Name: שילוב מערכות SDS ללא הפחתה-דף ניתוח ויצירת קישור כימי כדי לזהות מכלולי מולטימאריק התייצב על ידי הקשרים הדיסולריים בתאי היונקים בתרבות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-02T14:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 37 s
Description: למד לזהות מכלולי חלבונים מרובי-יחידות המיוצבים על ידי קשרים דיסולפידיים בתאי יונקים תרביתיים באמצעות שיטת SDS-PAGE ללא הפחתה. השיטה מאפשרת ניתוח מהיר, פשוט וזול של מבני חלבונים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מעריכים בהכרת תודה את המאמצים המפורטים על ידי ד ר ג'ניפר פישר לטיהור הנוגדן של דפאטה פוליבטיים ו Kerri Ciccaglione עבור כל מאמציה לעזור לערוך את כתב היד. מחקר זה היה נתמך באופן חלקי על ידי מענק מקרן ניו ג'רזי בריאות (גרנטPC 11-18).

1. חסימת שאריות Cysteine חינם באמצעות Iodoamide
<ol><li>לגדול U-2 תאים מערכת ההפעלה 6 ס"מ2 צלחת ל 50% – 60% שליטה במדיום חיוני מינימלי עם גלוקוז גבוה המכיל 10% סרום העובר העוברי ו 1% נתרן פירובט ב 37 ° צ' ב 5% CO2.</li>
	<li>הפוך מלאי טרי של 10 מילימטר מיותר בדיוק לפני השימוש, ולאחר מכן להיפטר כל מגיב בשימוש.</li>
	<li>להוסיף 0.1 mM ריכוז הסופי של החברה ישירות למדיה של תרבות התא. מטלטל בעדינות את המנה בטמפרטורת החדר למשך 2 דקות.</li>
</ol>2. קצירת התאים
<ol><li>. ומכה את התקשורת מהתאים</li>
	<li>שטוף את התאים עם 5 מ ל של תמיסת מלח קר פוספט באגירה (PBS) שלוש פעמים. ולאחר מכן מוסיפים 1 מ ל של ה-pbs הקרה.</li>
	<li>מגרד את התאים מהחלק התחתון של המנה באמצעות מגרד התא. באמצעות מנקז 1 מ ל לצייר את PBS ואת התא ההשעיה ולוותר את כל הנוזל לתוך שפופרת מיקרוצנטריפוגה 1.5 mL.</li>
	<li>סובב את התאים ב 7,500 x g עבור שלושה דקות ב 4 ° c. . ומשאיר את הגלולה מאחור את הגלולה תא ניתן לאחסן ב-80 ° צ' עד העיבוד</li>
</ol>3. הפקת חלבון
<ol><li>הכינו 100 μL של מאגר פירוק 1x מדולל ב-ddH2O (ראה טבלת חומרים). הוסף פנילמתילסולולוניל פלוו (PMSF) מיד לפני השימוש 1 מ"מ ריכוז סופי.</li>
	<li>הוסף 50 μL של מאגר הליזה 1x ישירות לגלולה ולהשעות את התאים. מודקון זה על הקרח למשך 5 דקות.</li>
	<li>Sonicate עבור 8 s באמצעות מצב פולס קבוע ב 40% (ראה טבלת חומרים לsonicator; להתאים לפי הצורך sonicators שונים), שמירה על התמצית על קרח.</li>
	<li>ספין התמצית ב 4 ° צ' עבור 5 דקות ב 16,000 x g. הסופרנטאנט הוא שבר החלבון הנמס. ניתן לבצע ניתוח ברדפורד כדי לקבוע ריכוז חלבונים במידת הצורך.</li>
</ol>4. הכנה לדוגמא
<ol><li>לקחת 10 μL של תמצית חלבון מסיסים ולהוסיף 10 μL של 1x Laemmli SDS-מאגר לדוגמה (4% SDS, 20% גליצרול, 0.004% ברומאופנול כחול, ו 0.125 M טריס-HCl, pH 6.8). אין להוסיף הפחתת ריאגנטים.</li>
	<li>שמור דגימות על הקרח אם ניתוח SDS העמוד יבוצע באותו יום; לאחסון לטווח ארוך-20 ° c מתאימים. בדיוק לפני הפעלת ג'ל, לחמם את המדגם עבור 5 דקות ב 85 ° c.</li>
</ol>5. Vivo פורמלדהיד קרוס-קישור של חלבונים אנדוגניים בתאי מערכת ההפעלה U-2
<ol><li>הגדל את תאי מערכת ההפעלה U-2 ב 175 ס"מ2 בקבוקון עד 70% – 80% שטף (ראה סעיף 1).</li>
	<li>
לבצע את התגובה פורמלדהיד המקשר
	<ol>
<li>בתוך כיסוי, סדרת מחלקים a 37% פורמלדהיד פתרון שנרכשו ממקורות מסחריים. להוסיף את הקיבעון פורמלדהיד ישירות בינוני לריכוז הסופי של 1% ו-דגירה בטמפרטורת החדר עם עצבנות עדינה עבור 15 דקות.</li>
		<li>כדי להרוות את התגובה, להוסיף 1.25 M גליצין לריכוז הסופי של 0.125 M ו-דגירה בטמפרטורת החדר עם עצבנות עדינה על הנדנדה עבור 5 דקות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>רוחצים את התאים עם 5 מ ל של הערוץ הקר שלוש פעמים. להוריד את התמיסה הסופית של ה-PBS ולהוסיף 10 מ ל של PBS. מגרד את התאים מהחלק התחתון של הבקבוקון באמצעות מגרד תא.</li>
	<li>באמצעות מנקז 10 מ ל, לצייר את PBS ואת התא ההשעיה ולחלק את כל הנוזל לתוך 15 מ"ל שפופרת צנטריפוגה חרוט. סובב את התאים ב 500 x g עבור 2 דקות ב 4 ° c. . ומשאיר את הגלולה מאחור</li>
</ol>6. שבירה של גרעינים
<ol><li>הכינו 10 מ ל של מאגר הומוגון: 0.25 M סוכות, 1 מ"מ EDTA, 10 מ"מ HEPES, ו 0.5% BSA ב-pH 7.4. הוסף PMSF מיד לפני השימוש 1 מ"מ ריכוז סופי ו 3mL של מאגר ההשעיה גרעינים (0.1% טריטון X-100 ב PBS).</li>
	<li>להוסיף 5 מאגר המגון mL ישירות לתוך הגלולה התא ולהשעות לחלוטין. צנטריפוגה את ההשעיה ב 500 x g עבור 2 דקות ב 4 ° c ולאחר מכן להיפטר supernatant.</li>
	<li>השהה את הגלולה ב -5 מ ל. של מאגר הומוגון השתמש היטב הולם טפלון זכוכית הומוגניצר, דאונס המגון תאים במהירות 10 משיכות/500 סל ד.</li>
	<li>צנטריפוגה את ההשעיה ב 1,500 x g עבור 10 דקות ב 4 ° c, ואז להיפטר supernatant. הערה: השתמש supernatant עבור בידוד של המיטומטר על ידי תפרידו ב 10,000 x g עבור 10 דקות.</li>
