Name: בידוד והערכה כמותית של תאי המברשת מקנה הנשימה של העכבר (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-12T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: למד שיטה לבידוד תאי מברשת מקנה הנשימה בעכבר באמצעות פפאין ודיספאז לשמירת חיות התאים. הטכניקה מאפשרת ניתוח תעתיקי RNA ומחקר ביולוגיית דרכי הנשימה העליונות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לאדם שכינין במרכז ליבת מרכז האימונולוגיה של הנשים במהלך הסיוע באמצעות מיון ציטומטלי זרימה. עבודה זו נתמכת על ידי המכונים הלאומיים של מענקי בריאות R01 HL120952 (N.A.B.), R01 AI134989 (נ. א. ב), U19 AI095219 (N.A.B., L. G. B), ו K08 AI132723 (L. G. B), ועל ידי האקדמיה האמריקנית לאלרגיה, אסטמה, ואימונולוגיה (ראה)/אמריקן לונג אלרגיות פרס מחלת הנשימה (N.A.B.), על-ידי פרס פיתוח הפקולטה למדעי הקרן (L.G.B.), על ידי הפרס הצעיר של סטיבן וג קיי (N.A.B.), על ידי הקרן לפיתוח קריירה של מדעני נשים (L.G.B.), וב תרומה נדיבה של משפחת ויניק (L.G.B.).

