Name: Culturing ומדידת עוברי והיילוד מורנה עצמות ארוכות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 58 s
Description: למד שיטת תרבית ex vivo לעצמות ארוכות בעכברים עובריים ונולדים לניתוח פיתוח עצם וסחוס. טכניקה זו מאפשרת הדמיה חיה ומניפולציה ישירה של גידול עצם בהפרדה מהשפעות מערכתיות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

היינו רוצים להודות אלכסנדרה ג'וינר על התמיכה שלה כאשר הפרוטוקול הזה היה להיות מבוסס, Edwina מקגלין ו-יי צ'נג צ'אנג עבור שיתוף חומצה retinoic. המכון האוסטרלי לרפואה רגנרטיבית נתמך על ידי מענקים מממשלת המדינה של ויקטוריה והממשלה האוסטרלית.

כל הניסויים צריכים להתבצע בעקבות ההנחיות המקומיות והמוסדיים של טיפול מוסרי בבעלי חיים מעבדתיים.
1. ההכנות לקראת יום התרבות העצם
<ol><li>להגדיר מתזמן העכבר מתוזמן כדי להשיג עוברים וגורים מהיום העובריים 14.5 (E 14.5) והלאה. הערה: התרבות של עצמות ארוכות ניתן להחיל בהצלחה על זנים שונים של העכבר; בפרוטוקול הנוכחי, נעשה שימוש בעכברים מסוג שוויצרי וובסטר פראי.</li>
	<li>להכין ניתוח בינוני (מותאם יוסטון et al.15): לדלל α-בינוני חיוני מינימלי (α-הגברת) או בינונית שונה של הנשר של מדיום (dmem) 1/13 ב פוספט-באגירה מלוחים (PBS) ו 2 מ"ג/mL סרום הפרה אלבומין (bsa) ומסנן לעקר דרך a 0.22 μm, 33 מזרק בקוטר מילימטר מסנן. החנות מובחנות ב-20 ° c.</li>
	<li>יום לפני החילוץ של העוברים, להכין את סרום ללא מדיום תרבות העצם מורכב DMEM המכיל 0.2% BSA, 0.5 mM L-גלוטמין, 40 U/mL פניצילין/סטרפטומיצין, 0.05 mg/mL חומצה אסקורבית, ו 1 מ"מ betaglycerophosphate. מסנן לעקר דרך 0.22 μm, 33 מ"מ מזרק בקוטר מסנן ולאחסן ב 4 ° צ' עבור עד 1 חודש.</li>
	<li>ביום של התרבות ולפני ליקוט העכבר, להכין צלחות 24-לוחות ו 60 mm מנות עם מדיום לחיתוך ולשמור על קרח קר. חמם מראש את מדיום תרבות העצם באמבט מים ב37 ° c. רסס 80% (v/v) אתנול על הכלים (מלקחיים ומספריים קטנים) שישמשו לטיפול בעובר. העבר טווח המשקפת לארון בטיחות של Class II.</li>
</ol>2. תרבות העובר ושוקה היילוד ועצם הירך
<ol><li>Cull את העכבר ההרה דרך פריקה צוואר הרחם בשלב ההריון הרצוי (החל E 23.4 ל-E 29.8). אם משתמשים בגורי היילוד, הוציאו אותם מהאמא אחד אחד ומעליו בעריפת ראש.</li>
	<li>מניחים את העכבר על גבה ולעקר את אזור הבטן על ידי ריסוס 80% (v/v) אתנול על פני השטח שלה.</li>
	<li>חותכים את העור ואת שריר הבטן עם מספריים קטנים כדי לגשת קרני הרחם.</li>
	<li>לחלץ את הרחם מחלל הבטן בעזרת מלקחיים ומספריים קטנים, הסרת meמהtrium וחיתוך בסיס הקרניים. מניחים את הרחם בצלחת פטרי 60 מ"מ עם מדיום לניתוח קר, ושומרים את קערת התרבות על הקרח במהלך ההליך כולו.</li>
	<li>העבר את צלחת פטרי עם הרחם אל הקבינט בטיחות ולעבוד שם מעתה והלאה.</li>
	<li>הפרד בין העוברים הבודדים במספריים באמצעות חיתוך בין השקי.</li>
	<li>העברת שק בודד תחת stereomicroscope לנתיחה בצלחת 60 mm נקי עם בינוני לחיתוך ולפתוח אותם עם מלקחיים כדי להפריד את העוברים מן הפלנטאס ולנקות אותם מן הקרומים. הערה: לעבוד עם עובר אחד בכל פעם, תוך שמירה על השאר על הקרח.</li>
	<li>לערוף את ראשו של העוברים ולהעביר את הגוף לצלחת חדשה ונקייה 60 mm עם 1 mL לחתוך פיפטה סטרילי.</li>
	<li>הסירו את עורם של העוברים או הגורים בעזרת מלקחיים שמתחילים מאחור ומתקלקים אותו עד לאצבעות הרגליים.</li>
	<li>הפרידו את הגפיים מהגוף על-ידי חיתוך עם הפינצטה הקרובה לעמוד השדרה והעברתם לתבשיל נקי עם מדיום לחיתוך קר-קרח.</li>
	<li>מציגים אותם בזהירות בין הסחוס. של עצם הירך לבין שוקה האבובי</li>
	<li>הסירו את עצמות הירך מעצם הירך. ועצם העצמות והפיבולה משוקה</li>
	<li>הסירו בזהירות את הרקמה הרכה מעצם הירך והשוקה על ידי הקפדה ומשיכת העור. הערה: חשוב להסיר רקמות רכות הרבה ככל האפשר, נטילת טיפול מיוחד בהסרת הרקמה המחברת בין שני קטבים הסחוס, אבל הימנעות נזק הסחוס, perichondrium, ואת העצמות.</li>
	<li>מניחים את ארבעת העצמות (הטיה ושמאל הימנית והפדורים) בבאר הראשונה של הצלחת 24-הטוב עם מפלסטיק 1 mL סטרילי הצינורות. לחילופין, כדי להשוות את ההשפעה של טיפולים שונים על גפיים שמאל וימין, המקום גפיים שונים בבארות שונות. הערה: יש לנקוט טיפול נוסף כאשר העצמות מועברות לבארות, שכן הן יכולות להיצמד בקלות לפיפטה.</li>
	<li>המשיכו באותה דרך עם. כמה שיותר עוברים שצריך הערה: שינוי המנה עם מדיום החיתוך ברגע שהוא נעשה מעורפל מדי, כפי שחשוב לראות בבירור את העצמות שבגזור.</li>