	<li>להשעות את הגלולה ב 1 מ"ל גרעיני מאגר ההשעיה ו דגירה על הקרח עבור 10 דקות.</li>
	<li>צנטריפוגה ב 600 x g עבור 10 דקות. לבטל את הסופרנטאנט.</li>
	<li>השהה את הגלולה בתוך מאגר ההשעיה של גרעינים mL 1 ו צנטריפוגה שוב. . מחק את הסופרנטאנט הגלולה האחרונה תהיה. מבודדת גרעינים</li>
</ol>7. הפקת חלבון
<ol><li>חזור על סעיף 4, למעט הוספת 25 μL של מאגר הליזה 1x ישירות לגלולה התא ואז השעיית.</li>
</ol>8. הכנה לדוגמא
<ol><li>להכין שתי דגימות עבור SDS-עמוד על-ידי לקיחת 10 μL כל אחד תמצית חלבון מסיסים ולהוסיף 10 μL של 2x Laemmli SDS-מאגר לדוגמה 1 μL של 2-Mercaptoethanol (BME).</li>
	<li>לחמם דוגמה אחת עבור 5 דקות ב 37 ° צ' והדגם השני עבור 15 דקות ב 98 ° צ' כדי להפוך את הקישור לחצות פורמלדהיד.</li>
</ol>9. SDS-ניתוח עמודים
<ol><li>להכין 1 L של מאגר 1 x טריס-גליצין פועל (25 מ"מ Tris, 192 מ"מ גליצין, 0.1% (w/v) SDS).</li>
	<li>
הגדר את המנגנון המפעיל של SDS-PAGE. הערה: פרוטוקול זה משתמש ב-16% מהסדרות tgx sds-עמוד. של הערה, ניתן להשתמש בכל האחוזים ג'ל.<ol>
<li>עבור פרוטוקול היצרן, פתח את החבילה שהג'ל מאוחסן בו והסר את הקלטת.</li>
		<li>הסר את המסרק שנמצא בציפוי הבארות והקלטת מהחלק התחתון של הקלטת.</li>
		<li>הניחו את הג לתוך המנגנון הפועל.</li>
		<li>מלא את החדר עם המאגר המפעיל 1x עד שבארות המים בנוזל. באמצעות מחית פלסטיק, לשטוף את הבארות עם מאגר פועל.</li>
	</ol>
</li>
	<li>טען את הדגימות על ג'ל יחד עם 10 μL סמן סטנדרטי מראש.</li>
	<li>הפעל את ג'ל ב 200 V עד חזית הצבע הוא כ 1 ס מ מהחלק התחתון של ג'ל.</li>
</ol>10. כתם מערבי
<ol><li>הכינו 1 L של מאגר העברה של 1x (192 מילימטר גליצין, 20% המתנול) והחנות ב 4 ° צ' עד השימוש.</li>
	<li>הסר את הג בזהירות ופתח את הקלטת. באמצעות תער, לחתוך בזהירות ולמחוק את ג'ל הערימה. להרים את הג באמצעות פינה אחת ולמקם אותו מגש עם מאגר העברה, ומאפשר אותו רוק בעדינות עבור 5 דקות.</li>
	<li>בעוד הג הוא נדנדה, למקם בלוק קרח (מאוחסן ב-20 ° c) לתוך המיכל להעביר ולהוסיף את מאגר ההעברה כדי 3/4 מלא.</li>
	<li>להרטיב את הממברנה polyvinylidene (PVDF) הקרום על ידי השרתו ב 100% מתנול עבור 30 s.</li>
	<li>לאחר שחלפו 5 דקות, היכונו להגדיר את ההעברה במגש עם מאגר העברה. על מאגר ההעברות להיות מספיק כדי להטביע לחלוטין את האבן החשופה. הגדר את ההעברה החשופה כדלקמן: למטה, החלק התחתון של מחזיק הקלטת (שחור); לאחר מכן ספוג עבה, נייר מוכתם עבה במיוחד, ג'ל פוליאקרילמיד, קרום PVDF, נייר עבה במיוחד, וספוג סמיך; לבסוף את החלק העליון של מחזיק הקלטת (לבן) למעלה.</li>
	<li>נעל את הקלטת ומניחים את היחידה לתוך מיכל ההעברה בעזרת קרום PVDF לכיוון האנאודה החיובי והג'ל לכיוון השלילי. החלק העליון של היחידה עם מאגר העברה עד שההעברה שלך תהיה מלאה לחלוטין.</li>
	<li>הצב את היחידה על גבי צלחת מהומה. להוסיף בר מהומה ליחידה ולהתחיל ערבוב ב 125 סל ד.</li>
	<li>רוץ ב 100 V עבור 60 דקות.</li>
	<li>בעוד העברה פועלת, להכין פתרון של 5% אבקת חלב הומס באגירה מלוחים טריס, עם רצף-20, pH 7.5 (TBST).</li>
	<li>לפרק את היחידה ולהסיר את קרום, וציין איזה צד היה במגע עם ג'ל; ודא שהצד הזה נשאר למעלה במגש עבור השלבים הנותרים.</li>
	<li>להשרות את הקרום עבור 2 דקות בתוך מלוחים טריס באגירה (TBS) ואחריו חסימת הקרום על ידי דגירה 5 מ ל של 5% חלב-TBST פתרון עבור 30 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>להחליף את החלב עם טרי 4 מ ל של 5% חלב-TBST הפתרון ולהוסיף את הנוגדן העיקרי על הדילול הנכון (במקרה זה, הדילול שלנו הוא 1:2000 עבור נוגדן דפאסה) ו דגירה בלילה עם הנדנדה עדין ב 4 ° c.</li>
	<li>למחרת, להסיר את האבן החשופה מ 4 מעלות צלזיוס הנדנדה לטמפרטורת החדר נדנדה, להשליך את פתרון הנוגדן העיקרי.</li>
	<li>לעשות שלוש שוטף מהיר עם TBST, באמצעות נוזל מספיק כדי להטביע לחלוטין את הכתם, ואחריו 3 שוטף, 5 דקות כל אחד, נדנדה לאט.</li>
	<li>לאחר השטיפה האחרונה, להוסיף 5 מ ל של 5% חלב הפתרון האחרון סלע האבן החשופה עבור 15 דקות לאחר מכן להשליך.</li>
	<li>הוסף נוגדן משני מדולל ב 5% חלב-TBST בריכוז הרצוי. (במקרה זה, 1:5000 דילול עז נגד ארנבת מדולל 5 מ ל של 5% חלב-TBST פתרון)</li>
	<li>דגירה בטמפרטורת החדר, נדנדה עבור 1 h, ואז למחוק את הפתרון.</li>
	<li>לעשות שלוש שוטף מהיר עם TBST ואחריו 3 שוטף, 5 דקות כל אחד, נדנדה לאט, ואז למחוק את הכביסה הסופית ולהוסיף 5 מ ל של TBS.</li>
	<li>הכינו תערובת 1:1 של פתרונות זיהוי של ECL (1 מ ל של כל מגיב לכרך הסופי של 2 מ ל) והוסיפו זאת ישירות לדגירה החשופה של 1 דקות.</li>
	<li>להסיר את הקרום באמצעות מלקחיים ולטפוח על הפינה עם מחיקה מעבדה, הסרת כל פתרון עודף. הניחו את הקרום בעטיפת הכיווץ והניחו את הצד החלבון בתוך קלטת רנטגן.</li>
	<li>לחשוף את הקרום. לסרט רנטגן זמן החשיפה ישתנה.</li>
</ol>

