבר את המדפסת התלת-ממדית למחשב. הזז את ראש ההדפסה למיקומה הביתי על-ידי לחיצה על לחצן הבית עבור הצירים X, Y ו-Z.</li>
	<li>עבור כל הדפסה, הצב מצע הדפסה מוכן על מיקום מסוים במיטת ההדפסה.</li>
	<li>כיול הגובה של ראש ההדפסה בציר Z.<ol>
<li>הרם את ראש ההדפסה לגובה של 22 מ"מ תחת שליטה ידנית, כך שהוא לא יהיה מתנגש עם קצה של צלחת פטרי בעת המעבר למיקום הרצוי. הצב את ראש ההדפסה מעל הלוח והזז אותו למטה עד שתיאור הפיפטה ייצור קשר עם משטח ההדפסה. הקצה מיקום ציר Z זה כ-Z1 (הגובה של משטח ההדפסה).</li>
		<li>הרם את ראש ההדפסה והזז אותו מחוץ לאזור הלוח באמצעות שליטה ידנית בצירים של X, Y ו-Z. אם מרחק העבודה בין ראש ההדפסה לבין משטח הלוח מוגדר כ-Z2, הזן Z1 + Z2 לתוך תוכנית ההדפסה כערך Z במהלך ההדפסה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>תכנת את צורת ההדפסה בשיטת קואורדינטות מפותחת של נקודה-אחר-נקודה בהתאם לנתיב הרצוי.<ol>
<li>אם הנתיב הרצוי הוא קו ישר, הגדר רק את נקודות ההתחלה והסיום. כלילת נקודות נוספות על קווים מעוקלים תגרום לעקומות חלקות יותר. הזז את ראש ההדפסה באופן ידני לכל נקודה ברציפות, והקלט את הקואורדינטות של נקודות אלה לפי הסדר. הזן את כל הקואורדינטות הללו וכן את מהירות הזזת ראש ההדפסה עבור כל פלח מודפס בעורך קוד ה-G.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הן לפני והן אחרי ההדפסה, הרם את ראש ההדפסה למרחק גבוה יותר מקצה הלוח (20 מ"מ) ועבור ישירות אל מחוץ לאזור הלוח. שמור תוכנית זו כקובץ קוד G וטען ישירות לשימוש בהדפסות עוקבות, תוך מדידת מחדש של גובה ציר Z עבור כל מצע הדפסה חדש. הערה: ראו טבלה 1 לדוגמה קוד G להדפסת ריבוע.</li>
	<li>טען את הקובץ המתוכנת בקוד G שתוכנן מראש. פתח את עורך קוד ה-G בתוכנה, והתוכנית בפקודות להדפסת הצורה הרצויה. בכל שורת פקודה, ניתן לשנות את מיקומו של ראש ההדפסה בציר X, Y ו/Z. הקלט את ערך Z במהלך כל שלבי ההדפסה כ-Z1 + Z2 (גובה משטח ההדפסה + מרחק עבודה). הערה: מהירות ההזזה מתכווננת גם היא; 9,000 mm/min הוא ערך מתאים לשיעורי הדפסה טיפוסיים.</li>
	<li>טען את הדיו הביולוגי הנוזלי למזרק (ים), והבהר אותם במשאבת המזרק (ים) של הביורימטר התלת-ממדי.</li>
	<li>הדפס את הדיו הביולוגי על מצע ההדפסה על -ידי לחיצה על לחצן ההדפסה.</li>
	<li>במהלך ההדפסה, שלוט בתנועת ההדפסה במלואה על-ידי התוכנה. הפעל ידנית את משאבת המזרק לפני שראש ההדפסה יגיע למגע עם משטח הדפסה. הערה: הקואורדינציה של משאבת המזרק והמדפסת נקבעת באופן אמפירי בהתאם למהירות ההבלטה, המהירות שבה ראש ההדפסה עובר לנקודת ההדפסה הראשונה, ולמיקום ההתחלתי של ההדפסה. אם מיקום ההדפסה הראשונית הוא 20 מ"מ, עם מהירות ההדפסה של 9,000 מ"מ/min ומהירות ההבלטה של 0.1 mL/h, להתחיל את משאבת המזרק מיד לאחר התחלת ההדפסה. אם מהירות ההבלטה משתנה מ-0.1 mL/h ל-0.3 mL/h, לאחר מכן המתן 2-3 להפעלת משאבת המזרק לאחר התחלת ההדפסה.</li>
	<li>עצור את משאבת המזרק ברגע שראש ההדפסה יגיע בנקודה האחרונה של הדפסה. לעצור את משאבת המזרק לפני שראש ההדפסה מרים בסוף תהליך ההדפסה, אחרת עודף ביולוגי יהיה לרדת על מצע ההדפסה ולהקטין את רזולוציית ההדפסה.</li>
	<li>לבניית מבנים תלת ממדיים, לשלוט בכל התנועות של ראש ההדפסה בעורך קוד G. הקלד את גובה ההדפסה של השכבה הראשונה. הגדילו את ערך Z ב-G-code על-ידי 0.2 מילימטרים עבור השכבה השניה כדי להגדיל את גובה ההדפסה. לאחר מכן, הגדילו את ערך Z ב-0.1 מילימטרים כאשר עוברים לשכבה גבוהה יותר. אל תזיז את הצלחת במהלך תהליך ההדפסה.</li>
	<li>כדי למדוד את הרוחב והגובה של ההידרוג'ל המודפס, השתמש בסרגל פלדה הממוקם מתחת או לצד המדגם.</li>
</ol>5. הגדלת ובדיקת האפקטיביות של ייצור ביוilm על ידי E. coli
<ol><li>מודב את הדגימות המודפסות בטמפרטורת החדר במשך 3-6 ימים כדי לאפשר ייצור של רכיבי ביוilm (סיבי קורלי). צלמו את הצלחות בעזרת מצלמה או סורק פלורסנט.</li>
	<li>כדי לפזר את מטריצת קילוף פלסטיצידיות, להוסיף 20 מ ל של 0.5 M נתרן ציטראט הפתרון (pH = 7 מותאם עם naoh) הדפסה מצעים, ו דגירה עבור 2 h עם 30 סל ד רועד בטמפרטורת החדר. להשליך את הנוזל ואת התמונה לוחיות שוב כדי להשוות עם תמונות של לוחיות לפני טיפול ציטראט.</li>
</ol>