	<li>
כאשר כל העצמות הרצויות מועברים לבארות, להסיר את בינוני הניתוח עם פלסטיק 1 mL סטרילי צנרת ולקחת טיפול נוסף לא לבשל את העצמות.
	<ol>
<li>בהתאם למטרת הניסוי, ניתן לקחת את התמונות של העצמות לפני הסרת מדיום החיתוך, כאשר נקודת הזמן אפס של הניסוי. צלם תמונות עם מיקרוסקופ המחובר למצלמה דיגיטלית והביאור את החשיפה ואת קנה המידה המשמש. כדי להבטיח מדידות קלות ואמינות, צלם תמונות בניגוד טוב כדי להבדיל בין החלק המינרלי.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הוסיפו 1 מ ל של התרבות הבינונית לכל באר. אם כל טיפול מיועד על העצמות (דוקסיציקלין, טממוקסיפן, גורמי גדילה, וכו '), יש להוסיף אותו עכשיו.</li>
	<li>כדי לצפות את ההשפעה של עיכוב הצמיחה בתנאי התרבות, לטפל tibias שמאל עם חומצה retinoic (RA, 500 nM), תוך הדגירה tibias הזכות עם נפח המקבילה של הרכב (diמתיל סולפוקסיד [DMSO], ריכוז סופי 0.1%) כפקד.</li>
	<li>השאירו את העצמות לצמוח למשך יומיים או יותר בחממה לתרבות התא תחת תנאי תרבות תא סטנדרטיים (ב 37 ° c בחממה 5% CO2 ).</li>
	<li>להערכת התפשטות, להוסיף 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) או 5-bromo-2'-deoxyuridine (Bromo) למדיום בריכוז הסופי של 10 μM 1 על 2 לפני קיבוע. הערה: ריכוז המניה של אדו הוא 20 מ"מ. זהירות: EdU ו brdu הם מקבילים תימידין והוא יכול להיות רעיל מוטאנמית.</li>
	<li>הפשרת 4% פאראפורמלדהיד (בכיוון השדרה) ותקן את העצמות על ידי שקיעה בתוך הכדורגלן ביחידה 2 מ ל. זהירות: החצי ההוא רעיל ומיועד. לסבירות מסרטן אנושי הימנע לנשום אבקת פאראפורמלדהיד ואדים. EdU ו brdu הם מקבילים תימידין והוא יכול להיות רעיל מוטאנמית.</li>
	<li>לאחר קיבעון קצר של 10 דקות בתוך השדרה בטמפרטורת החדר, העברת עצמות ל-PBS עבור רכישת תמונה בזמן הסופי. לאחר מכן הציבו את העצמות בחזרה לתוך הכיוון ההפוך של הלילה ב -4 ° c.</li>
	<li>לאחר עצמות קיבוע ניתן לעבד עבור יישומים הרצוי במורד הזרם.</li>
</ol>3. מדידה וניתוח של אורך מלא של העצם ושל האזור המינרלי
<ol><li>השתמש בתוכנה לעריכת תמונות כדי למדוד את אורך העצמות, תוך התחשבות בקנה המידה של התמונה. למדוד את האורך הכולל של העצם ואת האזור מינרליזציה. הפעל את המידות מהתאים הכהים הראשונים בקצה אחד עד שאלה האחרונים שבקצה השני. הערה: האזור מינרליזציה מאופיין בצבע כהה והוא נבדל בקלות מן הסחוס.</li>
	<li>כדי לחשב את קצב הצמיחה, המוגדר כגידול ממוצע באורך ליום, חלק את ההפרש בין האורך הסופי של העצם לבין הראשון במספר הימים בתרבות.</li>
</ol>

<ol><li>Long, F., Ornitz, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+endochondral+skeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Development of the endochondral skeleton.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (1), a008334(2013).</li>
<li>Mackie, E. J., Ahmed, Y. A., Tatarczuch, L., Chen, K. S., Mirams, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endochondral+ossification%3A+how+cartilage+is+converted+into+bone+in+the+developing+skeleton%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Biochemistry+%26+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Endochondral ossification: how cartilage is converted into bone in the developing skeleton.</a> The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 40 (1), 46-62 (2008).</li>
<li>Goldring, M. B., Tsuchimochi, K., Ijiri, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+control+of+chondrogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The control of chondrogenesis.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 97 (1), 33-44 (2006).</li>
<li>Kronenberg, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+regulation+of+the+growth+plate%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Developmental regulation of the growth plate.</a> Nature. 423 (6937), 332-336 (2003).</li>
<li>Mackie, E. J., Tatarczuch, L., Mirams, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+skeleton%3A+a+multi-functional+complex+organ%3A+the+growth+plate+chondrocyte+and+endochondral+ossification%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">The skeleton: a multi-functional complex organ: the growth plate chondrocyte and endochondral ossification.</a> The Journal of Endocrinology. 211 (2), 109-121 (2011).</li>
