הקלטת Electroretinogram דג זברה זחל באמצעות אלקטרודה ספוג-טיפ בצורת חרוט הרומן A

פרוטוקול זה מסייע לפשט את המדידות של אלקטרורטינוגרם או ERGs בזברה-דג זחל המספק קריאה תפקודית חשובה של התפתחות חזותית ומודלים של מחלות גנטיות. קצות ספוג רך של אלקטרודות הקלטה המשמשים בפרוטוקול זה קל לייצר באמצעות חומרים חסכוניים זמינים ונמנע נזק פוטנציאלי לעיני הזחל. האלקטרודה הרכה יותר עם קצה הספוג יכולה להקל על מדידות ERG חוזרות ונשנות של אותה עין.

אנשים חדשים בהליך זה עלולים מתקשים לעבוד תחת התאורה האדומה העמומה המשמשת לאורך כל ההליך. אבל חשוב שההסתגלות האפלה תישמר. כדי להכין את האלקטרודה הקלטת ספוג בצורת חרוט, לחתוך את הקצה מתוך הרחבה עופרת אלקטרודה פלטינה ולהשתמש אזמל כדי להסיר 10 מילימטרים של ציפוי בידוד polytetrafluoethylene החיצוני מהקצה החדש של ההרחבה.

חותכים חתיכה 40 מילימטר של חוט כסף בקוטר 0.3 מילימטר ולזרום את חוט הכסף עם החוט הפנימי חשוף כדי לחבר את החוט באופן מאובטח להוביל אלקטרודה. עטוף את המפרק עם סרט בידוד משאיר כ 15 מילימטר אורך של חוט כסף חשוף. חבר חוט נוסף למסוף השלילי של הסוללה וטבול את הקצה השני של החוט לתוך תמיסת מלח.

לטבול את חוט כסף חשוף מלוחים רגיל ולחבר את הקצה השני לטרמינל החיובי של מקור זרם ישיר תשעה וולט. לאחר 60 שניות, מניחים את החוט על רקמה סופגת להתייבש. בינתיים, לחתוך 20 על ידי 20 מילימטר מרובע של ספוג אצטט פוליוויניל לתוך צורת חרוט להרוות את הספוג פעם אחת חוצץ של רינגר.

תחת מיקרוסקופ אור עם סרגל קנה מידה על העין, להשתמש בלהב אזמל כדי לעצב את איפקס של הקונוס לקוטר של כ 40 מיקרומטר. מייבשים את הספוג בצורת חרוט על נייר טישו סופג עד שהוא מוצק. לפני החדרת חוט הכסף לתוך ספוג אצטט פוליוויניל מוצק מיובש בצורת חרוט דרך הבסיס של הקונוס, באמצעות סרט מסכה כדי לבודד כל מתכת חשופה עודפת כדי להפחית חפצים פוטו.

ביום הניסוי, לטבול את האלקטרודה ספוג הטה לתוך החיץ של רינגר במשך 15 דקות כדי להרוות את הספוג באופן מלא. לפחות שמונה שעות לפני ההקלטות, מניחים לא יותר מ-20 זחלי זברה בצינור אחד של 15 מיליליטר ללא מכסה ועטופים בנייר אלומיניום באינקובטור כהה. בסוף הדגירה, יוצקים את דג הזברה החשוך לתוך צלחת פטרי תחת תאורה אדומה עמומה מדיודה פולטת אור.

כדי להכין את פלטפורמת הספוג, לחתוך חתיכת ספוג אצטט פוליוויניל בערך שווה בעובי לעומק של צלחת פטרי 35 מילימטר, כך הספוג יתאים בנוחות בתוך המנה. בצע חתך קטן אנכית דרך קצה אחד של הספוג כדי להתאים את חוט הכסף של אלקטרודה התייחסות להשרות את הספוג בחוצץ של דג זהב רינג'ר עד הספוג הוא רווי. לאחר מכן מניחים את הספוג לתוך צלחת פטרי נקייה 35 מילימטר ולהשתמש במגבת נייר לספוג את הנוזל הנוסף עד שום פתרון מפריש מן הספוג בתגובה ללחוץ אצבע קלה.

כדי למקם את החיה לניסוי, השתמש פיפטה פסטר שלושה מילימטר להעביר זחל הרדמה על ריבוע שלושה על שלושה סנטימטרים של מגבת נייר ולהשתמש מדפים כדי למקם את הריבוע על ספוג לח. בעזרת מברשת דקה ספוגה במאגר של רינגר, התאימו את מיקום הזחל כשעין אחת פונה כלפי מעלה והתרחקה מכל נוזל על המגבת מתחת לזחל. זיגוג גוף הזחל עם ג'ל עיניים לחות כדי לשמור על החיה hydrated לאורך הקלטת electroretinogram.

ומ מניחים את המנה על פלטפורמה קטנה ומחוממת מים מול גירוי האור של קערת גנזפלד הממוקמת בתוך כלוב פאראדיי. הכנס את אלקטרודה התייחסות לתוך החתך שנעשה בספוג פלטפורמה. ולחבר אלקטרודה קרקעית שהושגה מסחרית לכלוב פאראדיי.

חבר את האלקטרודה ההקלטה למחזיק אלקטרודה ולאבטח את המחזיק לזרוע הסטריאוטוקסית של מיקרומניפולטור. באמצעות פיפטה פסטר שלושה מילימטר, resaturate קצה הספוג של האלקטרודה עם טיפה אחת של הפתרון של רינגר ולמקם את המיקרוסקופ בכלוב פאראדיי מעל פלטפורמת האלקטרורטינוגרם. השתמש בקצה של רקמה סופגת כדי להסיר כל נוזל עודף מן קצה ספוג האלקטרודה מתחת למיקרוסקופ, למקם את האלקטרודה הפעילה, כך קצה הספוג נוגע בעדינות את פני הקרנית המרכזית של העין זברה זחל.

לאחר מכן הזיזו את קערת גנץפלד לכיוון פלטפורמת הספוג ודאגו שהזחל מכוסה בקערה וסגרו את הכלוב כדי להפחית רעש אלקטרומגנטי חיצוני. הרגישות של רשתית זברה-דג הזחל להבזקי דימר עולה עם הגיל. כמו a-ו- b-גלים אינם מזוהים ב מידות נמוכות ממינוס 1.61 יומן candela השני למטר בריבוע בארבעה ימים לאחר הפריה בעוד אותות ברורים ניתנים לגילוי בגדלים אלה בזחלים הישנים.

משרעת b-wave עולה במידה ניכרת בין ארבע לחמש לאחר ההפריה. בשבעה ימים, האות ב 2.48 יומן candela השני למ"ר הוא גדול יותר לעומת ימים חמש ושש לאחר הפריה. A-ו-b-גל פעמים משתמעות להיות מהיר יותר באופן משמעותי לאחר חמישה ימים לאחר ההפריה.

בסך הכל, תוצאות אלה הפגינו התבגרות בתפקוד הרשתית zebrafish בין ארבעה לשבעה ימים לאחר ההפריה. כדי לבצע בהצלחה פרוטוקול זה חיוני כי ספוגים רוויים לחלוטין בנוזל אשר מסייע לשמור על המוליכות של האלקטרודה הקלטה ומוריד את רמות הרעש. אם הגל הוא עניין מיוחד, טיפולים תרופתיים ניתן ליישם כדי לחסום את רכיב b-wave ובכך לחשוף את הגל המלא.