<ol><li>Tibbitt, M. W., Rodell, C. B., Burdick, J. A., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+material+design+for+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Progress in material design for biomedical applications.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (47), 14444-14451 (2015).</li>
<li>Schmieden, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Printing+of+Patterned%2C+Engineered+E.+coli+Biofilms+with+a+Low-Cost+3D+Printer%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Printing of Patterned, Engineered E. coli Biofilms with a Low-Cost 3D Printer.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (5), 1328-1337 (2018).</li>
<li>Mao, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+nacre+by+predesigned+matrix-directed+mineralization%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Synthetic nacre by predesigned matrix-directed mineralization.</a> Science. 354 (6308), 107-110 (2016).</li>
<li>Gao, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+production+of+bulk+artificial+nacre+with+excellent+mechanical+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Mass production of bulk artificial nacre with excellent mechanical properties.</a> Nature Communications. 8 (1), 287(2017).</li>
<li>Poirier, Y., Nawrath, C., Somerville, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+Polyhydroxyalkanoates%2C+a+Family+of+Biodegradable+Plastics+and+Elastomers%2C+in+Bacteria+and+Plants%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Production of Polyhydroxyalkanoates, a Family of Biodegradable Plastics and Elastomers, in Bacteria and Plants.</a> Nature Biotechnology. 13, 142-150 (1995).</li>
<li>Choi, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+fermentative+production+of+poly%28lactate-co-glycolate%29+from+carbohydrates+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">One-step fermentative production of poly(lactate-co-glycolate) from carbohydrates in Escherichia coli.</a> Nature Biotechnology. 34 (4), 435-440 (2016).</li>
<li>Mohammadi, P., Toivonen, M. S., Ikkala, O., Wagermaier, W., Linder, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aligning+cellulose+nanofibril+dispersions+for+tougher+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Aligning cellulose nanofibril dispersions for tougher fibers.</a> Scientific Reports. 7 (1), 11860(2017).</li>
<li>Jonkers, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteria-based+self-healing+concrete%5BTitle%5D)+AND+%22Heron%22%5BJournal%5D)">Bacteria-based self-healing concrete.</a> Heron. 56 (1/2), (2011).</li>
<li>Schmieden, D. T., Meyer, A. S., Aubin-Tam, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+bacteria+to+make+improved%2C+nacre-inspired+materials%5BTitle%5D)+AND+%22MRS+Advances%22%5BJournal%5D)">Using bacteria to make improved, nacre-inspired materials.</a> MRS Advances. 1 (8), 559-564 (2016).</li>
<li>Zhong, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strong+underwater+adhesives+made+by+self-assembling+multi-protein+nanofibres%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Strong underwater adhesives made by self-assembling multi-protein nanofibres.</a> Nature Nanotechnology. 9 (10), 858-866 (2014).</li>
<li>Chen, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+patterning+of+tunable+multiscale+materials+with+engineered+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Synthesis and patterning of tunable multiscale materials with engineered cells.</a> Nature Materials. 13 (5), 515-523 (2014).</li>
<li>Gatenholm, P., Klemm, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+Nanocellulose+as+a+Renewable+Material+for+Biomedical+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22MRS+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Bacterial Nanocellulose as a Renewable Material for Biomedical Applications.</a> MRS Bulletin. 35, 208-213 (2010).</li>
<li>Rodriguez-Carmona, E., Villaverde, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanostructured+bacterial+materials+for+innovative+medicines%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Nanostructured bacterial materials for innovative medicines.</a> Trends in Microbiology. 18 (9), 423-430 (2010).</li>
<li>Hung, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escherichia+coli+biofilms+have+an+organized+and+complex+extracellular+matrix+structure%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">Escherichia coli biofilms have an organized and complex extracellular matrix structure.</a> MBio. 4 (5), (2013).</li>