לפני שתנהל את הניסויים הבאים, ודא שכל השימוש בבעלי חיים והפרוטוקולים מאושרים על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים (iacuc) והופיעה בהסכמה עם המדריך הלאומי של מועצת המחקר לטיפול ושימוש ב חיות מעבדה "(8ה מהדורה, 2011) והנחיות הגעה. כל ההליכים המתוארים להלן נבדקו ואושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים והשימוש בבית החולים לנשים בריגהם.
1. הכנת ריאגנטים
<ol><li>הכנת פתרון העיכול Dispase, שהוא פתרון PBS המכיל 16 U/mL dispase ו 20 μg/mL DNase I. ודא כי אבקת dispase מומס היטב לפני התחממות הפתרון באמבט מים ב 37 ° c.</li>
	<li>הוסף 5% חום בלתי מופעל העובר סרום (FBS) כדי להפוך את מדיום נשר שונה בינונית (DMEM) כדי לבצע פתרון הפסקה.</li>
	<li>הכינו את המאגר האני מאגר: להוסיף 26 U/ml פפאין (20 μl/ml של 48 u/mg פתרון פפאין) ו 10 μl/ml l-cysteine של hepes-tyrode של מאגר ללא סידן.</li>
	<li>הכינו את המאגר השני של Tyrode: להוסיף 2 μL/mL ליופטין (5 מ"ג/mL) למאגר של הייפסי-טירכב עם סידן.</li>
	<li>להכין מאגר facs: השימוש בתמיסת מלח מאוזנת של הנקס (hbss) ללא סידן, מגנזיום & פנול אדום, שיושלם עם 2 מ"מ חומצה ethylenediammiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiihi</li>
</ol>2. חיתוך של קנה הנשימה של העכבר
הערה: עכברים המשמשים בפרוטוקול זה הם צ'אט(BAC)-Egfp (B6. Cg-Tg (RP23-268L19-EGFP) 2Mik/J), 3-6 חודשים של גיל שני המינים. מזער את החשיפה של הרקמה לאור ישיר כדי להפחית את הלבנת התמונות של eGFP.
<ol><li>המתת חסד עם העכבר עם 100 mg/ק"ג פנטוברביטל המתת הרדמה intraperitoneally או באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים שאושרו על ידי IACUC.</li>
	<li>לתקן את העכבר על לוח כירורגי במצב פרקדן עם 21 מחטים G עם גפיים המורחבת העליון והתחתון. רסס את הפרווה עם 70% אטואה כדי לחטא את האזור.</li>
	<li>באמצעות מלקחיים ישרים, להרים את העור ואת הפרווה של הבטן ולעשות חתך במרכז עם מחתך מספריים (מספריים ישרים, 3 ס מ). באמצעות המספריים, הפרידו את העור מרקמת התת-עורית מהבטן אל הממהולה. בעוד מחזיק את הרקמה התת עורית למעלה עם מלקחיים, לעשות חתך קטן עם המספריים במרכז קיר הבטן.</li>
	<li>פתח את הצפק עם חתך בצורת V. באמצעות מלקחיים, בעדינות להזיז את המעי הדק בצד, לאתר את אבי העורקים הבטן ואת המטה קאווה ולעשות חתך עם המספריים מבתר כדי לאפשר הקלה מהירה לדימום.</li>
	<li>. תאתר את הסרעפת באמצעות מחט של 18 G, לעשות פתיחה בסרעפת מתחת עצם החזה כדי לרוקן את הריאות. הפרידו בקפידה את הסרעפת מכלוב הצלעות בעזרת מספריים חדים הפונים ישר לחיתוך לאורך בסיס הצלעות.</li>
	<li>באמצעות מלקחיים, להרים את הקצה החשוף של עצם החזה ולחתוך את עצם החזה מlongitudinally מהבסיס של כלוב הצלעות לצוואר. בצע חתך צוואר הרחם המרכזי עם מספריים ישרים קצרים (2 ס מ) ולהפריד את שתי האונות של בלוטת הלסת התחתונה.</li>
	<li>הסר בזהירות את רקמת החיבור המקיפים את בלוטת התימוס על ידי קרינה עם זוג מלקחיים דיוק באיכות גבוהה גבוה.</li>
	<li>לנתח את קנה הנשימה בחינם הראשון על ידי הפרדת הקצה הטוב ביותר ברמה של אפיגלוטיס ולאחר מכן על ידי מבתר את הקצה המרוחק ברמת הבייון של קנה הנשימה.</li>
	<li>לאתר את אפיגלוטיס ולחתוך את קנה הנשימה longitudinally מן אפיגלוטיס אל קרינה.</li>
</ol>3. מסדר העיכול האפיתל
<ol><li>מניחים את קנה הנשימה לתוך צינור 1.5 mL המכיל 750 μL של טרום מחומם (כדי 37 ° c) פתרון העיכול dispase. דגירה על שייקר ב 200 סל ד עבור 40 דקות בטמפרטורת החדר. כסו את הצינור ברדיד אלומיניום כדי להקטין את החשיפה לאור ישיר.</li>
	<li>הוסף 750 μL של DMEM קר עם 5% FBS כדי לעצור את התגובה. . מקום על הקרח</li>
	<li>העבר את קנה הנשימה לצלחת פטרי (100 מ"מ x 15 מ"מ) ומקום תחת מיקרוסקופ מבתר. כוון את קנה הנשימה עם הצד האפיתל פונה כלפי מעלה. בקנה הנשימה longitudinally גזור צורה חצי גליל מתוחזק על ידי טבעות הסחוס. . האפיתל נמצא על משטח הקימור</li>
	<li>לקשור את האזור אפיגלוטיס של קנה הנשימה עם מלקחיים ישר לצלחת פטרי באמצעות גודל 22 אזמל חד פעמי, לגרד את האפיתל את קנה הנשימה. שכבת האפיתל מפרידה כסדין שקוף.</li>
	<li>. הללו את האפיתל עם האזמל העבר את שכבת האפיתל לשפופרת של 2 מ ל.</li>
	<li>לשטוף את צלחת פטרי עם 750 μL של Tyrode אני מאגר ולהעביר לצינור 2 מ"ל המכיל את שכבת האפיתל.</li>
	<li>מודדאת שכבת האפיתל הקנה בתוך Tyrode אני מאגר עבור 30 דקות ב 37 ° c על שייקר ב 200 סל ד. כסו את הצינור ברדיד אלומיניום כדי להקטין את החשיפה לאור ישיר.</li>
	<li>הוסף 750 μL של המאגר השני של טירודה. מערבולת את הרקמה מתעכל במרץ עבור 20-30 s. Triturate את הגון אכל עם מזרק מוצמד 18 גרם מחט 10 פעמים.  מעבר למחט מחוון של 21 גרם ו קצוצות 10-20 יותר פעמים.</li>
	<li>לסנן את התאים באמצעות מסננת 100 יקרומטר לתוך צינורית חרוט 50 mL. הוסף 30:1 vol/vol של מאגר FACS קר.</li>
	<li>ספין ב 350 x g עבור 10 דקות ב 4 ° צ' ולהיפטר supernatant. השהה מחדש את הגלולה במאגר FACS קר להעביר את ההשעיה של 12 מ"מ x 75 מ"מ (5 mL) פוליסטירן מוקצף. ספין שוב ב 350 x g עבור 10 דקות ב 4 ° צ' ולהיפטר supernatant.</li>
	<li>השהה מחדש את הגלולה ב-100 μL של מאגר FACS.</li>
	<li>הוסף 1 μL של אנטי עכבר CD16/32 נוגדן חסימת לחסום את הכריכה הלא ספציפית מודטה עבור 15 דקות על הקרח. . אל תשטוף את הכביסה</li>
	<li>להוסיף את הנוגדנים הבאים שולטת isotype: פסיפיק כחול נגד עכבר CD45 או עכברוש IgG2a, k (0.25 μg/106 תאים בנפח 100 μl) ו allophycocyanin (APC) נגד עכבר epcam או עכברוש IgG2b, k (0.5 μg/106 תאים ב 100 μl) נוגדנים מונבטיים. דגירה של 45 דקות על הקרח מוגן מפני אור ישיר. הוסף 4.5 mL של מאגר FACS קר, לערבב ספין ב 350 x g עבור 10 דקות ב 4 ° c. להיפטר מאגר FACS ולהשעות מחדש את הגלולה ב 300 μL של מאגר FACS קר.</li>
	<li>הוסף propidium יודיד (PI) (5 μg/mL) מיד לפני מיון cytometric הזרימה. הערה: לתאי מברשת יש צורה לא סדירה עם מספר תהליכים שעלולים להגביר את הדבקות שלהם במסננים (איור 3ג). השוונו 30 מ"מ ל 70 מ"מ ו 100 מ"מ מסננים ומצא כי מסנני הנקבוביות גדול יותר מבטיח תשואה טובה יותר. בנוסף, נשחקו יסודית של ההשעיה התא לאחר עיכול פפאין משפרת באופן משמעותי את התשואות תא מברשת. אנו ממליצים להשתמש במחט 18g עבור נשחקו הראשונית ואחריו קטן נשא (21 או 23 G מחט) לדיסוציאציה עדינה יותר של תאים.</li>
</ol>4. הזרם Cy, לנסות להזרים אסטרטגיה
<ol><li>זיהוי תאים מפסולת באמצעות זווית פיזור לפנים ולצד. לא לכלול את doublets באמצעות גובה פיזור הקדמי ורוחב ורוחב פיזור הצד ורוחבו. Doublets יהיו התאים בעלי ערכי רוחב גבוהים.</li>
	<li>בתוך התאים היחידים, זהה את התאים החיים כאוכלוסיה שהיא PI שלילית.</li>
	<li>בתוך התאים היחידים החיים, זהה את CD45 נמוך לתאים שליליים בהתבסס על פקד isotype.</li>
	<li>בתוך CD45 תאים נמוכים/שליליים, לזהות את התאים החיוביים EpCAM כי הם גם eGFP חיובי (בערוץ FITC). זוהי האוכלוסייה של תאי מברשת (איור 2א).</li>
</ol>