<li>Maes, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoblast+precursors%2C+but+not+mature+osteoblasts%2C+move+into+developing+and+fractured+bones+along+with+invading+blood+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Osteoblast precursors, but not mature osteoblasts, move into developing and fractured bones along with invading blood vessels.</a> Developmental Cell. 19 (2), 329-344 (2010).</li>
<li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+pathways+to+endochondral+osteoblasts%3A+a+novel+chondrocyte-derived+osteoprogenitor+cell+identified+in+hypertrophic+cartilage%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">Dual pathways to endochondral osteoblasts: a novel chondrocyte-derived osteoprogenitor cell identified in hypertrophic cartilage.</a> Biology Open. 4 (5), 608-621 (2015).</li>
<li>Yang, L., Tsang, K. Y., Tang, H. C., Chan, D., Cheah, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypertrophic+chondrocytes+can+become+osteoblasts+and+osteocytes+in+endochondral+bone+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Hypertrophic chondrocytes can become osteoblasts and osteocytes in endochondral bone formation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (33), 12097-12102 (2014).</li>
<li>Zhou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chondrocytes+transdifferentiate+into+osteoblasts+in+endochondral+bone+during+development%2C+postnatal+growth+and+fracture+healing+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Chondrocytes transdifferentiate into osteoblasts in endochondral bone during development, postnatal growth and fracture healing in mice.</a> PLoS Genetics. 10 (12), e1004820(2014).</li>
<li>Wilsman, N. J., Bernardini, E. S., Leiferman, E., Noonan, K., Farnum, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age+and+pattern+of+the+onset+of+differential+growth+among+growth+plates+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopaedic+Research%3A+Official+Publication+of+the+Orthopaedic+Research+Society%22%5BJournal%5D)">Age and pattern of the onset of differential growth among growth plates in rats.</a> Journal of Orthopaedic Research: Official Publication of the Orthopaedic Research Society. 26 (11), 1457-1465 (2008).</li>
<li>Cooper, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+phases+of+chondrocyte+enlargement+underlie+differences+in+skeletal+proportions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Multiple phases of chondrocyte enlargement underlie differences in skeletal proportions.</a> Nature. 495 (7441), 375-378 (2013).</li>
<li>Smith, E. L., Rashidi, H., Kanczler, J. M., Shakesheff, K. M., Oreffo, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+1alpha%2C+25-dihydroxyvitamin+D3+and+transforming+growth+factor-beta3+on+bone+development+in+an+ex+vivo+organotypic+culture+system+of+embryonic+chick+femora%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">The effects of 1alpha, 25-dihydroxyvitamin D3 and transforming growth factor-beta3 on bone development in an ex vivo organotypic culture system of embryonic chick femora.</a> PloS One. 10 (4), e0121653(2015).</li>
<li>Li, Y., Li, A., Junge, J., Bronner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Planar+cell+polarity+signaling+coordinates+oriented+cell+division+and+cell+rearrangement+in+clonally+expanding+growth+plate+cartilage%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Planar cell polarity signaling coordinates oriented cell division and cell rearrangement in clonally expanding growth plate cartilage.</a> eLife. 6, (2017).</li>