<li>Donlan, R. M., Costerton, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilms%3A+Survival+Mechanisms+of+Clinically+Relevant+Microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Biofilms: Survival Mechanisms of Clinically Relevant Microorganisms.</a> Clinical Microbiology Reviews. 15 (2), 167-193 (2002).</li>
<li>Wu, H., Moser, C., Wang, H. Z., Hoiby, N., Song, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+combating+bacterial+biofilm+infections%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Oral+Science%22%5BJournal%5D)">Strategies for combating bacterial biofilm infections.</a> International Journal of Oral Science. 7 (1), 1-7 (2015).</li>
<li>Stewart, P. S., Franklin, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+heterogeneity+in+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Physiological heterogeneity in biofilms.</a> Nature Reviews Microbiology. 6 (3), 199-210 (2008).</li>
<li>Kikuchi, T., Mizunoe, Y., Takade, A., Naito, S., Yoshida, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Curli+Fibers+Are+Required+for+Development+of+Biofilm+Architecture+in+Escherichia+coli+K-12+and+Enhance+Bacterial+Adherence+to+Human+Uroepithelial+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+Immunology%22%5BJournal%5D)">Curli Fibers Are Required for Development of Biofilm Architecture in Escherichia coli K-12 and Enhance Bacterial Adherence to Human Uroepithelial Cells.</a> Microbiology and Immunology. 49 (9), 875-884 (2005).</li>
<li>Cranford, S., Buehler, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Materiomics%3A+biological+protein+materials%2C+from+nano+to+macro%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%2C+Science+and+Applications%22%5BJournal%5D)">Materiomics: biological protein materials, from nano to macro.</a> Nanotechnology, Science and Applications. 3, 127-148 (2010).</li>
<li>Lehner, B. A. E., Schmieden, D. T., Meyer, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Straightforward+Approach+for+3D+Bacterial+Printing%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">A Straightforward Approach for 3D Bacterial Printing.</a> ACS Synthetic Biology. 6 (7), 1124-1130 (2017).</li>
<li>Wang, X., Smith, D. R., Jones, J. W., Chapman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+polymerization+of+a+functional+Escherichia+coli+amyloid+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">In vitro polymerization of a functional Escherichia coli amyloid protein.</a> Journal of Biological Chemistry. 282 (6), 3713-3719 (2007).</li>
<li>Hammar, M., Bian, Z., Normark, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleator-dependent+intercellular+assembly+of+adhesive+curli+organelles+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Nucleator-dependent intercellular assembly of adhesive curli organelles in Escherichia coli.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (13), 6562-6566 (1996).</li>
<li>Huang, Y. J., Xia, A. G., Yang, G., Jin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioprinting+Living+Biofilms+through+Optogenetic+Manipulation%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Bioprinting Living Biofilms through Optogenetic Manipulation.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (5), 1195-1200 (2018).</li>
<li>Jin, X. F., Riedel-Kruse, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+Lithography+enables+high-resolution+cell+patterning+via+optogenetic+adhesin+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Biofilm Lithography enables high-resolution cell patterning via optogenetic adhesin expression.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (14), 3698-3703 (2018).</li>
<li>Stewart, P. S., Franklin, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+heterogeneity+in+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Physiological heterogeneity in biofilms.</a> Nature Reviews Microbiology. 6 (3), 199-210 (2008).</li>
<li>Percival, S. L., Suleman, L., Vuotto, C., Donelli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Healthcare-associated+infections%2C+medical+devices+and+biofilms%3A+risk%2C+tolerance+and+control%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Healthcare-associated infections, medical devices and biofilms: risk, tolerance and control.</a> Journal of Medical Microbiology. 64, 323-334 (2015).</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