<ol><li>Klomsiri, C., Karplus, P. A., Poole, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cysteine-based+redox+switches+in+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+and+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">Cysteine-based redox switches in enzymes.</a> Antioxidants and Redox Signaling. 14 (6), 1065-1077 (2011).</li>
<li>Antelmann, H., Helmann, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thiol-based+redox+switches+and+gene+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+and+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">Thiol-based redox switches and gene regulation.</a> Antioxidants and Redox Signaling. 14 (6), 1049-1063 (2011).</li>
<li>Brandes, N., Schmitt, S., Jakob, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thiol-based+redox+switches+in+eukaryotic+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+and+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">Thiol-based redox switches in eukaryotic proteins.</a> Antioxidants and Redox Signaling. 11 (5), 997-1014 (2009).</li>
<li>Groitl, B., Jakob, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thiol-based+redox+switches%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Thiol-based redox switches.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1844 (8), 1335-1343 (2014).</li>
<li>Stern, B. D., Wilson, M., Jagus, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+nonreducing+SDS-PAGE+for+monitoring+renaturation+of+recombinant+protein+synthesis+initiation+factor%2C+eIF-4+alpha%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expression+and+Purification%22%5BJournal%5D)">Use of nonreducing SDS-PAGE for monitoring renaturation of recombinant protein synthesis initiation factor, eIF-4 alpha.</a> Protein Expression and Purification. 4 (4), 320-327 (1993).</li>
<li>Gorman, J. J., Wallis, T. P., Pitt, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+disulfide+bond+determination+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrometry+Reviews%22%5BJournal%5D)">Protein disulfide bond determination by mass spectrometry.</a> Mass Spectrometry Reviews. 21 (3), 183-216 (2002).</li>
<li>Li, X., Yang, X., Hoang, V., Liu, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Protein+Disulfide+Linkages+by+MS+In-Source+Dissociation+Comparing+to+CID+and+ETD+Tandem+MS%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+for+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Characterization of Protein Disulfide Linkages by MS In-Source Dissociation Comparing to CID and ETD Tandem MS.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. , (2018).</li>
<li>Kelly, S. M., Price, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+circular+dichroism+in+the+investigation+of+protein+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protein+and+Peptide+Science%22%5BJournal%5D)">The use of circular dichroism in the investigation of protein structure and function.</a> Current Protein and Peptide Science. 1 (4), 349-384 (2000).</li>
<li>Klockenbusch, C., Kast, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+formaldehyde+cross-linking+for+protein+interaction+analysis+of+non-tagged+integrin+beta1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedicine+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Optimization of formaldehyde cross-linking for protein interaction analysis of non-tagged integrin beta1.</a> Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2010, 927585(2010).</li>
<li>Gavrilov, A., Razin, S. V., Cavalli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+formaldehyde+cross-linking%3A+it+is+time+for+black+box+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Briefings+in+Functional+Genomics%22%5BJournal%5D)">In vivo formaldehyde cross-linking: it is time for black box analysis.</a> Briefings in Functional Genomics. 14 (2), 163-165 (2015).</li>
<li>Rotoli, S. M., Jones, J. L., Caradonna, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cysteine+residues+contribute+to+the+dimerization+and+enzymatic+activity+of+human+nuclear+dUTP+nucleotidohydrolase+%28nDut%29%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Cysteine residues contribute to the dimerization and enzymatic activity of human nuclear dUTP nucleotidohydrolase (nDut).</a> Protein Science. , (2018).</li>
<li>Caradonna, S., Muller-Weeks, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nature+of+enzymes+involved+in+uracil-DNA+repair%3A+isoform+characteristics+of+proteins+responsible+for+nuclear+and+mitochondrial+genomic+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protein+and+Peptide+Science%22%5BJournal%5D)">The nature of enzymes involved in uracil-DNA repair: isoform characteristics of proteins responsible for nuclear and mitochondrial genomic integrity.</a> Current Protein and Peptide Science. 2 (4), 335-347 (2001).</li>
<li>Macpherson, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noxious+compounds+activate+TRPA1+ion+channels+through+covalent+modification+of+cysteines%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Noxious compounds activate TRPA1 ion channels through covalent modification of cysteines.</a> Nature. 445 (7127), 541-545 (2007).</li>
<li>Carey, M. F., Peterson, C. L., Smale, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+immunoprecipitation+%28ChIP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Chromatin immunoprecipitation (ChIP).</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (9), (2009).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי אינטרסים עם תוכן כתב היד הזה.