<ol><li>Tizzano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nasal+chemosensory+cells+use+bitter+taste+signaling+to+detect+irritants+and+bacterial+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Nasal chemosensory cells use bitter taste signaling to detect irritants and bacterial signals.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (7), 3210-3215 (2010).</li>
<li>Genovese, F., Tizzano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvillous+cells+in+the+olfactory+epithelium+express+elements+of+the+solitary+chemosensory+cell+transduction+signaling+cascade%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Microvillous cells in the olfactory epithelium express elements of the solitary chemosensory cell transduction signaling cascade.</a> PLoS One. 13 (9), 0202754(2018).</li>
<li>Bankova, L. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cysteinyl+leukotriene+3+receptor+regulates+expansion+of+IL-25-producing+airway+brush+cells+leading+to+type+2+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Immunology%22%5BJournal%5D)">The cysteinyl leukotriene 3 receptor regulates expansion of IL-25-producing airway brush cells leading to type 2 inflammation.</a> Science Immunology. 3 (28), (2018).</li>
<li>Krasteva, G., Canning, B. J., Papadakis, T., Kummer, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholinergic+brush+cells+in+the+trachea+mediate+respiratory+responses+to+quorum+sensing+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Cholinergic brush cells in the trachea mediate respiratory responses to quorum sensing molecules.</a> Life Sciences. 91 (21-22), 992-996 (2012).</li>
<li>Nadjsombati, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+Succinate+by+Intestinal+Tuft+Cells+Triggers+a+Type+2+Innate+Immune+Circuit%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Detection of Succinate by Intestinal Tuft Cells Triggers a Type 2 Innate Immune Circuit.</a> Immunity. 49 (1), 33-41 (2018).</li>
<li>von Moltke, J., Ji, M., Liang, H. E., Locksley, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuft-cell-derived+IL-25+regulates+an+intestinal+ILC2-epithelial+response+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tuft-cell-derived IL-25 regulates an intestinal ILC2-epithelial response circuit.</a> Nature. 529 (7585), 221-225 (2016).</li>
<li>Deckmann, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bitter+triggers+acetylcholine+release+from+polymodal+urethral+chemosensory+cells+and+bladder+reflexes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Bitter triggers acetylcholine release from polymodal urethral chemosensory cells and bladder reflexes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (22), 8287-8292 (2014).</li>
<li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Members+of+Bitter+Taste+Receptor+Cluster+Tas2r143%2FTas2r135%2FTas2r126+Are+Expressed+in+the+Epithelium+of+Murine+Airways+and+Other+Non-gustatory+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Members of Bitter Taste Receptor Cluster Tas2r143/Tas2r135/Tas2r126 Are Expressed in the Epithelium of Murine Airways and Other Non-gustatory Tissues.</a> Frontiers in Physiology. 8, 849(2017).</li>
<li>Krasteva, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholinergic+chemosensory+cells+in+the+auditory+tube%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cholinergic chemosensory cells in the auditory tube.</a> Histochemistry and Cell Biology. 137 (4), 483-497 (2012).</li>
<li>Krasteva, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholinergic+chemosensory+cells+in+the+trachea+regulate+breathing%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cholinergic chemosensory cells in the trachea regulate breathing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (23), 9478-9483 (2011).</li>
<li>Montoro, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+revised+airway+epithelial+hierarchy+includes+CFTR-expressing+ionocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A revised airway epithelial hierarchy includes CFTR-expressing ionocytes.</a> Nature. 560 (7718), 319-324 (2018).</li>
<li>Plasschaert, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-cell+atlas+of+the+airway+epithelium+reveals+the+CFTR-rich+pulmonary+ionocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A single-cell atlas of the airway epithelium reveals the CFTR-rich pulmonary ionocyte.</a> Nature. 560 (7718), 377-381 (2018).</li>
<li>Dwyer, D. F., Barrett, N. A., Austen, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological+Genome+Project%2C+C.+Expression+profiling+of+constitutive+mast+cells+reveals+a+unique+identity+within+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Immunological Genome Project, C. Expression profiling of constitutive mast cells reveals a unique identity within the immune system.</a> Nature Immunology. 17 (7), 878-887 (2016).</li>
<li>Howitt, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuft+cells%2C+taste-chemosensory+cells%2C+orchestrate+parasite+type+2+immunity+in+the+gut%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tuft cells, taste-chemosensory cells, orchestrate parasite type 2 immunity in the gut.</a> Science. 351 (6279), 1329-1333 (2016).</li>
<li>Bankova, L. G., Dwyer, D. F., Liu, A. Y., Austen, K. F., Gurish, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maturation+of+mast+cell+progenitors+to+mucosal+mast+cells+during+allergic+pulmonary+inflammation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunology%22%5BJournal%5D)">Maturation of mast cell progenitors to mucosal mast cells during allergic pulmonary inflammation in mice.</a> Mucosal Immunology. 8 (3), 596-606 (2015).</li>
<li>Rock, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basal+cells+as+stem+cells+of+the+mouse+trachea+and+human+airway+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12771-12775 (2009).</li>
<li>Rock, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+stromal+populations+contribute+to+pulmonary+fibrosis+without+evidence+for+epithelial+to+mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Multiple stromal populations contribute to pulmonary fibrosis without evidence for epithelial to mesenchymal transition.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (52), 1475-1483 (2011).</li>
<li>Gerbe, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+epithelial+tuft+cells+initiate+type+2+mucosal+immunity+to+helminth+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Intestinal epithelial tuft cells initiate type 2 mucosal immunity to helminth parasites.</a> Nature. 529 (7585), 226-230 (2016).</li>
<li>Rock, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmembrane+protein+16A+%28TMEM16A%29+is+a+Ca2%2B-regulated+Cl-+secretory+channel+in+mouse+airways%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Transmembrane protein 16A (TMEM16A) is a Ca2+-regulated Cl- secretory channel in mouse airways.</a> Journal of Biological Chemistry. 284 (22), 14875-14880 (2009).</li>
<li>Olsen, J. V., Ong, S. E., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypsin+cleaves+exclusively+C-terminal+to+arginine+and+lysine+residues%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Trypsin cleaves exclusively C-terminal to arginine and lysine residues.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 3 (6), 608-614 (2004).</li>
<li>Verma, S., Dixit, R., Pandey, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cysteine+Proteases%3A+Modes+of+Activation+and+Future+Prospects+as+Pharmacological+Targets%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Cysteine Proteases: Modes of Activation and Future Prospects as Pharmacological Targets.</a> Frontiers in Pharmacology. 7, 107(2016).</li>
<li>Huettner, J. E., Baughman, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+culture+of+identified+neurons+from+the+visual+cortex+of+postnatal+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Primary culture of identified neurons from the visual cortex of postnatal rats.</a> Journal of Neuroscience. 6 (10), 3044-3060 (1986).</li>
<li>Kaiser, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissociated+neurons+and+glial+cells+derived+from+rat+inferior+colliculi+after+digestion+with+papain%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Dissociated neurons and glial cells derived from rat inferior colliculi after digestion with papain.</a> PLoS One. 8 (12), 80490(2013).</li>
<li>Aoyagi, T., Takeuchi, T., Matsuzaki, A., Kawamura, K., Kondo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leupeptins%2C+new+protease+inhibitors+from+Actinomycetes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Antibiotics+%28Tokyo%29%22%5BJournal%5D)">Leupeptins, new protease inhibitors from Actinomycetes.</a> Journal of Antibiotics (Tokyo). 22 (6), 283-286 (1969).</li>
<li>Kohanski, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solitary+chemosensory+cells+are+a+primary+epithelial+source+of+IL-25+in+patients+with+chronic+rhinosinusitis+with+nasal+polyps%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Solitary chemosensory cells are a primary epithelial source of IL-25 in patients with chronic rhinosinusitis with nasal polyps.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 142 (2), 460-469 (2018).</li>
<li>Patel, N. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solitary+chemosensory+cells+producing+interleukin-25+and+group-2+innate+lymphoid+cells+are+enriched+in+chronic+rhinosinusitis+with+nasal+polyps%5BTitle%5D)+AND+%22International+Forum+of+Allergy+%26+Rhinology%22%5BJournal%5D)">Solitary chemosensory cells producing interleukin-25 and group-2 innate lymphoid cells are enriched in chronic rhinosinusitis with nasal polyps.</a> International Forum of Allergy & Rhinology. , (2018).</li>
<li>Kouzaki, H., O'Grady, S. M., Lawrence, C. B., Kita, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteases+induce+production+of+thymic+stromal+lymphopoietin+by+airway+epithelial+cells+through+protease-activated+receptor-2%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Proteases induce production of thymic stromal lymphopoietin by airway epithelial cells through protease-activated receptor-2.</a> The Journal of Immunology. 183 (2), 1427-1434 (2009).</li>
<li>Cambier, J. C., Vitetta, E. S., Kettman, J. R., Wetzel, G. M., Uhr, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B-cell+tolerance.+III.+Effect+of+papain-mediated+cleavage+of+cell+surface+IgD+on+tolerance+susceptibility+of+murine+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">B-cell tolerance. III. Effect of papain-mediated cleavage of cell surface IgD on tolerance susceptibility of murine B cells.</a> The Journal of Experimental Medicine. 146 (1), 107-117 (1977).</li>
<li>Nishikado, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cysteine+protease+antigens+cleave+CD123%2C+the+alpha+subunit+of+murine+IL-3+receptor%2C+on+basophils+and+suppress+IL-3-mediated+basophil+expansion%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Cysteine protease antigens cleave CD123, the alpha subunit of murine IL-3 receptor, on basophils and suppress IL-3-mediated basophil expansion.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 460 (2), 261-266 (2015).</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