הפרוטוקול המוצג כאן עבור הדפסה תלת-ממדית של ביואיאמים מהונדסים מכיל שני שלבים קריטיים. ראשית הוא הכנת משטח ההדפסה אגר, שהוא הגורם הקריטי ביותר להפקת רזולוציית הדפסה ספציפית. חשוב לוודא שמשטח ההדפסה שטוח ושתיאור הפיפטה בראש ההדפסה ממוקם בגובה הנכון מהמשטח. אם המשטח אינו שטוח, מרחק העבודה ישתנה במהלך תהליך ההדפסה. אם מרחק העבודה הוא פחות מ 0.1 מ"מ, הפתרון CaCl2 יכול להיכנס בתוך הקצה של הפיפטה ולגרום להיווצרות הידרוג'ל, הגורמת לתיאור הפיפטה להיות סתום. אם מרחק העבודה הוא יותר מ 0.3 מ"מ, לא ניתן להדפיס את ה-gel בר...

כיום קיים צורך הולך וגובר לפיתוח פתרונות ידידותיים לסביבה, לייצור חומרים בדוגמת spatially, בשל הרחבת מספר השווקים לחומרים מסוג1. מאמר זה מציג באופן פשוט, שיטה חסכונית לייצור חומרים כאלה ולכן מציע ספקטרום גדול של יישומים עתידיים. השיטה המוצגת כאן מאפשרת תלת מימדי (3D) הדפסה של מבנים בדוגמת spatially באמצעות הביו-דיו המכיל חיידקים חיים. החיידק נשאר בר קיימא בתוך המבנים המודפסים במשך שבוע, ומאפשר לחיידק לבצע פעילויות מטבוליות טבעיות או מהונדסים. חיידקים מודפסים יכולים ובכך לייצר ולהפקיד את הרכיבים הרצויים בתוך המבנה המודפס, לדוגמה יצירת ביוilm מקושרות פונקציונלי2.
שיטות מסורתיות לייצור חומרים מתקדמים כוללות הוצאות אנרגיה גבוהה (למשל, טמפרטורות גבוהות ו/או לחצים) והוא יכול לייצר כמויות גדולות של פסולת כימית, לעתים קרובות חומרים רעילים הדורשים הוצאות מקיפות3 ,4. לעומת זאת, מינים חיידקיים רבים מסוגלים לייצר חומרים שניתן ליישום בקלות בתעשיות שונות. חומרים אלה כוללים פולימרים כגון פוליהידרוקסילאנוטים (PHA)5 או פולי (גליקולדה-co-lactide)6, בקטריות תאית7, חומרי בטון חיידקיים8, מרוכבים ביוציתים9, דבקים מבוססי עמילואיד10, או מתגי חשמל ביו מבוססי11, בין היתר. יתר על כן, ייצור חיידקי של חומרים יקרי ערך מתרחש בדרך כלל בטמפרטורות הסביבה הקרובה ולחצים ובסביבות מימית, ללא צורך או לייצר תרכובות רעילות. בזמן הפקת חומרים עם חיידקים כבר הפגינו בספרות וכמה יישומים תעשייתיים כבר התפתחה12,13, שיטה אמינה עבור הקפדה מרחבית של חומרים כאלה נשאר אתגר.
מאמר זה מדגים שיטה הישר קדימה להמרת מדפסת תלת-ממד מסחרית בעלות נמוכה למדפסת בקטריאלי תלת-ממדית. הפרוטוקול מראה כיצד להכין את הביו-דיו המכיל ולקיים את החיידק החי, כמו גם כיצד להכין מצעים שעליהם ניתן לבצע את ההדפסה התלת-ממדית. שיטה זו מתאימה לשימוש עם מגוון זנים חיידקיים טבעיים ומהונדסים מסוגל לייצר חומרים. חיידקים אלה יכולים להיות מופץ מרחב בתוך מבנה מודפס 3d ועדיין להמשיך את פעילות חילוף החומרים שלהם, אשר תגרום התפלגות מרחבית של החומרים הרצוי המיוצר על ידי החיידק.
שיטת הדפסה זו מאפשרת ליצור מוספים של ביואמים, אגרגטים של חיידקים המוקפים במטריצה בעלת הפקה עצמית. ביואמים הם רשתות תלת-ממד הטרוגנית שבהן חלבונים, פולימרים, תאי בקטריאלי, חמצן וחומרים מזינים כולם מובנים ביותר14. בעוד בצורת ביוilm, החיידק מפגין עמידות לאנטיביוטיקה מוגברת וחוסן מבניים, מה שמקשה למגר ממשטחים כולל קטטרים ושתלים רפואיים. המפתח למאפייני ביוilm, וגם האתגר הגדול ביותר לחקר ביוilm, נראה כטרוגניות של ביוילאמים15,16,17. ייצור ביואילאמים של מודל מבוקר בשליטה מיוחדת הוא עניין מיוחד כפי שאפשר להתרבות או לכוונן את הדפוסים המרחביים של רכיבי הבייוilm, ולסייע להבנת התצהיר היציב של הביואמים כמעט בכל משטח ב טבע.
מאמר זה מציג שיטה לייצור ביויואמים באמצעות הידרו-מודפסים תלת-ממדיים המכילים חיידקים מהונדסים של E. coli המייצרים חלבונים של ביוilm בנוכחות סליל, כמו גם שיטות אימות של היווצרות ביוilm2 . מרכיבי מטריקס העיקריים של מטריצות של ביואמים אלה הם סיבי עמילואיד בסיבים18 המכילים חלבונים csga עצמית התאספו. כאשר מתוכננים חיידקים E. coli המושרה כדי לבטא חלבונים csga, הם יוצרים מודל יציב ביוilm המגן על התאים מפני שטף של משטח ההדפסה. כגון מודפס 3D המבנה יכול להיות נשלט על ידי שליטה והוא יכול לשמש כלי מחקר שימושי לחקירת מכניקה מבנה בקנה מידה רב של מבנים התפקוד או החומריות19. ביואמים אלה יסייעו להבנת עקרונות היווצרות הביוונים ותכונותיו המכאניות, המאפשרות מחקר נוסף למנגנונים של עמידות לאנטיביוטיקה בין יישומים אחרים.