<li>Kanczler, J. M., Smith, E. L., Roberts, C. A., Oreffo, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+approach+for+studying+the+temporal+modulation+of+embryonic+skeletal+development+using+organotypic+bone+cultures+and+microcomputed+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering.+Part+C%2C+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel approach for studying the temporal modulation of embryonic skeletal development using organotypic bone cultures and microcomputed tomography.</a> Tissue Engineering. Part C, Methods. 18 (10), 747-760 (2012).</li>
<li>Houston, D. A., Staines, K. A., MacRae, V. E., Farquharson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+Murine+Embryonic+Metatarsals%3A+A+Physiological+Model+of+Endochondral+Ossification%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Culture of Murine Embryonic Metatarsals: A Physiological Model of Endochondral Ossification.</a> Journal of Visualized Experiments. (118), (2016).</li>
<li>Abubakar, A. A., Noordin, M. M., Azmi, T. I., Kaka, U., Loqman, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+rats+and+mice+as+animal+models+in+ex+vivo+bone+growth+and+development+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Bone+%26+Joint+Research%22%5BJournal%5D)">The use of rats and mice as animal models in ex vivo bone growth and development studies.</a> Bone & Joint Research. 5 (12), 610-618 (2016).</li>
<li>Lui, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+aging+of+growth+plate+cartilage+underlies+differences+in+bone+length+and+thus+helps+determine+skeletal+proportions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Differential aging of growth plate cartilage underlies differences in bone length and thus helps determine skeletal proportions.</a> PLoS Biology. 16 (7), e2005263(2018).</li>
<li>Agoston, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C-type+natriuretic+peptide+regulates+endochondral+bone+growth+through+p38+MAP+kinase-dependent+and+-independent+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">C-type natriuretic peptide regulates endochondral bone growth through p38 MAP kinase-dependent and -independent pathways.</a> BMC Developmental Biology. 7, 18(2007).</li>
<li>Rosello-Diez, A., Madisen, L., Bastide, S., Zeng, H., Joyner, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-nonautonomous+local+and+systemic+responses+to+cell+arrest+enable+long-bone+catch-up+growth+in+developing+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell-nonautonomous local and systemic responses to cell arrest enable long-bone catch-up growth in developing mice.</a> PLoS Biology. 16 (6), e2005086(2018).</li>
<li>Marino, S., Staines, K. A., Brown, G., Howard-Jones, R. A., Adamczyk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models+of+ex+vivo+explant+cultures%3A+applications+in+bone+research%5BTitle%5D)+AND+%22BoneKEy+Reports%22%5BJournal%5D)">Models of ex vivo explant cultures: applications in bone research.</a> BoneKEy Reports. 5, 818(2016).</li>
<li>Okubo, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolonged+bioluminescence+monitoring+in+mouse+ex+vivo+bone+culture+revealed+persistent+circadian+rhythms+in+articular+cartilages+and+growth+plates%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Prolonged bioluminescence monitoring in mouse ex vivo bone culture revealed persistent circadian rhythms in articular cartilages and growth plates.</a> PloS One. 8 (11), e78306(2013).</li>
<li>Hirota, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+analysis+of+the+growth+plate+in+a+murine+long+bone+explanted+culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Live imaging analysis of the growth plate in a murine long bone explanted culture system.</a> Scientific Reports. 8 (1), 10332(2018).</li>
<li>Romereim, S. M., Conoan, N. H., Chen, B., Dudley, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dynamic+cell+adhesion+surface+regulates+tissue+architecture+in+growth+plate+cartilage%5BTitle%5D)+AND+%22Development+%28Cambridge%2C+England%29%22%5BJournal%5D)">A dynamic cell adhesion surface regulates tissue architecture in growth plate cartilage.</a> Development (Cambridge, England). 141 (10), 2085-2095 (2014).</li>