השיטה המתוארים כאן מעניקה פרוטוקול ישר קדימה לניתוח של מכלולי מולטימאריק התייצב באמצעות קישור דיגופרתי. פרוטוקול זה ניתן בקלות להתאים קווים אחרים תרבות התא, רקמות ואורגניזמים המאפשרים מגוון רחב של יישומים.
צעד חשוב בהליך זה הוא להבטיח את הקישור הדיגופרתי הגילאים אינם תוצאה של הליך החילוץ. ניתן לחסום כל שאריות ציסטאין בחינם באמצעות iodoacetamide13. סוכן אלטקילה זה יהיה לאגד באופן מצער כדי ציסטאין שאריות למרות הקבוצה תיול שלהם, חסימת היווצרות של איגרות חוב קשר דיסולפידי ח...

הקשרים disulfide כבר זמן רב ידועים לייצב את המבנה של חלבונים רבים. בעבודה האחרונה, הקשר הזה מסווג גם כשינוי הפיך לאחר המעבר, מתנהג כמו מיתוג מבוסס cysteine "המאפשר אפנון של פונקציית חלבון, מיקום ואינטראקציה1,2, 3,4. לכן, חשוב להיות מסוגל ללמוד את השינוי הזה. שיטה פשוטה לנתח אלה cysteine התייצב מכלולי מערכות הוא דרך שאינם מצמצמים SDS-ניתוח עמוד5. Sds-ניתוח העמוד הוא טכניקה המשמשת במעבדות רבות, שבו ניתן להשיג את התוצאות ולפרש במהירות, בקלות, עם עלויות מינימליות, והוא יתרון על טכניקות אחרות המשמשות לזיהוי הקשרים קשר דיסולפידי כגון ספקטרומטר המוני6 ,7 ו קיווטות מעגלית8.
צעד חשוב אחד לקבוע אם שיטה זו היא טכניקה מתאימה כדי לסייע במחקר היא לבחון ביסודיות את הרצף העיקרי של חלבון הריבית כדי להבטיח שיש שאריות ציסטאין (s) נוכח. צעד מועיל נוסף הוא לחקור כל מבנה גביש הקודם שפורסם או להשתמש באפליקציה בביואינפורמטיקה כדי לחקור את המבנה תלת מימדי של חלבון הריבית כדי לדמיין היכן שאריות ציסטאין (s) יכול להיות ממוקם. אם השאריות נמצאות על המשטח החיצוני, היא עשויה להיות מועמדת טובה יותר ליצירת הצמדה דיגואנית במקום שאריות ציסטאין הקבורים בתוך המבנה. עם זאת, חשוב לציין כי חלבונים עשויים לעבור שינויים מבניים על אינטראקציות המצע או האינטראקציות חלבון חלבון המאפשר שאריות אלה להיות חשופים גם לסביבה.
זיהה מכלולי מולטימאריק יכול להיות מאומת עם החוצה קישור כימי באמצעות פורמלדהיד. פורמלדהיד הוא האידיאלי cross-מקשר עבור טכניקת אימות זה בשל חדירות התא גבוה החוצה טווח קישור קצר של ~ 2-3 Å, להבטיח זיהוי של אינטראקציות חלבון חלבונים ספציפיים9,10. כאן, שיטה זו מומחש על ידי ניתוח isoform גרעינית של דאפס של העצם האנושי מערכת התאים אוסטאוסרקומה U-2 OS11. עם זאת, פרוטוקול זה יכול להיות מותאם עבור קווי תאים אחרים, רקמות ואורגניזמים.