מצאנו כי שילוב של טיפול במינון גבוה dispase עבור 40 דקות ואחריו טיפול פפאין קצר (30 דקות) מספק פרוטוקול אופטימלי לעיכול הקנה ובידוד תא מברשת. שילוב זה גם נמנע מעיכול נרחב ומייצר את התשואה הגבוהה ביותר של תאי מברשת, לעומת פרוטוקולים חלופיים.
בעוד העיכול הריאה לחלץ תאים המטפאות יש הסתמך באופן קלאסי על אנזימים העיכול מתון כמו קולגן הרביעי15, בידוד של תאים אפיתל דורש פרוטוקולים מורכבים יותר. תא בודד השעיות של תאים אפיתל קשה יותר להשיג בגלל הצמתים צר וחסיד מחייב אותם זה לזה ...

תאי מברשת שייכים מחלקה של תאים אפיתל כימוחושי מאופיין על ידי ביטוי של קולטני טעם המר ואת מכונות קולטן הטעם מצאו בתאים ניצן טעם. בניגוד לטעם ניצן תאים, התאים האפיתל כימופי מפוזרים משטחים אפיתל מכונים תאים כימוחושי הבידוד (sccs) ותאים microvillous ב אפיתל האף1,2, תאי מברשת בקנה הנשימה . תאים 3,4, ו-קווצת במעי5,6 תאים אפיתל ביטוי קולטני טעם המר ואת מכונות טעם המר התמרה גם מצויים בשופכה7,8 ו שפופרת השמיעה9. בתאי מברשת נתיב האוויר יש פונקציות ייחודיות הנוירוגניים ואת התגובה החיסונית החיסון. הם מייצרים אצטילכולין בתאי כימוחושי שעוררו רפלקסים הנשימה הגנה על ההפעלה עם תרכובות מר ומטבוליטים חיידקיים כמו חומרים חישת-quorum10. תאים מברשת נתיב האוויר הם גם מקור האפיתל של דרכי הנשימה הדומיננטי של IL-25, אשר מווסת aeroallergen-מעורר סוג 2 דלקת בדרכי הנשימה3.
אפיון מלוא ההמרה של תאים מברשת האוויר התחתון ואת התגובה שלהם גירויים סביבתיים כבר מוגבל על ידי מספרים נמוכים שלהם באפיתל הקנה ומספרים מוגבלים מאוד מעבר סמפונות גדול10. טכניקות המשמשות לבידוד של תאים כימוחושי מן האפיתל המעי לא הניבו מספרים גבוהים באופן פרופורציונלי מקנה הנשימה, אולי בגלל הקשרים האינטימיים של תאים מברשת הקנה עם קצות העצבים10 או אחרים מרכיבים ספציפיים לרקמה ברירית הנשימה, כגון הרכב של מחסיד וחלבונים הדוקים עם הצומת. דיווחים אחרונים של בידוד מוצלח של תאים מברשת קנה הנשימה במספרים גבוהים יותר עבור ניתוח ה-RNA של תא בודד המועסקים או 2 h דגירה עם פפאין או 18 h הדגירה עם המואז11,12. מאז יותר incubations עם אנזימי העיכול יכול להפחית את הכדאיות התאים ולשנות את הפרופיל הטרנס של תאים מתוך רקמות מתעכל13, זה יכול הטיה ניתוח השוואתי עם אוכלוסיות אפיתל אחרות כימוחושי.
כאן, אנו מדווחים על שיטה לבידוד של תאים מברשת קנה הנשימה ברצף RNA3. טיפול בקנה הנשימה במינון גבוה dispase מפריד את האפיתל מן הרירית. העיכול הבאים של גיליון אפיתל עם פפאין מאפשר התאוששות מצוינת של תא זה מבניים.

