RNA מלאכותי פולימראז השני מכלולי התארכות לניתוח אירועים בעיבוד RNA

כאן, הקמנו מערכת ניסיונית פשוטה המאפשרת התחדשות של מתחמי התארכות פעילים של Pol II המתאימים לחקירת הצימוד הפונקציונלי של שעתוק Pol II וכיפה של RNA. בשיטה זו, ניתן להרכיב בקלות קומפלקסים של התארכות פונקציונלית עם כמה רכיבים. מתחמי התארכות משותקים על חרוזים מגנטיים, כך שקל לשנות את תנאי התגובה.

כדי לשתק אוליגו DNA המכיל ביוטין על חרוזים מגנטיים, תחילה להוסיף 200 microliters של חרוזים מגנטיים לצינור חלבון נמוך מחייב 1.5 מיליליטר, ולאחר מכן למקם את הצינור על מתלה מגנטי במשך שתי דקות. בזמן שהצינור נמצא על המדף המגנטי, השתמש בפיגט כדי להסיר את הנוזל מהצינור מבלי להפריע לחטוזים. כדי לשטוף את חרוזים, להסיר את הצינור מן המדף, ולהוסיף מיליליטר אחד של חיץ לשטוף המכיל טריס הידרוכלוריד, EDTA, ונתרן כלורי.

תחזיר את הצינור למדף. לאחר שתי דקות, להסיר את פתרון לשטוף, ולחזור על לשטוף פעמיים נוספות באמצעות 200 microliters של אותו חיץ. תן שימוש חוזר ב חרוזים מגנטיים ב-400 מיקרוליטרים של חיץ 2X.

לאחר מכן, להוסיף 380 microliters של מים ו 20 microliters של 10 מיקרומולרים שאינם תבנית אוליגו DNA biotinylated לערבב. מניחים את הצינור על מטור, ואת הדגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, לשטוף את חרוזים עם אוליגו DNA משותק שאינו תבנית שלוש פעמים באמצעות 200 microliters של חיץ ולאחר מכן שלוש פעמים עם 200 microliters של מאגר אחסון ודילול.

לאחסן את הצינור בארבע מעלות צלזיוס לילה כדי לסיים את חסימת חרוזים עם BSA. למחרת, להשליך את הפתרון, להשתמש שוב את חרוזים 200 microliters של אחסון חיץ דילול, כדי להגיע לריכוז DNA משוער של חמישה micromolar, ולאחר מכן להעביר את הפתרון עם חרוזים לצינור חדש. כדי להשיג את דופלקס הדנ"א-RNA, הכינו תערובת חישול של 10 מיקרוליטר בצינור PCR עם יחס טוחן RNA-DNA של שניים לאחד, כמתואר בפרוטוקול הכתוב.

מניחים את הצינור באופניים תרמיים. הגדר את התוכנית ל 45 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות, ואחריו 12 מחזורים של שתי דקות כל אחד, החל 43 מעלות צלזיוס והפחתת הטמפרטורה על ידי שתי מעלות צלזיוס למחזור. לבסוף, לשמור אותו סרק בארבע מעלות צלזיוס.

כדי לטעון פולימראז RNA מטוהר II על היברידית DNA-RNA, לערבב מיקרוליטר אחד של דופלקס DNA-RNA עם 13 microliters של מאגר פולימראז II מוכן טרי בצינור. מוסיפים מיקרוליטר אחד של פולימראז RNA מטוהר II, ומערבבים על ידי צינורות בעדינות למעלה ולמטה ומערבבים עם קצה פיפטה, מבלי להציג בועות. דגירה הצינור במשך 10 דקות ב 30 מעלות צלזיוס.