<li>Kaucka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oriented+clonal+cell+dynamics+enables+accurate+growth+and+shaping+of+vertebrate+cartilage%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Oriented clonal cell dynamics enables accurate growth and shaping of vertebrate cartilage.</a> eLife. 6, (2017).</li>
<li>Alvarez, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGFbeta2+mediates+the+effects+of+hedgehog+on+hypertrophic+differentiation+and+PTHrP+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Development+%28Cambridge%2C+England%29%22%5BJournal%5D)">TGFbeta2 mediates the effects of hedgehog on hypertrophic differentiation and PTHrP expression.</a> Development (Cambridge, England). 129 (8), 1913-1924 (2002).</li>
<li>De Luca, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid+is+a+potent+regulator+of+growth+plate+chondrogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid is a potent regulator of growth plate chondrogenesis.</a> Endocrinology. 141 (1), 346-353 (2000).</li>
<li>Stern, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isometric+Scaling+in+Developing+Long+Bones+Is+Achieved+by+an+Optimal+Epiphyseal+Growth+Balance%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Isometric Scaling in Developing Long Bones Is Achieved by an Optimal Epiphyseal Growth Balance.</a> PLoS Biology. 13 (8), e1002212(2015).</li>
<li>Minkin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+development+and+formation+of+osteoclast-like+cells+from+in+situ+progenitors+in+fetal+mouse+metatarsals+cultured+in+chemically+defined+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Bone+and+Mineral%22%5BJournal%5D)">Skeletal development and formation of osteoclast-like cells from in situ progenitors in fetal mouse metatarsals cultured in chemically defined medium.</a> Bone and Mineral. 12 (3), 141-155 (1991).</li>
<li>Erben, R. G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aErben%2C+RG+%22Handbook+of+histology+methods+for+bone+and+cartilage%22">Handbook of histology methods for bone and cartilage</a>. , Springer. 99-117 (2003).</li>
<li>Hu, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cartilage+to+bone+transformation+during+fracture+healing+is+coordinated+by+the+invading+vasculature+and+induction+of+the+core+pluripotency+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Development+%28Cambridge%2C+England%29%22%5BJournal%5D)">Cartilage to bone transformation during fracture healing is coordinated by the invading vasculature and induction of the core pluripotency genes.</a> Development (Cambridge, England). 144 (2), 221-234 (2017).</li>
<li>Fritton, S. P., McLeod, K. J., Rubin, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+the+strain+history+of+bone%3A+spatial+uniformity+and+self-similarity+of+low-magnitude+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanics%22%5BJournal%5D)">Quantifying the strain history of bone: spatial uniformity and self-similarity of low-magnitude strains.</a> Journal of Biomechanics. 33 (3), 317-325 (2000).</li>
<li>Duncan, R. L., Turner, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanotransduction+and+the+functional+response+of+bone+to+mechanical+strain%5BTitle%5D)+AND+%22Calcified+Tissue+International%22%5BJournal%5D)">Mechanotransduction and the functional response of bone to mechanical strain.</a> Calcified Tissue International. 57 (5), 344-358 (1995).</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

שיטות התרבות vivo העצם שימשו זמן מה כדי להעריך את הביולוגיה של צמיחת העצם28, אבל כבר לעתים רחוקות להחיל את העצמות הארוכות murine. עם התפתחות של טכניקות דימות, תרבות העצם vivo ex מציעה דרך אטרקטיבית לחקור את צמיחת העצם בזמן אמת בהגדרה הדומה היטב בתנאים vivo. בתרחיש זה, חשוב להגדיר את התנאים בהם הצמיחה של עצמות ארוכות דומה לצמיחה שלהם vivo.