<table><tbody><tr><td><חזק>נוגדנים</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>אנטי-GFP (עז פוליקלונלית Ig)</td><td>Abcam</td><td>cat# ab5450</td><td></td></tr><tr><td>APC נגד עכבר CD326 (EpCAM)&nbsp; (G8.8)</td><td>חתול Biolegend</td><td>#118214</td><td></td></tr><tr><td>APC Rat IgG2a, k בקרת איזוטיפ</td><td>חתול Biolegend</td><td>#400511</td><td></td></tr><tr><td>חתול DAPI</td><td>Biolegend</td>#<td>422801</td><td></td></tr><tr><td>חמור נגד עזים IgG (H+L) נוגדן משני נספג מאוד, Alexa Fluor 488</td><td>Life Technologies/חתול בדיקות מולקולריות</td><td>#A-11055</td><td></td></tr><tr><td>עז רגילה IgG</td><td>R& D Systems</td><td>cat#AB-108-C</td><td></td></tr><tr><td>Pacific Blue נגד עכבר CD45 (30F-11)</td><td>Biolegend</td><td>cat#103126</td><td></td></tr><tr><td>Pacific Blue Rat IgG2b, k בקרת איזוטיפ</td><td>Biolegend</td><td>cat#400627</td><td></td></tr><tr><td>TruStain FcX (anti-mouse CD16/32) נוגדן</td><td>Biolegend</td><td>cat#101320</td><td></td></tr><tr><td>כימיקלים, פפטידים וחלבונים רקומביננטיים</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>חתול ג'יבקו</td><td># 17105041&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>cat# 10104159001</td><td></td></tr><tr><td>HEPES-Tyrode' s מאגר ללא סידן (10 מ"מ HEPES, 135 מ"מ NaCl, 2.8 מ"מ KCl, 1 מ"מ MgCl<תת>2, 12 מ"מ NaHCO3, 0.4 mM NaH2PO4, 0.25% BSA, 5.5 mM גלוקוז. מוכן במים של 18.2 מגה-הם ומסונן דרך 0.22 ומיקרו; m מסנן</td><td>Boston BioProducts</td><td>cat# PY-912</td><td></td></tr><tr><td>Tyrode' s תמיסה (חוצץ HEPES) 140 מ"מ NaCl, 5 מ"מ KCl, 25 מ"מ HEPES, 2 מ"מ CaCl2, 2 מ"מ MgCl2 ו-10 מ"מ גלוקוז. מוכן במים של 18.2 מגה-הם ומסונן דרך 0.22 ומיקרו; מסנן M. )</td><td>Boston BioProducts</td><td>cat# BSS-355</td><td></td></tr><tr><td>L-Cysteine</td><td>Sigma</td><td>cat# C7352</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptin trifluoroacetate salt</td><td>Sigma</td><td>cat# L2023</td><td></td></tr><tr><td>פפאין מלטקס פפאיה</td><td>סיגמא</td><td>cat# P3125</td><td></td></tr><tr><td>Propidium iodide&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>cat# P4170</td><td></td></tr><tr><td><מודלים ניסיוניים חזקים>: אורגניזמים/זנים</חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ChATBAC-eGFP (B6. Cg-TG (RP23-268L19-EGFP) 2Mik / J)</td> <td>מעבדת ג'קסון</td><td>7902</td><td></td></tr> <tr><td><חזק>ציוד< / חזק ></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSM 800 עם מערכת קונפוקלית של Airyscan&nbsp; ב-a&nbsp; Zeiss Axio Observer Z1 מיקרוסקופ הפוך</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSR</td><td></td><td>647465<</td><td></td></tr>ציוד <tr><td>חד פעמי חזק> חד פעמי </חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 מ"ל</td><td>תומאס סיינטיפיק</td><td>1157C86</td><td></td></tr><tr><td>5 מ"ל צינור עגול תחתון פויסטרן, סגנון 12 מ"מ x 75 מ"מ</td><td>פלקון</td><td>14-959-1A</td><td></td></tr><tr><td>50 מ"ל צינור חרוטי מפוליפרופילן, 30 מ"מ x 115 מ"מ בסגנון</td><td>פלקון</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>נוצות חד פעמי אזמל מס' 12</td> צלחת פטרי <td>פישר סיינטיפיק</td><td>NC9999403</td><td></td></tr><tr><td>, 100 מ"מ x 15 מ"מ סגנון</td><td>פלקון</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>מסננת תאים סטריליים, 100 &mu; מ</td><td>חתול פישרברנד</td><td>#22363549</td><td></td></tr></tbody></table>