<table><tbody><tr><td>16% ג'ל TGX טרומי</td><td>ThermoFisher</td><td>Xp00160</td><td></td></tr><tr><td>175 ס"מ2 בקבוק</td><td>תא כוכב</td><td>658175</td><td></td></tr><tr><td>18CO</td><td>ATCC</td><td>CRL-1459</td><td></td></tr><tr><td>6 ס"מ2 צלחת</td><td>VWR</td><td>10861-588</td><td></td></tr><tr><td>A549</td><td>ATCC</td><td>CCL-185</td><td></td></tr><tr><td>אמרשם ECL ערכת זיהוי</td><td>GE</td><td></td><td></td></tr><tr><td>16817200 מכשיר העברת כתמים</td><td>Biorad</td><td>153BR76789</td><td></td></tr><tr><td>BME</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>מגיב חלבון ברדפורד</td><td>Biorad</td><td>5000006</td><td></td></tr><tr><td>ברומופנול כחול</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>איתות תאים</td><td>99985</td><td></td></tr><tr><td>מאגר ליזה תאים</td><td>איתות תאים</td><td>9803</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה</td><td>Eppendor</td><td>5415D</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>מקדחה</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M101</td><td></td></tr><tr><td>מכשיר אלקטרופורזה</td><td>Invitrogen</td><td>A25977</td><td></td></tr><tr><td>נייר ספיגה מערבי עבה במיוחד</td><td>ThermoFisher</td><td>88610</td><td></td></tr><tr><td>עוברי סרום בקר</td><td>Gibco</td><td>1932693</td><td></td></tr><tr><td>פורמלדהיד</td><td>ThermoFisher</td><td>28908</td><td></td></tr><tr><td>הומוגנייזר</td><td></td><td></td><td></td>זכוכית-טפלון</tr><tr><td>גליצרול</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>65516</td><td></td></tr><tr><td>גליצין</td><td>RPI</td><td>636050</td><td></td></tr><tr><td>בלוק חום</td><td>דנוויל</td><td>10285-D</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H0527</td><td></td></tr><tr><td>חומצה הידרוכלורית</td><td>VWR</td><td>2018010431</td><td></td></tr><tr><td>יודואצטמיד</td><td>ThermoFisher</td><td>90034</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipe</td><td>Kimtech</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>מתנול</td><td>Pharmco</td><td>3390000000</td><td></td></tr><tr><td>איתות תאים חלב יבש ללא שומן</td><td></td><td>99995</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3813</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma Aldrich</td><td>329-98-6</td><td></td></tr><tr><td>Posi-click tube</td><td>Denville</td><td>C2170</td><td></td></tr><tr><td>ספק כוח</td><td>Biorad</td><td>200120</td><td></td></tr><tr><td>טוש מוכתם</td><td>מראש ThermoFisher</td><td>26619</td><td></td></tr><tr><td>PVDF ממברנה</td><td>Biorad</td><td>162-0177</td><td></td></tr><tr><td>נדנדה</td><td>אמינה מדעית</td><td>55</td><td></td></tr><tr><td>Saos2</td><td>ATCC</td><td>HTB-85</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Biorad</td><td>161-0302</td><td></td></tr><tr><td>איתות תאי</td><td>נוגדן משני</td><td>70748</td><td></td></tr><tr><td>מגרד תאים קטנים</td><td>Tygon</td><td>S-50HL Class VI</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>RPI</td><td>S23020</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פירובט</td><td>Gibco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>ברנסון</td><td>450</td><td></td></tr><tr><td>כרית ספוג לספיגה</td><td>Invitrogen</td><td>E19051</td><td></td></tr><tr><td>צלחת ערבוב</td><td>קורנינג</td><td>PC353</td><td></td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>S-1888</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>RPI</td><td>T60040</td><td></td></tr><tr><td>Tris Buffered Saline, עם Tween 20, pH 7.5</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SRE0031</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Glycine מאגר ריצה</td><td>VWR</td><td>J61006</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>U-2 OS</td><td>ATCC</td><td>HTB-96</td><td></td></tr><tr><td>סרט רנטגן</td><td>ThermoFisher</td><td>34090</td><td></td></tr></tbody></table>

שילוב מערכות sds ללא הפחתה-דף ניתוח ויצירת קישור כימי כדי לזהות מכלולי מולטימאריק התייצב על ידי הקשרים הדיסולריים בתאי היונקים בתרבות

Combining Non-reducing SDS-PAGE Analysis and Chemical Crosslinking to Detect Multimeric Complexes Stabilized by Disulfide Linkages in Mammalian Cells in Culture

המבנים של חלבונים רבים מיוצבים באמצעות קישורים דיצינטיים בעלי מבנה קוולנטי. בעבודה האחרונה, הקשר הזה מסווג גם כשינוי פוסט-טרנסלייתי. לכן, חשוב להיות מסוגל ללמוד שינוי זה בתאי החיים. שיטה פשוטה לנתח אלה cysteine התייצב מכלולי מערכות הוא באמצעות שיטת שני שלבים של שאינם מצמצמים SDS-ניתוח דף ו פורמלדהיד המקשר החוצה. זו שיטה בשני השלבים הוא יתרון כמו הצעד הראשון כדי לחשוף מכלולי מולטימאריק התייצב על ידי הקשרים קשר דיסולפידי בגלל הקלות הטכנית שלה עלות נמוכה של המבצע. כאן, העצם האנושית של קו התאים מערכת ההפעלה U-2 משמש כדי להמחיש שיטה זו על ידי ניתוח במיוחד של isopase גרעינית של דאפס.