במחקר הנוכחי, אנו מתארים פרוטוקול פשוט ובמחיר סביר עבור תרבות עצם ארוכה, התייחסות מגבלות ויישומים אפשריים. הצעד הקריטי ביותר בשיטה זו...

צמיחת איברים צריך להיות מכוון הדוק כדי למנוע את המראה של הפרעות גדילה, וכרוך בוויסות של סוגי תאים מרובים, מסלולים מולקולריים ומוצלב בין חלקים שונים של הגוף. טכניקות הדמיה חיוניים כדי לטפל בשינויים המתרחשים במשך הזמן בעובר הולך וגדל, הן בתנאים נורמליים, כמו גם לאחר המושרה הנגרמת במערכת. עוברים עם התפתחות תוך רחמי, כגון מודלים מכרסם בשימוש נרחב, להציג אתגר נוסף עבור הדמיה חיה וטיפול בסמים, אשר ניתן להתגבר חלקית על ידי שימוש בטכניקות לשעבר התרבות הvivo. כדי ללכוד בהצלחה את התהליכים הvivo ולהשיג תוצאות משמעותיות, זה הופך להיות חיוני כדי למצוא את התנאים הנכונים culturing עבור כל איבר או רקמה.
רוב העצמות של השלד היונקים לגדול דרך endochondral האוסיפיקציה, שם הסחוס העובריים (מורכב של תאים המכונים כונדרוציטים) כוננים האורך והוא מוחלף בהדרגה על ידי עצם. תהליך זה קורה בלוחות צמיחה, הממוקם בסוף העצמות הארוכות, שבו שלושה אזורים ניתן להבחין: נח, מתרבים, ו יפרטרופית1,2. ראשית, כונדרוציטים עגולות באזור מנוחה המעבר לתוך כונדרוציטים האופניים טורי באזור ההתרבות. בשלב הבא של בידול, כונדרוציטים אלה להפוך יפרטרופית ולהתחיל הפרשה סוג X קולגן. כונדרוציטים יפרטרופית לארגן את הצעדים הבאים של האוסיפיקציה: הם מפרישות מולקולות איתות מפתח, כגון גורם הצמיחה רקמת חיבור, עצם מורפולפרוטאין חלבונים ו קיפוד הודי, ולהפנות את המינרליזציה של המטריצה, לגייס כלי הדם לחלק המרכזי של העצם, ו, על אפופטוזיס, לאפשר אוסטאופתית (העצם להרכיב תאים) כדי לפלוש למטריקס כדי ליצור את מרכז האוסיפיקציה העיקרי3,4. מטריקס מינרליזציה מקלה על חדירת כלי הדם שדרכו האוסטאופה מחליפים את הסחוס היורד בעזרת מטריצת עצם5. האוסטאופתי ביותר לפלוש מטריצה הסחוס מן perichondrium, שכבה סיבי העוטפת את הסחוס6. לחילופין, שיעור של כונדרוציטים יפרטרופית מסוגלים לשרוד ולשנות את היכולת לעבור מעבר לעצמות7,8,9. האורך הסופי של העצם נובע הצמיחה המצטברת של הסחוס חולף, שיעור הצמיחה שלו בתורו תלוי במספר ובגודל של יפרטרופית כונדרוציטים, ואת ייצור המטריצה שלהם10. בנוסף, הוכח לאחרונה כי משך השלב האחרון של היפרפרס התואם לאורך הסופי של העצם11. לכן, רגולציה הדוקה של התפשטות והבידול של תאים אלה נדרש כדי להבטיח גודל העצם הנכון.
למרות הידע הניכר שנרכש לאורך השנים על הארגון והפיתוח של לוחות הצמיחה, מרבית המסקנות הללו מבוססות על התבוננות בסעיפים היסטלוגיים קבועים. שימוש ברקמות מספק מידע רב ערך אודות תהליך זה, אך ניתן לרכבו עם חפצים טכניים, כך שהוא לא יכול לשמש תמיד באופן אמין להערכת שינויים מורפולוגיים או בגודל בין שלבים שונים. בנוסף, כמו צמיחת העצם הוא תהליך דינמי, התמונות דו מימדי סטטי (2D) מציעים תובנה מוגבלת לתוך התנועה של התאים בצלחת הצמיחה, בעוד הדמיה הזמן לשגות על רקמה חיה יכול להציע מידע חשוב על ההתנהגות של כונדרוציטים בצלחת הצמיחה.