בידוד והערכה כמותית של תאי המברשת מקנה הנשימה של העכבר

Isolation and Quantitative Evaluation of Brush Cells from Mouse Tracheas

תאי מברשת הקנה הם cholinergic כימוחושי תאים אפיתל צפוי לשדר אותות מן לומן דרכי הנשימה אל מערכות החיסון והעצבים. הם חלק ממשפחה של תאים אפיתל כימוחושי הכוללים תאים קווצת ברירית המעי, תאי מברשת בקנה הנשימה, וכימוחושי בידוד תאים microvillous ברירית האף. כימוחושי תאים בתאי אפיתל שונים לשתף סמנים תאיים מפתח וחתימה ליבה ההמרה, אבל גם להציג משמעותי transcript טרוגניות, כנראה רפלקטיבית של סביבת הרקמה המקומית. בידוד של תאים מברשת הקנה מתוך תא יחיד השבולים נדרש כדי להגדיר את הפונקציה של אלה תאים אפיתל נדירים בפירוט, אבל הבידוד שלהם הוא מאתגר, בגלל האינטראקציה הקרובה בין תאים מברשת קנה הנשימה וקצות העצבים או עקב הרכב ספציפי לדרכי הנשימה של צמתים הדוקים ומחסיד. כאן, אנו מתארים הליך בידוד של תאי מברשת מתוך האפיתל הקנה הנשימה של העכבר. השיטה מבוססת על הפרדה ראשונית של האפיתל קנה הנשימה מן הרירית, המאפשר הדגירה קצר יותר של גיליון האפיתל עם papain. הליך זה מציע פתרון מהיר ונוח עבור מיון cytometric זרימה וניתוח פונקציונלי של תאים מברשת קיימא הקנה.

הליך זה יושם בהצלחה כדי לבודד תאים מברשת הקנה הנשימה עבור רצפי RNA רצף3. לאחר בידוד של קנה הנשימה ואת העיכול של הרקמה עם פרוטוקול 2-step (איור 1), תאים נאספו והוכתם עם התווית FLUORESCENTLY ו-epcam לאחר החרגה של תאים מתים עם PI. לאחר היציאה doublets מבוסס על מאפייני פיזור בצד הקדמי, הגדרת תאי מברשת נמוך/שלילי עבור CD45, חיובי עבור EpCAM ו חיובי עבור eGFP (איור 2א). תאי מברשת מיוצגים ~ 0.16-0.42% מתאים CD45נמוך/מינוס</...

תאי מברשת הם נדירים cholinergic האפיתל תאים כימוחושי נמצא בקנה הנשימה של העכבר נאיבי. בשל המספרים המוגבלים שלהם, הערכה לשעבר vivo של תפקידם התפקודי בחסינות דרכי הנשימה ושיפוץ הוא מאתגר. אנו מתארים שיטה לבידוד של תאים מברשת קנה הנשימה על ידי הזרמת cy, לנסות.

Tracheal brush cells are cholinergic chemosensory epithelial cells poised to transmit signals from the airway lumen to the immune and nervous systems. ...