מערכת הגרעין הגרעינית יוצרת הצמדה בלתי מולקולרית היוצרת תצורת קשר דיסולפידי יציבה דרך האינטראקציה של שני שאריות ציסטאין ממוקם על חומצת האמינו השלישי של חלבון monomeric11. הדבר מוצג באיור 1A, B. כדי להבטיח שההצמדה הדיאטנית הזו לא היתה אינטרקציה מסוימת בגלל חריגות הגירה בסביבה הלא מצומצמת, הכללה של שליטה מתאימה הייתה חיונית. מתוך הערה, דפאטה גרעיני הוא אחד. מארבעה איזוטפסים הנוכחים בבני אדם שלושה מתוך ארבעת הטפסים הם בעל...

הקשרים disulfide כבר זמן רב ידועים לייצב את המבנה של חלבונים רבים. שיטה פשוטה לנתח מכלולי מולטימאריק התייצב על ידי קישורים אלה היא באמצעות ניתוח שאינו מקטין SDS-PAGE. כאן, שיטה זו מומחש על ידי ניתוח isoform גרעינית של דאפס של העצם האנושית קו התאים אוסטאוסרקומה U-2 מערכת ההפעלה.

שילוב מערכות SDS ללא הפחתה-דף ניתוח ויצירת קישור כימי כדי לזהות מכלולי מולטימאריק התייצב על ידי הקשרים הדיסולריים בתאי היונקים בתרבות

The structures of many proteins are stabilized through covalent disulfide linkages. In recent work, this bond has also been classified as a ...

