המשך תלת-מימדי של ביוריאמים מהונדסים עם מעשה-זה-בעצמך ביורינטר

הדפסה ביולוגית תלת מימדית עם חיידקים היא טכניקה שפותחה לאחרונה. פרוטוקול זה מספק דרך קלה לבניית ביופילמים מהונדסים בתלת-ממד המודפסים באמצעות חיידקים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא היכולת לייצר ביופילמים מודפסים בתלת-ממד באמצעות מדפסת תלת-ממד ביתית זולה.

יישום אפשרי אחד של מדפסת 3D שלנו הוא ליצור biofilms מודל לשחזור שניתן להשתמש בהם כדי לפתח טיפולים אנטיבקטריאליים חדשים. ניתן ליישם את גישת ההדפסה בתלת-ממד שלנו על כל סוג של חיידקים התואמים לביו-ינק מבוסס האלגינט שלנו. הכנת הביו-ינק ומצעי ההדפסה הם הליכים סטנדרטיים למדי, בעוד שתהליך ההדפסה בתלת-ממד, במיוחד הכיול של ציר Z, הוא צעד חיוני הדורש תרגול מסוים.

כיול גובה הגישה שנקבע ישפיע על הרזולוציה של מדפסת תלת-ממד שלנו, ותלוי מאוד בחוויה האישית. הליך זה דורש התאמות ידניות, וקשה לתארו בתבנית כתובה. חבר קצה פיפיאט של 200 מיקרוליטר לאורך של צינורות סיליקון, והתקע את קצה הפיפסט על ראש האלט של המדפסת תלת-ממד כתחליף לאלט המקורי.

לאחר מכן, הוסיפו ארבעה מיליליטר של תמיסת סידן כלוריד טוחנת ל-400 מיליליטר של 1%agar מומסים במרק לוריא-ברטאני, והשלמו אותו עם האנטיביוטיקה והמשרצים המתאימים. לאחר מכן, לוותר על 20 מיליליטר של פתרון אגר LB לתוך כל 150 מילימטר על ידי 15 מילימטר צלחת פטרי. יבש את המנה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, עם המכסה חצי פתוח.

הכינו תסכול אלגינט של 3%, וחמו אותו עד לנקודת הרתיחה שלוש פעמים כדי לעקר את הפתרון. לאחר מכן, לאחסן את הפתרון סטרילי בארבע מעלות צלזיוס עד שהוא משמש. כדי להכין את המרכיב החיידקי של הביוינק, לגדל חיידקי E.coli הנושאים פלסמידים לביטוי GFP מכובע ב 50 מיליליטר של מדיום LB המכיל אנטיביוטיקה.

לנער את התרבות ב 250 סל"ד ו 37 מעלות צלזיוס לילה. לאחר צמיחה לילה של התרבות, גלולה את החיידקים במשך חמש דקות ב 3, 220 פעמים כוח הכבידה ולאחר מכן להסיר את העל טבעי. תוסיפו את גלולת החיידקים ב-10 מיליליטר של מדיום LB, ותוסיפו 10 מיליליטר של 3%נתרן אלגינט.

חבר את המדפסת בתלת-ממד למחשב ופתח את תוכנת ההדפסה בתלת-ממד. לחץ על לחצן בית עבור הצירים X, Y ו- Z, כדי להזיז את ראש ההדפסה למיקום הבית שלו. עבור כל הדפסה, מקם מצע הדפסה מוכן על מיקום מסוים על מיטת ההדפסה.

הרם את ראש ההדפסה לגובה של מעל 22 מילימטרים תחת שליטה ידנית, כך שהוא לא יתנגש בקצה צלחת פטרי במהלך התנועה. מקם את ראש ההדפסה מעל החלק העליון של הלוח והזז אותו כלפי מטה עד שטיפ הפיפסה יוצר קשר עם משטח ההדפסה. הקצה מיקום ציר Z זה כ- Z1, גובה משטח ההדפסה.

לאחר מכן, הרימו את ראש ההדפסה והזיזו אותו ידנית מחוץ לאזור הלוח. אם מרחק העבודה בין ראש ההדפסה למשטח הלוח מוגדר כ- Z2, הזן את גובה משטח ההדפסה בתוספת מרחק העבודה לתוכנית ההדפסה כערך Z במהלך ההדפסה. טען קובץ G-code מתוכנת מראש המכיל פקודות להדפסת הצורה הרצויה.