פיתחנו הליך לבידוד של תאי מברשת קנה-קנה, תאי אפיתל כימוסנסוריים מיוחדים נדירים מעכברי כתב פלואורסצנטי כולין אצטילטרנספראז. שיטה זו מבוססת על הפרדה ראשונית של אפיתל קנה דרך מתת-מוזה המאפשרת דגירה קצרה יותר של גיליון האפיתל עם פפאין. זה מאפשר התאוששות חזקה של תאי מברשת קנה דרך שימש בהצלחה לבידוד וניתוח שעתוק של תאי מברשת על ידי רצף RNA.דגירה ארוכה עם אנזימי עיכול יכולה להפחית את הכדאיות של התאים ולשנות את הפרופיל התמלולי של תאים המבודדים מרקמות. כאן אנו מפרידים את האפיתל קנה דרך עם dispase ולאחר מכן דגירה אותו עם פפאין למשך זמן קצר לייצר תשואות גבוהות של תאי מברשת קיימא. השיטה שלנו יכולה לתרום מחקרים של אפיתל בדרכי הנשימה העליונות.אותו פרוטוקול ניתן להחיל על בידוד תאי מברשת מאתרי ריר אחרים כגון רקמת האף. הדגמה של הטכניקה המשוחזרת ביותר שלנו תאפשר למדענים עמיתים לבודד ולחקור עוד יותר תאי מברשת קנה הנשימה. כדי להתחיל בהליך זה, להוסיף dispase ו DNase I ל PBS בריכוזים הסופיים המוצגים כאן כדי להכין את פתרון העיכול dispase.ודא כי אבקת dispase מומס במלואו לפני חימום הפתרון באמבט מים ב 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הוסף FBS עם 5%הפעלה בחום ל- DMEM כדי להכין פתרון עצירה. כדי להכין את חיץ טירוד אני, להוסיף פפאין ו L-ציסטאין למאגר של HEPES טירוד ללא סידן.כדי להכין את חיץ Tyrode II, להוסיף leupeptin למאגר של HEPES Tyrode ללא סידן בריכוז של שני microliters למיליליטר. כדי להכין את חיץ FACS, השתמש בתווית המלח המאוזנת של האנק ללא סידן, מגנזיום ופנול אדום בתוספת שני EDTA מילימול ו 2%FBS. לאחר המתת חום העכבר, השתמש 21 מחטי מד כדי לתקן את זה על לוח כירורגי בתמקם supine עם גפיים עליונות ותחתונות מורחבות.לרסס את הפרווה עם 70% אתנול כדי לחטא את האזור. באמצעות מדפים ישרים, להרים את העור ואת הפרווה של הבטן ולהשתמש מספריים לנתח לעשות חתך במרכז. באמצעות המספריים, להפריד את העור מן הרקמה התת עורית מהבטן אל mandibula.תוך החזקת הרקמה התת עורית עם המדפים, לעשות חתך קטן עם המספריים במרכז דופן הבטן. לאחר מכן פתח את ההצבה עם חתך בצורת V. באמצעות המדפים, בעדינות להעביר את המעי הדק לצד.אתר את האב העורקים הבטן ו vena קאווה ולעשות חתך עם מספריים לנתח כדי לאפשר exsanguination מהירה. אתר את הסרעפת. באמצעות מחט מד 18, לעשות פתח בסרעפת ממש מתחת לעצם החזה כדי לנפח את הריאות.באמצעות חד מחודד ישר לנתח מספריים, לחתוך לאורך הבסיס של הצלעות כדי להפריד בזהירות את הסרעפת מבית החזה. השתמש במקלות כדי להרים את הקצה החשוף של עצם החזה וחותכים את עצם החזה באורך מבסיס בית החזה לצוואר. השתמש מספריים ישר קצר לעשות חתך מרכזי בצוואר הרחם ולהפריד את שתי האונות של הבלוטות submandibular.לאחר מכן, השתמש בזוג מדפים מדויקים עדין כדי להסיר בזהירות את רקמת החיבור שמסביב ואת התימוס overlying את קרינה. לנתח את קנה הנשימה חינם על ידי תחילה הפרדת הקצה הפרוקסימלי ברמה של epiglottis ולאחר מכן לנתח את הקצה הדיסטלי ברמה של bifurcation של קנה הנשימה. אתר את האפיגלוטיס וחתוך את קנה הנשימה לאורך מהאפיגלוטיס לקרינה.כדי להתחיל, מניחים את קנה הנשימה לתוך צינור 1.5 מיליליטר המכיל 750 microliters של פתרון העיכול dispase מחומם מראש ל 37 מעלות צלזיוס. מכסים את הצינור בנייר אלומיניום כדי להפחית את החשיפה לאור ישיר ודרגירה על שייקר ב 200 סל"ד ו בטמפרטורת החדר במשך 40 דקות. לאחר מכן הוסיפו 750 מיקרוליטרים של DMEM עם 5%FBS כדי לעצור את התגובה ולהמקם את הצינור על קרח.מעבירים את קנה הנשימה לצלחת פטרי. לכוון את קנה הנשימה עם הצד האפיתל פונה כלפי מעלה. קנה הנשימה המנותח באורך יש צורה גלילית למחצה המתוחזקת על ידי הטבעות העגלתיות.האפיתל נמצא על המשטח הקסום. באמצעות מדחפים ישרים, לקשור את אזור epiglottis של קנה הנשימה לצלחת פטרי ולהשתמש בגודל 22 סילוק אזמל כדי לגרד את האפיתל את קנה הנשימה. שכבת האפיתל תיפרד כדף שקוף.השתמש באזמל כדי לטחון את האפיתל ולהעביר את שכבת האפיתל לצינור שני מיליליטר. לשטוף את צלחת פטרי עם 750 microliters של חיץ Tyrode אני ולהעביר את זה לצינור המכיל את שכבת האפיתל. מכסים את הצינור בנייר אלומיניום כדי להפחית את החשיפה לאור ישיר ודגירה ב 37 מעלות צלזיוס על שייקר ב 200 סל"ד במשך 30 דקות.לאחר מכן להוסיף 750 microliters של חיץ טירודה II קר. מערבולת הרקמה המתעכלת במרץ במשך 20 עד 30 שניות. באמצעות מזרק מחובר מחט מד 18, triturate הומוגנית 10 פעמים.לאחר מכן, לעבור מחט מד 21 ו triturate 10 עד 20 פעמים נוספות. לסנן את התאים דרך מסננת 100 מיקרומטר לתוך צינור חרוט 50 מיליליטר. הוסף מאגר FACS קר ביחס נפחי של 30 לאחד.צנטריפוגה ב 350 פעמים g ו בארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. השלך את העל-טבעי והתן מחדש את גלולת הכדור במאגר FACS קר. העבר השעיה זו לצינור פוליסטירן 12 על ידי 75 מילימטר.צנטריפוגה שוב ב 350 פעמים g ו בארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. השלך את העל-טבעי והתקן מחדש את גלולת הכדור ב- 100 מיקרוליטרים של מאגר FACS. לאחר מכן, הוסף מיקרוליטר אחד של נוגדן חסימת CD1632 נגד עכבר כדי לחסום כריכה לא ספציפית דגירה על קרח במשך 15 דקות.לאחר מכן הוסיפו נוגדנים בפקדי האיזוטיפ המתאימים כמתואר בפרוטוקול הטקסט. דגירה על קרח במשך 45 דקות תוך הגנה מפני אור ישיר. לאחר מכן, להוסיף 4.5 מיליליטר של מאגר FACS קר לערבב.צנטריפוגה ב 350 פעמים g וב ארבע מעלות צלזיוס. השלך את העל-טבעי ומזג מחדש את גלולת הכדור ב-300 מיקרוליטרים של מאגר FACS קר. יש להוסיף פרופידיום יודיד מיד לפני המיון הציטומטרי של הזרימה.במחקר זה, תאי מברשת קנה דם מ עכברי כתב אצטילכולין אצטילכולין ChAT eGFP מבודדים בהצלחה עבור רצף RNA. תאים מזוהים מפסולת על ידי זווית פיזור קדימה וצד. כפילות אינן נכללות באמצעות גובה פיזור קדימה ורוחב ורוחב פיזור צד גובה ורוחב.הכפילים הם התאים בעלי ערכי רוחב גבוה. בתוך התאים הבודדים, התאים החיים מזוהים כאוכלוסייה שלילית פרופידיום יודיד. בתוך התאים היחידים החיים, CD45 תאים נמוכים עד שליליים מזוהים בהתבסס על פקד האיום.בתוך CD45 תאים שליליים נמוכים, התאים החיוביים EpCAM כי הם גם חיובי eGFP בערוץ FITC הם האוכלוסייה של תאי מברשת. מספרי תאי המברשת משתנים על ידי חשיפה למטבוליטים מיקרוביאליים ופרוטוזואה ולכן משקפים את השונות של המיקרוביוטה המוסדית. לכן, אנו ממליצים להעריך את מספר תאי המברשת על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית כדי לאמוד את המספר הצפוי של תאי מברשת מבודדים על ידי מיון ציטומטרי זרימה.הקפד להפריד כראוי את שכבת האפיתל של קנה הנשימה כפי שהוא קובע את התשואות של תאי מברשת מבודדים. ניתן להשתמש בתאי מברשת קנה הדרך המבודדים במגוון רחב של בדיקות כגון רצף RNA, תרבות תאים וניתוח פונקציונלי.

isolation-quantitative-evaluation-brush-cells-from-mouse

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

תאים אפיתל ריאתי יכול להיות מבודד דרכי הנשימה של עכברים תרבותי בממשק אוויר נוזלי כמודל של אפיתל הנשימה מובחן. פרוטוקול מתואר לבידוד, culturing וחשיפת תאים אלה לעשן סיגריות המיינסטרים, כדי ללמוד התגובות מולקולרית רעלן זה סביבתיים.