כדי להשלים את קומפלקס התארכות, להוסיף מיקרוליטר אחד של בחנורי אוליגו DNA משותקים שאינם תבנית ל 14 microliters של מאגר DNA שאינו תבנית, להוסיף את תערובת 15 מיקרוליטר לצינור הדגירה בעבר, ולהדגיר אותו עוד 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. מניחים את הדגימה על המדף המגנטי במשך שתי דקות. לשטוף את המדגם פעם אחת עם 30 microliters של חיץ לשטוף כדי להסיר פולימראז לא מאוגד II ו אוליגוס.

כדי radiolabel מתחמי התארכות עם RNA 23mers, להוסיף מיקרוליטר אחד של ATP ומיקרוליטר אחד של radiolabeled UTP ל 23 microliters של חיץ הדופק, ולהוסיף תערובת זו חרוזים מגנטיים שטף כדי resuspend. הדגירה את התגובה במשך 10 דקות כדי לאפשר את הסינתזה של radiolabeled 23mers. הוסף 1.5 מיקרוליטרים של פתרון המכיל ATP 100 מיקרומולרי ו 100 מיקרומולרי UTP לערבב 3.5 microliters של מאגר מרדף, ולהוסיף את התערובת לצינור המכיל מתחמי התארכות מורכבים מראש על חרוזים.

שוב, דגירה הצינור במשך חמש דקות לרדוף אחרי כל התמלילים המתהווים לתוך 23mers. לאחר מכן, מניחים את הצינור על המדף המגנטי, ולשטוף כפי שנעשה בעבר כדי להסיר נוקלאוטידים מאוגדים. תן שימוש חוזר בדגימה ב-30 מיקרוליטרים של חיץ כביסה.

כדי ליצור מתחמי התארכות עם תעתיקים ארוכים יותר, בצע את ההליכים הקודמים, והגדל פי ארבעה כדי ליצור 120 מיקרוליטרים של מתחמי התארכות שטופים לארבע תגובות. תווית שלוש צינורות חדשים 23mer, 25mer, ו 29mer. מעבירים 30 מיקרוליטרים של מתחמי התארכות שטופים לצינור 23mer, ומוסיפים 94 מיקרוליטרים של תערובת עצירה המכילה פרוטאינאז K וגליקוגן.

מניחים את הצינור המכיל את 90 microliters הנותרים של מתחמי התארכות שטף על המדף המגנטי במשך שתי דקות, להסיר את supernatant, ו resuspend חרוזים 90 microliters של BTB בתוספת 1.2 microliters של ATP ו CTP. דגירה במשך 10 דקות ב 30 מעלות צלזיוס. לאחר שטיפה עם 90 microliters של חיץ לשטוף, להעביר 30 microliters של מתחמי התארכות לצינור 25mer, ולהוסיף 94 microliters של תערובת להפסיק המכיל proteinase K וגליקוגן.

שוב, מניחים את הצינור המכיל את 60 microliters הנותרים של מתחמי התארכות על המדף המגנטי במשך שתי דקות. חזור על הטיפול BTB עם 60 microliters של חיץ בתוספת 0.8 microliters של ATP ו CTP. לאחר הדגירה והכביסה כפי שנעשה בעבר, יש להשתמש מחדש בדגימה ב-60 מיקרוליטרים של חיץ כביסה.

מעבירים 30 מיקרוליטרים מהדגימה לצינור 29mer, ומוסיפים 94 מיקרוליטרים של תערובת עצירה המכילה פרוטאינאז K וגליקוגן. לנתח מוצרי תגובה על ג'ל פוליאקרילמיד denaturing. ראשית, ליצור מתחמי התארכות שטף המכיל 23mers על ידי קנה מידה של 13 פי ההליך שתואר בעבר כדי להשיג 390 microliters עבור 12 תגובות ואחד נוסף.

כדי לבצע זרחון של פולימראז II CTD, להסיר את supernatant לאחר הצבת המדגם בארון מגנטי, ו resuspend את חרוזים ב 377 microliters של BTB. תווית שני צינורות חדשים בתוספת H ומינוס H.To בתוספת H, להוסיף שלושה microliters של גורם אתחול שעתוק TFIIH בריכוז של 300 ננוגרם למיקרוליטר, כדי מינוס H, להוסיף תשעה microliters של מאגר אחסון ודילול. הוסיפו 87 מיקרוליטרים של מתחמי התארכות שטופים לצינור הפלוס H ו-261 מיקרוליטרים לצינור מינוס H.