<table><tbody><tr><td>מדפסת תלת מימד</td><td>CoLiDo</td><td>3D-P Kit</td><td></td></tr><tr><td>תוכנת הדפסת תלת מימד</td><td>CoLiDo</td><td>Print-Rite ColiDo Repetier-Host v2.0.1</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>05040</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 dihydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה</td><td>Eppendorf</td><td>5810 R</td><td></td></tr><tr><td>Chloramphenicol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3886.1</td><td></td></tr><tr><td>LB אבקת מרק</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3022</td><td></td></tr><tr><td>שייקר אורביטלי</td><td>VWR</td><td>89032-092</td><td>דגם 3500</td></tr><tr><td>צלחת פטרי</td><td>VWR</td><td>25384-326</td><td>150 x 15 מ"מ</td></tr><tr><td>Rhamnose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83650</td><td></td></tr><tr><td>צינורות סיליקון</td><td>VWR&nbsp;</td>משאבת מזרק <td>DENE 3100103/25</td><td></td></tr><tr><td></td><td>ProSense B.V.&nbsp;</td><td>NE-300</td><td></td></tr><tr><td>נתרן אלגינט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>W201502</td><td></td></tr><tr><td>נתרן ציטראט מונו-בסיסי</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>71498</td><td></td></tr><tr><td>נתרן הידרוקסיד</td><td>VWR</td><td>28244.295</td><td></td></tr></tbody></table>

המשך תלת-מימדי של ביוריאמים מהונדסים עם מעשה-זה-בעצמך ביורינטר

Three-dimensional Patterning of Engineered Biofilms with a Do-it-yourself Bioprinter

ביוילאמים הם אגרגטים של חיידקים מוטבע בתוך מטריצה המיוצר בתבנית spatially-בדוגמת. חיידקים בתוך ביוilm לפתח עמידות לאנטיביוטיקה משופרת, אשר מהווה סכנות בריאותיות פוטנציאליות, אבל יכול גם להועיל ליישומים סביבתיים כגון טיהור של מי שתייה. ההתפתחות הנוספת של הtherapeutics אנטי בקטריאלי ויישומים השראה ביוilm ידרוש התפתחות של שיטות הנדסה, מהנדסים ליצירת ביוגרפיות. לאחרונה, התפתחה שיטה מקורית של הכנת ביוilm באמצעות מדפסת תלת-ממדית ששונתה (3D) עם דיו חיידקי. מאמר זה מתאר את השלבים הנחוצים לבניית הביוקטר היעיל והחסכוני הזה המציע מספר יישומים בעיבוד חומרים המושרה על ידי bacterially. הפרוטוקול מתחיל עם מדפסת תלת-ממד מותאם מותאמת מסחרית שבה החליף את הבלטת ממד עם מתקן ביו דיו המחובר למערכת משאבת מזרק המאפשרת זרימה מתמשכת ורציפה של ביו-דיו. לפיתוח ביו-דיו המתאים להדפסת ביוilm, בקטריה מהונדסים של חיידק האנציכיה הושעו בתמיסה של alginate, כך שהם לגבש במגע עם משטח המכיל סידן. הכללת כימיה מודפסת בתוך מצע ההדפסה כוננים ביטוי של חלבונים ביוilm בתוך הביו-דיו המודפס. שיטה זו מאפשרת הדפסה תלת ממדית של תבניות מרחבית שונות המורכבות משכבות בדידים של ביואמים מודפסים. כגון מערכות מבוקרת מסוג זה יכול לשמש כמערכות מודל והוא יכול למצוא יישומים בתחומים מרובים שיש להם השפעה רחבה על החברה, כולל מניעת עמידות לאנטיביוטיקה או שתיית מים לטיהור, בין היתר.

הצעד הראשון להדפסה תלת-ממדית מוצלחת של ביויואמים הוא המרת מדפסת תלת-ממדית מסחרית לתוך ביוריקטר. המרה זו מושגת על ידי הסרת מכבש הדפוס והחימום של המדפסת, המיועדים להדפסה עם דיו פולימרי, והחלפת אלה עם רכיבים המתאימים להדפסת ביו-דיו המכיל חיידקים חיים (איור 1A). הבלטת ממד מוחלפת בעצת פיפטה (או בטיפים, אם נעשה שימוש בסוגי דיו מרובים בתהליך ההדפסה) המחובר למערכת אבובים המחוברת למשאבת מזרק (איור 1B). ההמרה מוצלחת של המדפיס המסחרי לתוך ב...

מאמר זה מתאר שיטה להפיכת מדפסת תלת-ממד מסחרית בעלות נמוכה למדפסת תלת-ממדית חיידקית, היכולה להקל על הדפסה של מאפייני בדוגמת מילוי. כל ההיבטים הנחוצים של הכנת הביופלקטר והביו-דיו מתוארים, כמו גם שיטות אימות להערכת היווצרות ביואילאמים.

Biofilms are aggregates of bacteria embedded in a self-produced spatially-patterned extracellular matrix. Bacteria within a biofilm develop enhanced ...