בידוד של תאים אפיתל עכבר הנשימה וחשיפה לעשן סיגריות בבית ניסויית ממשק האוויר נוזלי

הכנה מטוהרים של ריאות תאים דנדריטים עכבר מתואר. דגש ספציפי ניתנת הבידוד של תת קונבנציונאלי תאים דנדריטים.

בידוד של ריאות תאים דנדריטים עכבר

העכברים הטרנסגניים להיות שימושי מאוד ייחוס תפקיד פיזיולוגי ל הגנים. כמו מחקר, כגון בכלל, מחקרים תפקודיות של דרכי הנשימה, במיוחד, עברו שינוי מדהים לכיוון מודלים Murine. כאן אנו מספקים...

במדידות חוץ גופית של היצרות קנה הנשימה באמצעות עכברים

כאן אנו מראים הפרוטוקול שלנו לבידוד של תאי צינור בלוטה הבזליים וקנה נשימת submucosal מעכבר. גם אנחנו מדגימים את השיטה של ​​הזרקת תאי גזע לכרית השומן הגבה עכבר כדי...

בידוד של תאי בסיס ותאי בלוטת Duct Submucosal מעכבר קנה נשימה

אנו מתארים את הבידוד המהיר של תאים ראשוניים Murine סוג II (אפיתל מכתשיים AECII) על ידי סלקציה שלילית זרימת cytometric. AECII אלה להראות כדאיות וטוהר גבוה ומתאימים למגוון רחב של מחקרים מולקולריים פונקציונליים ובנוגע לתפקידם בתנאי נשימה כגון מחלות אוטואימוניות או זיהומיות.

בידוד Cytometric זרימה של תאים ראשוניים Murine Type II alveolar אפיתל ללימודים פונקציונליים ומולקולריים

טכניקה קלה ואמינה המאפשרים הדמיה וכימות תנועתיות ריסי דרכי הנשימה וזרימת ריסים נוצר באמצעות עכבר קנה הנשימה מתוארת. יכולה להיות שונה בטכניקה זו כדי לקבוע כיצד מגוון רחב של גורמים המשפיע על תנועתיות ריסים, כולל סוכנים תרופתיים, גורמים גנטיים, חשיפות סביבתיות, ו / או גורמים מכאניים כגון עומס ריר.

שיטת vivo לשעבר להדמיה ברזולוציה גבוהה של תנועתיות צילה במכרסמי Airway epithelia

התגובה החיסונית המארחת לזיהום הפתוגן היא תהליך מוסדר היטב. ניצול מודל חשיפת ריאות lipopolysaccharide בעכברים, ניתן לבצע הערכות ברזולוציה גבוהה של המנגנונים המורכבים הקשורים להיווצרות מחלה.

הניצול של לוע התחתון Intratracheal PAMP מנהל ושטיפה ברונכואלוואולרית כדי להעריך את תגובת מארח חיסון של עכברים

היצרות לרינגוקנה התוצאות מתוך התצהיר צלקת פתולוגית כי באופן ביקורתי מצמצמת את דרכי הנשימה הקנה וחסר טיפולים רפואיים יעילים. באמצעות PLLA-PCL (70% פולי-L-lactide ו-30% pvc) סטנט כמערכת שילוח סמים מקומי, טיפולים פוטנציאליים המיועדים להפחתת התפשטות הצלקת בקנה הנשימה ניתן ללמוד.

עיצוב של משחררי ביוטינג לסמים ביולוגיים בעכברים עם היצרות לרינגוקנה

במאמר זה אנו מתארים מודל במבחנה לבידוד והתמיינות של תאי אפיתל בדרכי הנשימה, תוך התמקדות בהתאקלמותם לתמצית עשן סיגריות כרונית (CSE). ניתן להשתמש במודל כדי לאפיין באופן מקיף את ההשפעה הרב-אומית של CSE, מה שעשוי לספק תובנות לגבי התגובות התאיות תחת חשיפה כרונית לעשן.

מודל In Vitro לחקר התמיינות ושינויים של מולטי-אומיקה בתאי אפיתל של דרכי הנשימה של מורין המגורות באמצעות תמצית עשן סיגריות

כאן, אנו מתארים את מדידת השיעול באמצעות מערכת פלטיסמוגרפיה לא פולשנית ובזמן אמת של כל הגוף (WBP) ואת ההליכים הנורמטיביים לקצירת דגימות רקמה של עכברים ומציגים כמה שיטות להערכת דלקת בדרכי הנשימה.

שיטות לאיתור שיעול ודלקת בדרכי הנשימה בעכברים

פרוטוקול זה מתאר שיטה לכימות ייצור תחמוצת החנקן (NO) בתרביות אפיתל בדרכי האוויר המובחנות בממשק אוויר-נוזל (ALI) על ידי מדידת ניטריט בהפרשות אפיקליות באמצעות בדיקת כימילומינציה מבוססת טריודיד.

מדידת ייצור תחמוצת חנקן בתרביות תאי אפיתל של קנה הנשימה בעכברים הממוינים בממשק נוזל האוויר

למד שיטה לבידוד תאי מברשת מקנה הנשימה בעכבר באמצעות פפאין ודיספאז לשמירת חיות התאים. הטכניקה מאפשרת ניתוח תעתיקי RNA ומחקר ביולוגיית דרכי הנשימה העליונות.

בידוד והערכה כמותית של תאי המברשת מקנה הנשימה של העכבר

גלה סרטונים נוספים