כל המגבלות הללו ניתן לפתרון פוטנציאלי באמצעות תרביות עצם vivo לשעבר. בעוד שפרוטוקולי תרבות העצם פותחו לפני זמן מה, הם הוחלו על עצמות ארוכות של מורטין. רוב המחקרים משתמשים בעצמות האפרוח בשל היתרונות הטכניים המוצעים על-ידי דגם האפרוח12,13. תרבויות אורגאוטימית (ממשק אוויר/נוזלים) הוחלו על מורים עובריים, שהיו מתוחזקים בתרבות במשך 10 ימים14. הכלים הגנטיים המתוחכמים הזמינים בעכבר להפוך את המודל הזה מאוד מושך לשמש לשעבר בתרבות העצם vivo. המחקרים שהשתמשו בעכברים כדי להסתכל על גדילה העצם עבד בעיקר עם עצמות המסרק15, כנראה בשל גודלם הקטן ומספרים גדולים יותר המתקבלים לעובר16. למרות שנחשב באופן מסורתי עצמות ארוכות, מטאטסי להיכנס הזדקנות (מאופיין התפשטות מופחתת אינוולוציה של צלחת הצמיחה17) מוקדם יותר מאשר עצמות ארוכות אחרות vivo, ולכן הצמיחה המתמשכת שלהם לשעבר vivo אינו ממש את התהליך הvivo. לצורך מאמר זה, נשתמש במונח עצמות ארוכות לעצמות מאזורי הגפיים האבובי והביניים. מספר מחקרים קודמים השתמשו בעצמות murine ארוך, כגון שוקה, בתרבויות vivo לשעבר נצפתה צמיחה משמעותית של הסחוס אבל מעט ההתקשות18. השתמשנו גם בתרבויות הבאליס לאחרונה, בעיקר כדי ללמוד כchondrocyte dynamics19. מחקרים אחרים השתמשו בראשי הירך מעכברים צעירים20 או רק את החלק המרוחק של עצם הירך לתרבות21. כמה יצירות אחרונות יותר בהצלחה לשלב את התרבות הvivo ex של עצמות מלאות עם הדמיה זמן ההדמיה כדי לרכוש תלת מימדי (3d) סרטים של כונדרוציטים ברקמת העכבר חי22,23. המחברים הצליחו להתבונן בעבר אירועים מבלי שיבחינו בסידור מחדש של כונדרוציטים לאזור מתרבים23 בדוגמה טובה של היישום הפוטנציאלי של תרבות vivo ex העצם. החלופה, כלומר, ניתוח תמונות סטטיות, דורשת טכניקות עקיפות ומורכבות. זה היה לידי ביטוי על ידי מחקר שנערך לאחרונה הערכת החשיבות של שיבוטים transversally לצמיחת הסחוס, שם מעקב גנטי עם זנים רבים העכבר העיתונאי בשילוב עם מידול מתמטי שימשו24. לכן, התרבות הvivo לשעבר עשוי לעזור להשיג תובנה תהליכים דינמיים בצורה מהירה וישירה יותר.
כאן, אנו מציגים שיטה לתרבות ארוכה של עצמות ממורין, אשר ניתן לשלב עם טיפולים מולקולריים שונים ו/או עם הדמיה בזמן ההדמיה החיה. פרוטוקול זה מתאים את השיטות המשמשות בדוחות קודמים15,18,25, אך מטפל בנושאים נוספים ומתמקד בעצמות ארוכות כגון השוקה, במקום בעצמות המסרק. לבסוף, הוא חוקר את הפוטנציאל של שימוש מבחינה סטטיסטית השוואות לזווג חזק על ידי culturing עצמות שמאל וימין בנפרד בנוכחות של חומרים שונים.