הדפסה ביולוגית תלת מימדית עם חיידקים היא טכניקה שפותחה לאחרונה. פרוטוקול זה מספק דרך קלה לבניית ביופילמים מהונדסים בתלת-ממד המודפסים באמצעות חיידקים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא היכולת לייצר ביופילמים מודפסים בתלת-ממד באמצעות מדפסת תלת-ממד ביתית זולה.יישום אפשרי אחד של מדפסת 3D שלנו הוא ליצור biofilms מודל לשחזור שניתן להשתמש בהם כדי לפתח טיפולים אנטיבקטריאליים חדשים. ניתן ליישם את גישת ההדפסה בתלת-ממד שלנו על כל סוג של חיידקים התואמים לביו-ינק מבוסס האלגינט שלנו. הכנת הביו-ינק ומצעי ההדפסה הם הליכים סטנדרטיים למדי, בעוד שתהליך ההדפסה בתלת-ממד, במיוחד הכיול של ציר Z, הוא צעד חיוני הדורש תרגול מסוים.כיול גובה הגישה שנקבע ישפיע על הרזולוציה של מדפסת תלת-ממד שלנו, ותלוי מאוד בחוויה האישית. הליך זה דורש התאמות ידניות, וקשה לתארו בתבנית כתובה. חבר קצה פיפיאט של 200 מיקרוליטר לאורך של צינורות סיליקון, והתקע את קצה הפיפסט על ראש האלט של המדפסת תלת-ממד כתחליף לאלט המקורי.לאחר מכן, הוסיפו ארבעה מיליליטר של תמיסת סידן כלוריד טוחנת ל-400 מיליליטר של 1%agar מומסים במרק לוריא-ברטאני, והשלמו אותו עם האנטיביוטיקה והמשרצים המתאימים. לאחר מכן, לוותר על 20 מיליליטר של פתרון אגר LB לתוך כל 150 מילימטר על ידי 15 מילימטר צלחת פטרי. יבש את המנה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, עם המכסה חצי פתוח.הכינו תסכול אלגינט של 3%, וחמו אותו עד לנקודת הרתיחה שלוש פעמים כדי לעקר את הפתרון. לאחר מכן, לאחסן את הפתרון סטרילי בארבע מעלות צלזיוס עד שהוא משמש. כדי להכין את המרכיב החיידקי של הביוינק, לגדל חיידקי E.coli הנושאים פלסמידים לביטוי GFP מכובע ב 50 מיליליטר של מדיום LB המכיל אנטיביוטיקה.לנער את התרבות ב 250 סל"ד ו 37 מעלות צלזיוס לילה. לאחר צמיחה לילה של התרבות, גלולה את החיידקים במשך חמש דקות ב 3, 220 פעמים כוח הכבידה ולאחר מכן להסיר את העל טבעי. תוסיפו את גלולת החיידקים ב-10 מיליליטר של מדיום LB, ותוסיפו 10 מיליליטר של 3%נתרן אלגינט.חבר את המדפסת בתלת-ממד למחשב ופתח את תוכנת ההדפסה בתלת-ממד. לחץ על לחצן בית עבור הצירים X, Y ו- Z, כדי להזיז את ראש ההדפסה למיקום הבית שלו. עבור כל הדפסה, מקם מצע הדפסה מוכן על מיקום מסוים על מיטת ההדפסה.הרם את ראש ההדפסה לגובה של מעל 22 מילימטרים תחת שליטה ידנית, כך שהוא לא יתנגש בקצה צלחת פטרי במהלך התנועה. מקם את ראש ההדפסה מעל החלק העליון של הלוח והזז אותו כלפי מטה עד שטיפ הפיפסה יוצר קשר עם משטח ההדפסה. הקצה מיקום ציר Z זה כ- Z1, גובה משטח ההדפסה.לאחר מכן, הרימו את ראש ההדפסה והזיזו אותו ידנית מחוץ לאזור הלוח. אם מרחק העבודה בין ראש ההדפסה למשטח הלוח מוגדר כ- Z2, הזן את גובה משטח ההדפסה בתוספת מרחק העבודה לתוכנית ההדפסה כערך Z במהלך ההדפסה. טען קובץ G-code מתוכנת מראש המכיל פקודות להדפסת הצורה הרצויה.