זה כבר מבוסס היטב כי המבנים של חלבונים רבים התייצבו בקישורים disulfide קוולנטי. בעבודה האחרונה קשר זה סווג כשינוי שלאחר התרגום. לכן, חשוב להיות מסוגל לזהות קומפלקסים מולטימרים מיוצבים ציסטאין בתאים חיים באמצעות שיטה מהירה ופשוטה.היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא כי התוצאות ניתן להשיג ולפרש במהירות, בקלות עם עלות מינימלית. כדי להתחיל, לגדל תאי מערכת הפעלה U-2 בצלחת שישה ס"מ מרובע במינימום חיוני בינוני גלוקוז גבוה, בתוספת 10% FBS ו 1% פירובט נתרן ב 37 מעלות צלזיוס ב 5%פחמן דו חמצני. הפוך מלאי טרי של 10 מילימולרים iodoacetamide רק לפני השימוש.לאחר התאים להגיע 50 כדי 60%confluency, להוסיף 0.1 מילימולר ריכוז סופי iodoacetamide ישירות למדיה תרבות התא. מטלטלים בעדינות את המנה בטמפרטורת החדר במשך שתי דקות. לאחר מכן, שאפו את המדיה מהתאים, ושטפו את התאים בחמישה מיליליטר של PBS קר שלוש פעמים.שאפו את פתרון הכביסה הסופי של PBS, והוסיפו מיליליטר אחד של PBS קר. מגרדים את התאים מתחתית המנה באמצעות מגרד תאים. באמצעות פיפטה של מיליליטר אחד לצייר את PBS ואת ההשעיה התא ולחלק את כל הנוזל לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר.לסובב את התאים ב 7, 500 פעמים גרם בארבע מעלות צלזיוס במשך שלוש דקות. שאף PBS משאיר את גלולת התא מאחור. גלולת התא ניתן לאחסן במינוס 80 מעלות צלזיוס עד עיבוד.כדי לחלץ את החלבון, הכינו 100 מיקרוליטרים של מאגר תיזה פי 1 מדולל במים מזוקקים כפולים. יש להוסיף PMSF מיד לפני השימוש בריכוז סופי של מילימולר אחד. לאחר מכן הוסיפו 50 מיקרוליטרים של מאגר התזה 1X ישירות לכדור התא והשעו מחדש.להחגירה את התמצית על הקרח במשך חמש דקות. Sonicate במשך שמונה שניות באמצעות מצב הדופק הקבוע ב 40%שמירה על התמצית על הקרח. לסובב את התמצית בארבע מעלות צלזיוס ו 16, 000 פעמים גרם במשך חמש דקות.בצע ניתוח ברדפורד כדי לקבוע את ריכוז החלבון אם תרצה. כדי להכין את המדגם לקחת 10 microliters של תמצית חלבון מסיסים ולהוסיף 10 microliters של מאגר מדגם 1X Laemmli SDS. שמור את הדגימות על קרח.מחממים את הדגימה ב 85 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות לפני הפעלת הג'ל. כדי להתחיל בקישור הצולב של הפורמלדהיד, הגדל את תאי מערכת ההפעלה U-2 בבקבוק של 175 ס"מ רבועים ל- 70 עד 80%. במכסה המנוע של האדים מוסיפים את התיקון הפורמלידייד ישירות למדיום לריכוז סופי של 1% ודגירה בטמפרטורת החדר עם תסיסה עדינה במשך 15 דקות.כדי לרוות את התגובה להוסיף 1.25 גליצין טוחן לריכוז הסופי של 0.125 טוחן דגירה בטמפרטורת החדר עם תסיסה עדינה על נדנדה במשך חמש דקות. לשטוף את התאים עם חמישה מיליליטר של PBS קר שלוש פעמים. שאפו את פתרון הכביסה הסופי של PBS והוסיפו 10 מיליליטר של PBS.מגרדים את התאים מתחתית הבקבוק באמצעות מגרד תאים. באמצעות פיפט 10 מיליליטר לצייר את PBS ומתלה התא ולחלק את כל הנוזל לתוך צינור צנטריפוגה חרוט 15 מיליליטר. לסובב את התאים ב 500 פעמים גרם וארבע מעלות צלזיוס במשך שתי דקות.שאף PBS משאיר את גלולת התא מאחור. הכן 10 מיליליטר של מאגר הומוגניזציה על ידי הוספת 0.25 סוכרוז טוחנת, EDTA מילימולרי אחד, 10 HEPES מילימולרית ו 0.5% BSA ב pH 7.4. מיד לפני השימוש, מוסיפים PMSF לריכוז סופי מילימולארי אחד ושלושה מיליליטר של חיץ המתלים הגרעינים.הוסף חמישה מיליליטר של מאגר הומוגניזציה ישירות לכדור התא ולתלות מחדש לחלוטין. צנטריפוגה ההשעיה ב 500 פעמים g וארבע מעלות צלזיוס במשך שתי דקות. לאחר צנטריפוגה, להשליך את supernatant ולתלות את גלולה בחמישה מיליליטר של חיץ הומוגניזציה.ואז עם זכוכית צמודה טפלון homogenizer dounce הומוגניזציה התאים ב 10 משיכות לכל 500 סל"ד ו צנטריפוגה ההשעיה ב 1, 500 פעמים g וארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. לאחר צנטריפוגה להשליך את העל טבעי. תן את גלולה במיליליטר אחד של חיץ המתלים גרעינים דגירה על קרח במשך 10 דקות.לאחר הדגירה, צנטריפוגה ב 600 פעמים גרם במשך 10 דקות. לאחר הצנטריפוגה, להשליך את supernatant, resuspend את גלולה במיליליטר אחד של חיץ ההשעיה גרעיני צנטריפוגה שוב. גלולה הסופית תהיה הגרעינים המבודדים.יש לחלץ את החלבונים כמתואר לפני הוספת 25 מיקרוליטרים של מאגר התיזה 1X ישירות לכדור התא. לאחר מכן הכינו שתי דגימות ל-SDS PAGE על ידי לקיחת 10 מיקרוליטרים לכל תמצית חלבון מסיסים והוסיפו 10 מיקרוליטרים של מאגר דגימת 2X Laemmli SDS ומיקרוליטר אחד של BME. מחממים דגימה אחת ב-37 מעלות במשך חמש דקות ואת הדגימה השנייה ב-98 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות כדי להפוך את הקישור הנגדי של הפורמדהיד.הכן ליטר אחד של חיץ ריצה טריס גליצין 1X על ידי ערבוב 25 מילימולרים טריס, 192 גליצין מילימולר ו 0.1% משקל לכל נפח SD. לאחר מכן הגדר את מנגנון הריצה של דף SDS. פתח את חבילת TGX SDS-PAGE של 16%precast לפי פרוטוקול היצרן והסר את המגירה. מוציאים את המסרק כי הוא רירית בארות ואת הקלטת מתחתית הקלטת וממקמים את הג'ל לתוך המנגנון פועל.מלאו את התא במאגר הריצה 1X עד שה בארות שקועות בנוזל. באמצעות פיפטה פלסטיק לשטוף את בארות עם חיץ פועל. טען את הדגימות על הג'ל יחד עם 10 מיקרוליטרים של הסמן הסטנדרטי המוכתם מראש.לבסוף, להפעיל את הג'ל ב 200 וולט עד חזית הצבע הוא כ סנטימטר אחד מתחתית הג'ל. ניתוח כתם מערבי של תמציות תאים כוללות בהיעדר סוכן להפחתת BME הדגים היווצרות מורכבת רב-כוכבית באוכלוסיות תאים אנושיות שונות. המתחם נעלם עם הוספת BME בכל ארבעת קווי התא שנבדקו, מה שמצביע על נוכחות של חיבור דיסולפידי.האישור המונומרי של dUTPase בתאים אנושיים בזמן הקציר הוא שילוב של לפחות שלושה מהאיזופורמים של dUTPase:isoform המיטוכונדריאלי, isoform הגרעיני, וגרסה קטועה ציין ב M24. האזופורם המיטוכונדריאלי המשמש כבקרה לא יוצר קשר דיסולפידי והיגר למשקל המולקולרי החזוי של החלבון המונומרי. פורמלדהיד הצלבה של dUTPase גרעיני הפגינו היווצרות מורכבת רב-מימרית.כאשר הקישור הנגדי התהפך על ידי דגירה המדגם ב 95 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות, המתחם היה חסר יציבות ו ניתן לדמיין במצבו המונומרי. הוספת iodoacetamide הוא צעד חשוב בהליך זה כדי לחסום את שאריות ציסטאין חינם כדי להבטיח כי הקישורים disulfide אינם תוצאה של הליך החילוץ. חשוב לזכור לא להוסיף כל סוכן צמצום, כגון BME או DDT לדגימות SDS-PAGE שלך כמו אלה יפחיתו את כל הקישורים disulfide נוכח המדגם שלך.

combining-non-reducing-sds-page-analysis-chemical-crosslinking-to

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

התא חדיר crosslinker DSP [dithiobis-(succinimidyl propionate)] מייצב אינטראקציות חלוף...