דגירה הצינורות במשך 10 דקות, ולשטוף עם חיץ לשטוף. כדי לבצע מכסה RNA, להוסיף 87 microliters של תערובת capping לצינור בתוספת H ו 261 microliters לצינור מינוס H כדי resuspend. סמן ארבעה צינורות חדשים, חמישה פלוס H, חמישה מינוס H, 15 מינוס H, ו 45 מינוס H, ולוותר על שלושה microliters של חמישה, 15, או 45 ננוגרם לכל אנזים microliter capping לתוך הצינורות המתאימים.

לאחר מכן, הכינו 12 צינורות חדשים עם 94 מיקרוליטרים של חיץ עצירה. התחל את תגובת המכסה הראשונה על ידי הוספת 87 microliters של קומפלקס התארכות שטופלו TFIIH לצינור שכותרתו חמש בתוספת H.Incubate ב 30 מעלות צלזיוס בבלוק חום. יש לתזמן במדויק את תגובות המכסה באמצעות סטופר.

בעת עבודה עם תגובות מרובות, זמני ההתחלה של כל תגובה צריכים להיות מזעזעים. לאחר אחת, שתיים או ארבע דקות, להעביר 30 microliters של חמש בתוספת תערובת התגובה צינורות שכותרתו אחד, שתיים, ושלושה המכילים 94 microliters של חיץ עצירה כדי לעצור את התגובות. המשך עם התגובות capping עבור הדגימות בצינורות מינוס H הנותרים בדיוק באותו אופן, באמצעות מתחמי התארכות שטופלו ללא TFIIH.

לנתח מוצרי תגובה על ג'ל פוליאקרילמיד denaturing. תרשים מוצג כאן עבור מולקולות DNA ו- RNA במתחמים התארכות מלאכותית. באמצעות אוליגו RNA סינתטי של 20 נוקלאוטידים כמו פריימר RNA במהלך ההרכבה של מתחמי התארכות מלאכותית, נוקלאוטידים נוספו במהלך כל צעד הליכה רציפה של הפרוטוקול כדי ליצור 23mer, 25mer, ו 29mer.

תגובות באמצעות RNA פולימראז II ממקורות שונים הושוו. מתחמי התארכות מלאכותיים הורכבו עם פולימראז II אנדוגני, מסוג פראי, מטוהרים מכבד עכברוש או משמרי ביקוע והלכו לייצר 23מרים או 25מרים. בוצעה התדהמה למדידת תעתיקים עם תעתיקים הקשורים למתחמים מלאכותיים של התארכות המכילים 23 תעתיקי נוקלאוטיד עם קצה טריפוספט של חמישה ראשים.

שני הנתיבים האחרונים מראים את המוצרים של תגובות שבהן מתחמי התארכות היו דגירה עם או בלי כובע אנזים בנוכחות TFIIH. הלהקות הנודדות לאט יותר ויותר במהירות מכילות תעתיקים מכוסים ולא מנוצלים, בהתאמה. 12 הנתיבים הראשונים מראים תעתיקים הקשורים למתחמים מוארכים עם CTD זרחני או לא פוסורי.

פעילויות של פולימראז II ואנזימים אחרים עשויות להשתנות מהכנה להכנה, ולכן יש צורך לייעל את תנאי התגובה על ידי טיטרטינג ריכוזי אנזימים כדי להגדיר רמות אופטימליות. חשוב להשתמש בחומר רדיואקטיבי בבטחה ולהימנע מזיהום. אנא הקפד לעקוב אחר הנחיות המעבדה והמכון שלך בעת ביצוע ניסויים עם רדיואקטיביות.