בכל שורת פקודה, ניתן לשנות את מיקום ראש ההדפסה בצירים X, Y ו- Z. הקפד להזין את ערך Z במהלך כל שלבי ההדפסה כגובה משטח ההדפסה בתוספת מרחק העבודה. לטעון את הביונק הנוזלי למזרקים ולהוות אותם במשאבת המזרק של bioprinter 3D.לאחר מכן, הגדר את מהירות ההבלטה ל-0.3 מיליליטר לשעה. הדפס את הביו-ינק על מצע ההדפסה על-ידי לחיצה על לחצן הדפס. המתן להתחלת משאבת המזרק עד לאחר תחילת ההדפסה ולפני שראש ההדפסה בא במגע עם משטח ההדפסה.במהלך ההדפסה, שלוט בתנועת ראש ההדפסה לחלוטין על-ידי התוכנה. עצרו את משאבת המזרק ברגע שראש ההדפסה יגיע לנקודת ההדפסה האחרונה, אחרת עודף הביונק ייפול על מצע ההדפסה ויפחית את רזולוציית ההדפסה. לבניית מבנים תלת-מימדיים, כל התנועות של ראש ההדפסה נשלטות בעורך G-code.להגדלת גובה ההדפסה של השכבה השניה, הקלדת גובה ההדפסה של השכבה הראשונה והגדלת ערך Z בקוד ב- 0.2 מילימטרים. לאחר מכן, הגדל את ערך Z ב- 0.1 מילימטר, בעת מעבר לשכבה גבוהה יותר. הדגירה את הדגימות המודפסות בטמפרטורת החדר במשך שלושה עד שישה ימים כדי לאפשר את הייצור של רכיבי biofilm כגון סיבי Curli.לאחר מכן, מניחים את הצלחת על סורק פלואורסצנטי ומדמים את הלוחות. כדי להמיס את מטריצת האלגינט, הוסיפו 20 מיליליטר של תמיסת נתרן ציטראט 0.5 טוחנת ב-pH 7, למצע המודפס. הדגירה את הצלחת בטמפרטורת החדר במשך שעתיים תוך כדי רעידות ב 30 סל"ד.לאחר מכן, להשליך את הנוזל ואת התמונה את הצלחות שוב, כדי להשוות עם התמונות של הצלחות לפני ואחרי הטיפול ציטראט. הביו-הדפס התלת מימדי יכול ליצור הידרוג'לים עוטפים חיידקים במגוון צורות דו-ממדיות ותלת מימדיות. צורות מודפסות אלה ניתן להשתמש כדי להעריך אם היווצרות של ביופילם היה מוצלח או אם מטריצת אלגינט מומס לחלוטין באמצעות פתרון נתרן ציטראט.במקרה של bioink ללא פלסמיד ייצור Curli בלתי ניתן לאכילה, הדפוס המודפס הומס לחלוטין לאחר הטיפול נתרן ציטראט, הממחין כי לא נוצרה רשת תלתל biofilm. החיידקים המכילים את פלסמיד ייצור Curli בלתי ניתן לאכילה לא הומס לאחר טיפול נתרן ציטראט, המציין כי החיידקים המודפסים הצליחו ליצור רשת Curli נרחב מספיק כדי לייצב את הדפוס המודפס של חיידקים. לבניית מבנים מרובי שכבות, ניתן להדפיס שכבות נוספות על-ידי שליטה בעורך G-code.הגדלת מספר השכבות המודפסות בדגימה גרמה לרוחב וגובה המבנים המודפסים לגדול בהדרגה. כאשר E.coli תוכנן לייצר באופן בלתי הפיך חלבונים Curli הודפסו לתוך מבנים רב שכבתיים, טיפול ציטראט נתרן לא להמיס את הדגימות, ואילו מבנים רב שכבתיים המכילים שאינם Curli לייצר E.coli היו מומסים. החלקים הקריטיים ביותר של הליך ההדפסה בתלת-ממד הם הכיול של ציר Z, והתיאום של הפעלת ההדפסה והפעלת משאבת המזרק.הביוינק שפותח עבור תהליך זה הוא רך למדי, עם קשיחות נמוכה. שינוי נוסף יכול להתבצע bioink, על מנת לספק ולשפר את היציבות המכנית. טכניקת הדפסה תלת מימדית זו מאפשרת ייצור ביופילמים בעלי תכונות מכניות מצוינות, אשר עשויים לאפשר ייצור חומרים ביומימטיים.בעת טיפול בחיידקים אלה, ללבוש הגנה נאותה, כגון כפפות.