בידוד יציב Multi-חלבון על ידי תסביכים In vivo מבוקר נייד חוצה קישור חיסונית מגנטי כרומטוגרפיה זיקה

תרכובות לכידת הם מולקולות קטנות trifunctional כדי להפחית את המורכבות של proteome על ידי תפקודית אינטראקציה הפיך מולקולות חלבון קטן ואחריו crosslinking-צילום טיהור. כאן אנו משתמשים מתחם לכידת...

פרופיל של Methyltransferases ועל אחרים S-Adenosyl- L-הומוציסטאין מחייב חלבונים על ידי ספקטרומטריית מתחם המיסה לכידה (CCMS)

סרטון זה מתאר PAGE מולטימרי להפרדת קומפלקסים חלבוניים טבעיים מהומוגנאטים ברקמות. הטכניקה היא הכלאה של טכניקות כחולות-ילידיות-PAGE ו-SDS-PAGE. ניתן לאפיין ולחקור את המתחמים המופרדים על תפקידם בתפקוד התא.

Multimer-PAGE להפרדת קומפלקסים חלבוניים מקומיים: טכניקת הפרדה היברידית המורכבת מ- Blue Native-PAGE ו- SDS-PAGE להפרדת חלבונים מולטימריים שלמים מליזט רקמות

סרטון זה מתאר את הטכניקה של הפרדת דגימות החלבון על ידי SDS-PAGE שאינו מפחית כדי לנתח את קומפלקסי החלבונים הרב-תכליתיים. טכניקה זו שומרת על תת-היחידות המרובות של חלבון המוחזק על ידי הקשרים הדיסולפידים, אשר מאוחר יותר ניתן לנתח על ידי כתם מערבי.

דף SDS ללא חיזור: שיטה לניתוח קומפלקסים של חלבון מולטימרי המקושר לדיסולפיד

מחקרי Biophysical והביוכימי של אינטראקציות בין חלבוני קרום תחומים מוטבעים-להתמודד עם אתגרים טכניים רבים, הראשונה שבן היא קבלת חומר הלימוד מתאים. מאמר זה מתאר פרוטוקול להפקה וטיהור מתחמי פפטיד הטרנסממברני דיסולפיד-התייצב המתאימים לניתוח מבנים על ידי תהודה מגנטית גרעינית פתרון (NMR) ויישומים אנליטיים אחרים.

מכלולי פפטיד הטרנסממברני ייצור של דיסולפיד-התייצבו ללימודים מבניים

מאמר זה מתאר פרוטוקול פשוט ומהיר להערכת המצב האוליגומרי של חלבון GTPase MxA דמוי דינמין מליזאטים של תאים אנושיים באמצעות שילוב של PAGE שאינו דנטורציה עם ניתוח כתמים מערביים.

אפיון של קומפלקסים חלבונים Multi-למקטע של MxA האדם שימוש ללא denaturing polyacrylamide ג&#39;ל אלקטרופורזה

שיטה לייצוב ומפריד קומפלקסי חלבוני ילידים מן lysate ללא שינוי הרקמות באמצעות אמין-reactive protein צולב מקשר מצמיד את ג'ל אלקטרופורזה polyacrylamide דו ממדי רומן (עמוד) מערכת מוצגת.

Multimer-עמוד: שיטה לכידת וחלבון פתרון מתחמי דגימות ביולוגיות

הארכיטקטורה של מתחמי חלבון חיוני לתפקוד שלהם. שילוב של טכניקות שונות המוני spectrometric הוכיח עוצמה ללמוד ההרכבה שלהם. אנחנו מספקים פרוטוקולים cross-linking כימי, יליד ספקטרומטר מסה ולהראות כמה שיטות משלימות אלה לעזור להבהיר את הארכיטקטורה של יחידת משנה רב חלבון הרכבות.

שילוב cross-linking כימי ספקטרומטר מסה של מתחמי חלבון שלם ללמוד את הארכיטקטורה של יחידת משנה רב חלבון להרכבות

כאן, אנו מתארים את הניצול של Grafix (קיבוע הדרגתי), צנטריפוגה הדרגתית גליצריול בנוכחות crosslinker, כדי לזהות אינטראקציות בין גורמי שיתוף שנקשרים באופן חולף לקומפלקס spliceosome.

ניצול של גראפיקס לאיתור אינטראקציות חולפות של Saccharomyces cerevisiae Spliceosome subcomplexes

הפרוטוקול הנוכחי מדגיש שיטה שונה לזיהוי וכימות של קישורי DNA-חלבון (DPC) והשינויים שלאחר התרגום שלהם (PTM), כולל יוביקוויטילציה, SUMOylation ו-ADP-ריבוסילציה המושרה על ידי מעכבי טופואיזומראז ועל ידי פורמלדהיד, ובכך מאפשר לחקור היווצרות ותיקון של DPCs וה-PTM שלהם.

זיהוי כמותי של הצלבות DNA-חלבון והשינויים שלאחר התרגום

למד לזהות מכלולי חלבונים מרובי-יחידות המיוצבים על ידי קשרים דיסולפידיים בתאי יונקים תרביתיים באמצעות שיטת SDS-PAGE ללא הפחתה. השיטה מאפשרת ניתוח מהיר, פשוט וזול של מבני חלבונים.

שילוב מערכות SDS ללא הפחתה-דף ניתוח ויצירת קישור כימי כדי לזהות מכלולי מולטימאריק התייצב על ידי הקשרים הדיסולריים בתאי היונקים בתרבות (וידאו) | JoVE Journal

שילוב מערכות SDS ללא הפחתה-דף ניתוח ויצירת קישור כימי כדי לזהות מכלולי מולטימאריק התייצב על ידי הקשרים הדיסולריים בתאי היונקים בתרבות

גלה סרטונים נוספים