בכל שורת פקודה, ניתן לשנות את מיקום ראש ההדפסה בצירים X, Y ו- Z. הקפד להזין את ערך Z במהלך כל שלבי ההדפסה כגובה משטח ההדפסה בתוספת מרחק העבודה. לטעון את הביונק הנוזלי למזרקים ולהוות אותם במשאבת המזרק של bioprinter 3D.

לאחר מכן, הגדר את מהירות ההבלטה ל-0.3 מיליליטר לשעה. הדפס את הביו-ינק על מצע ההדפסה על-ידי לחיצה על לחצן הדפס. המתן להתחלת משאבת המזרק עד לאחר תחילת ההדפסה ולפני שראש ההדפסה בא במגע עם משטח ההדפסה.

במהלך ההדפסה, שלוט בתנועת ראש ההדפסה לחלוטין על-ידי התוכנה. עצרו את משאבת המזרק ברגע שראש ההדפסה יגיע לנקודת ההדפסה האחרונה, אחרת עודף הביונק ייפול על מצע ההדפסה ויפחית את רזולוציית ההדפסה. לבניית מבנים תלת-מימדיים, כל התנועות של ראש ההדפסה נשלטות בעורך G-code.

להגדלת גובה ההדפסה של השכבה השניה, הקלדת גובה ההדפסה של השכבה הראשונה והגדלת ערך Z בקוד ב- 0.2 מילימטרים. לאחר מכן, הגדל את ערך Z ב- 0.1 מילימטר, בעת מעבר לשכבה גבוהה יותר. הדגירה את הדגימות המודפסות בטמפרטורת החדר במשך שלושה עד שישה ימים כדי לאפשר את הייצור של רכיבי biofilm כגון סיבי Curli.

לאחר מכן, מניחים את הצלחת על סורק פלואורסצנטי ומדמים את הלוחות. כדי להמיס את מטריצת האלגינט, הוסיפו 20 מיליליטר של תמיסת נתרן ציטראט 0.5 טוחנת ב-pH 7, למצע המודפס. הדגירה את הצלחת בטמפרטורת החדר במשך שעתיים תוך כדי רעידות ב 30 סל"ד.

לאחר מכן, להשליך את הנוזל ואת התמונה את הצלחות שוב, כדי להשוות עם התמונות של הצלחות לפני ואחרי הטיפול ציטראט. הביו-הדפס התלת מימדי יכול ליצור הידרוג'לים עוטפים חיידקים במגוון צורות דו-ממדיות ותלת מימדיות. צורות מודפסות אלה ניתן להשתמש כדי להעריך אם היווצרות של ביופילם היה מוצלח או אם מטריצת אלגינט מומס לחלוטין באמצעות פתרון נתרן ציטראט.

במקרה של bioink ללא פלסמיד ייצור Curli בלתי ניתן לאכילה, הדפוס המודפס הומס לחלוטין לאחר הטיפול נתרן ציטראט, הממחין כי לא נוצרה רשת תלתל biofilm. החיידקים המכילים את פלסמיד ייצור Curli בלתי ניתן לאכילה לא הומס לאחר טיפול נתרן ציטראט, המציין כי החיידקים המודפסים הצליחו ליצור רשת Curli נרחב מספיק כדי לייצב את הדפוס המודפס של חיידקים. לבניית מבנים מרובי שכבות, ניתן להדפיס שכבות נוספות על-ידי שליטה בעורך G-code.

הגדלת מספר השכבות המודפסות בדגימה גרמה לרוחב וגובה המבנים המודפסים לגדול בהדרגה. כאשר E.coli תוכנן לייצר באופן בלתי הפיך חלבונים Curli הודפסו לתוך מבנים רב שכבתיים, טיפול ציטראט נתרן לא להמיס את הדגימות, ואילו מבנים רב שכבתיים המכילים שאינם Curli לייצר E.coli היו מומסים. החלקים הקריטיים ביותר של הליך ההדפסה בתלת-ממד הם הכיול של ציר Z, והתיאום של הפעלת ההדפסה והפעלת משאבת המזרק.

הביוינק שפותח עבור תהליך זה הוא רך למדי, עם קשיחות נמוכה. שינוי נוסף יכול להתבצע bioink, על מנת לספק ולשפר את היציבות המכנית. טכניקת הדפסה תלת מימדית זו מאפשרת ייצור ביופילמים בעלי תכונות מכניות מצוינות, אשר עשויים לאפשר ייצור חומרים ביומימטיים.

בעת טיפול בחיידקים אלה, ללבוש הגנה נאותה, כגון כפפות.