three-dimensional-patterning-engineered-biofilms-with-do-it-yourself

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

תיאור של שיטות להמיר HP DeskJet 500 המדפסת לתוך bioprinter. המדפסת מסוגלת עיבוד תאים חיים, מה שגורם הנקבוביות חולפים על הממברנה. נקבוביות אלה יכול להיות מנוצל לשלב מולקולות קטנות, כולל ניאון G-אקטין, לתוך תאים מודפסים.

יצירת חולף קרום התא הנקבוביות באמצעות מדפסת הזרקת דיו רגילה

Bioprinter שימש ליצירה הידרוג דוגמת המבוסס על תבנית עולה. עובש poloxamer היה backfilled עם הידרוג'ל שני ולאחר מכן eluted, ומשאיר חללים שהיו מלאים בידרוג'ל שלישי. שיטה זו משתמשת elution המהיר וטוב של printability poloxamer לייצר ארכיטקטורות מורכבות מbiopolymers.

הדפסת תבניות היפוך Thermoresponsive ליצירת בדוגמת הידרוג דו רכיבים-תרבות תאי 3D

מדפסת ביולוגית קרטזית תוכננה ויוצרה כדי לאפשר שקיעה מרובת חומרים בגיאומטריות מדויקות הניתנות לשחזור, תוך מתן אפשרות לשליטה בגורמים סביבתיים. באמצעות המדפסת הביולוגית התלת מימדית, ניתן להדפיס מבנים מורכבים ובני קיימא ולשכפל אותם בקלות.

כדאיות של מבנים ניידים Bioprinted באמצעות מדפסת הקרטזיאני Dispenser שלוש

פרוטוקול זה מתאר מתודולוגיית הדפסה ביולוגית באמצעות מערכת הפקדה רובוטית אוטומטית המשלבת רמזי הנחיה טופוגרפיים חרוטים עם תצהיר מדויק של תא הנושא דיו הידרוג'ל. התאים המודפסים מועברים ישירות לתכונות החרוטות ומסוגלים לחוש ולהתמצא איתם.

טכניקת Dispensing רובוטיות אוטומטית להכוון משטחים Bioprinting של תאים

אנו מספקים פרוטוקול מוכללת המבוסס על אסטרטגיה bioprinting microfluidic הנדסה מיטה microfibrous בכלי הדם, שבו סוג התא משני יכול להיות עוד יותר נזרע לתוך מרחב ביניים של מבנה זה microfibrous ליצירת רקמות vascularized ו- organoids.

Vascularized Microfluidic Bioprinting עבור הנדסת רקמות, Organoids

בכתב יד זה, אנו מדגימים את ההכנה של ביודיו הידרוג'ל ביו-היברידי המכיל גרפן לשימוש בהנדסת רקמות היקפיות. באמצעות חומר ביו-היברידי תלת-ממדי זה, מבוצע פרוטוקול ההתמיינות העצבית של תאי גזע. זה יכול להיות צעד חשוב בהבאת ביו-חומרים דומים למרפאה.

הכנה ואפיון של ביו-דיו הידרוג'ל ביו-היברידי תלת-ממדי מבוסס גרפן לנוירו-הנדסה היקפית

דשים מהונדסים דורשים רשת כלי דם פונקציונלית משולבת. בפרוטוקול זה, אנו מציגים שיטה לייצור דש רקמה מודפס בתלת-ממד המכיל רשת כלי דם היררכית ואת האנסטומוזות המיקרו-כירורגיות הישירות שלה לעורק עצם הירך של החולדה.

ייצור דשים וסקולריים מהונדסים באמצעות טכנולוגיות הדפסה בתלת-ממד

עיבוד גזירה במהלך היווצרות הידרוג'ל מביא לייצור מתלי מיקרוג'ל הדקים אך מתחדשים במהירות לאחר הסרת כוחות הגזירה. חומרים אלה שימשו כמטריצה תומכת להדפסה ביולוגית של מבנים מורכבים ועמוסי תאים. כאן מתוארות שיטות המשמשות לייצור המיטה התומכת והדיו הביולוגי התואם.

ג'ל נוזלי אגרוז שנוצר על ידי עיבוד גזירה במהלך הג'לציה להדפסה ביולוגית תלת ממדית מושהית

מאמר זה מתאר כיצד להדפיס ביו-ממד הידרוג'לים פוטו-ממדיים כדי לחקור התקשות מטריצה חוץ-תאית והפעלת פיברובלסטים.

הדפסה ביולוגית תלת-ממדית הידרוג'לים פוטו-ממדיים לחקר הפעלת פיברובלסטים

פרוטוקול זה מתאר הליך להדפסה תלת-ממדית (תלת-ממדית) של מושבות חיידקים כדי לחקור את תנועתיותן וצמיחתן במטריצות הידרוג'ל נקבוביות תלת-ממדיות מורכבות הדומות יותר לבתי הגידול הטבעיים שלהן מאשר תרביות נוזליות קונבנציונליות או צלחות פטרי.

הדפסת חיידקים בתלת-ממד לחקר תנועתיות וצמיחה במדיה נקבובית תלת-ממדית מורכבת

אנו מציגים פרוטוקול לייצור תפוקה גבוהה של תעלות כלי דם עם גדלים גמישים ודפוסים רצויים על לוח סטנדרטי של שש בארות באמצעות טכנולוגיית הדפסה ביולוגית תלת-ממדית, המכונה כלי על צלחת (VOP). לפלטפורמה זו יש פוטנציאל לקדם את הפיתוח של טיפולים להפרעות הקשורות לאנדותל בסיכון.

שיטת הדפסה ביולוגית בתפוקה גבוהה למידול חדירות כלי דם בלוחות סטנדרטיים בעלי שש בארות עם גודל וגמישות דפוס

למד הדפסה תלת-ממדית של ביוריאמים מהונדסים באמצעות מדפסת ביתית זולה ודיו ביולוגי מבוסס אלגינט. שיטה זו מאפשרת יצירת מודלים לפיתוח טיפולים אנטיבקטריאליים חדשים.

המשך תלת-מימדי של ביוריאמים מהונדסים עם מעשה-זה-בעצמך ביורינטר

גלה סרטונים נוספים