<table><tbody><tr><td>5-Ethynyl-2'-deoxyuridine</td><td>Santa Cruz</td><td>CAS 61135-33-9</td><td></td></tr><tr><td>5-Bromo-2&prime;-deoxyuridine</td><td>Sigma</td><td>B5002</td><td></td></tr><tr><td>50 מ"ל צינורות צנטריפוגה חרוטיים</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>60 מ"מ צלחת תרבית איברים מרכזית מטופלת TC, 20/חבילה, 500/מארז, בז סטרילי</td><td></td><td>353037-Adobe</td><td></td></tr><tr><td>Photoshop</td><td>Adobe</td><td>CS4</td><td></td></tr><tr><td>חומצה אסקורבית</td><td>Sigma</td><td>A92902</td><td></td></tr><tr><td>יחידת בסיס עבור ההיקף</td><td>Zeiss</td><td>435425-9100-000</td><td></td></tr><tr><td>בטאגליצרופוספט</td><td>Sigma</td><td>G9422</td><td></td></tr><tr><td>משקפת</td><td>Zeiss</td><td>STEMI-2000</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר אלבומין (BSA) חלק v</td><td>מצלמת Roche/Sigma</td><td>10735086001</td><td></td></tr><tr><td>DigiRetina 500</td> ערכת דיסקציה <td>Aunet</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Cumper Robbins</td><td>PFS00034</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11960044</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 2 מ"ל צינורות</td><td>Eppendorf</td><td>0030120094</td><td></td></tr><tr><td>אתנול 96%</td> <td>Merk</td><td>159010</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים Dumont #5 Inox08</td><td>Fine Science Tools</td><td>T05811</td><td></td></tr><tr><td>חממת Heracell 150 CO2</td><td>תרמו פישר</td><td>51026282</td><td></td></tr><tr><td>מינימום חיוני בינוני נשר</td><td>סיגמא</td><td>M2279</td><td></td></tr><tr><td>מולטיוול 24 באר</td><td>פלקון</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>פרפורמלדהיד</td><td>סיגמא</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין (10,000 יח'/מ"ל)</td><td>גיבקו</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>פיפטות פלסטיק 1 מ"ל סטרילי עטוף בנפרד</td> מסנן <td>מזרק תרמו</td><td>273</td><td></td></tr><tr><td>0.2 אום</td><td>מדעי החיים</td><td>PN4612</td><td></td></tr><tr><td>מזרק טרומו 20 מ"ל</td><td>Terumo</td><td>DVR-5174</td><td></td></tr><tr><td>טרטינואין (חומצה רטינואית)</td><td>Sigma</td><td>PHR1187-3X</td><td></td></tr><tr><td>היקף משולש</td><td>Aunet</td><td>AZS400T</td><td></td></tr></tbody></table>

culturing ומדידת עוברי והיילוד מורנה עצמות ארוכות

Culturing and Measuring Fetal and Newborn Murine Long Bones

עצמות ארוכות הן מבנים מורכבים ודינמיים, אשר נובעים endochondral אוסיפיקציה דרך הסחוס ביניים. הגישה המוגבלת לעצמות אנושיות בריאות הופכת ערך במיוחד לשימוש בדגמי היונקים, כגון עכבר ועכברוש, כדי לבדוק היבטים שונים של צמיחת העצם והומאוסטזיס. בנוסף, הפיתוח של כלים גנטיים מתוחכמים בעכברים מאפשר מחקרים מורכבים יותר של צמיחה עצם ארוך מבקש הרחבה של טכניקות המשמשות לחקר צמיחת העצם. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט עבור התרבות לשעבר vivo murine העצם, אשר מאפשר את המחקר של העצם ואת הסחוס באופן הדוק מבוקרת תוך לכידה של רוב בתהליך vivo. השיטה המתוארת מאפשרת את התרבות של מגוון העצמות, כולל עצמות השוקה, עצם הירך והמסרק, אך אנו מתמקדים בעיקר בתרבות הבאליס. כמו-כן, ניתן להשתמש בה בשילוב עם טכניקות אחרות, כגון הדמיה בזמן הדמייה חיה או טיפול תרופתי.

תרבות העצם ניתן לבצע החל משלבים שונים. באיור 1A-D, השוואה בין השוקה התרבותית והמחולצים הטריים בשלבים שווי-ערך מוצג. ההתבוננות הראשונה היא כי עד יומיים של תרבות הגודל הושג הוא המקבילה לצמיחה בעצם vivo עבור סחוס ועצם מינרליזציה (איור 1A, B, D). תקופות תרבות ארוכות יותר מובילות להבדלים גדולים יותר בין העצמות המתורבתות לבין המחולצים הטריים (איור 1C). בנוסף, כפי שהוזכר בפ...

כאן, אנו מציגים שיטה עבור תרבות vivo ex של עצמות murine ארוך בשלבים העוברי והיילוד, מתאים לניתוח העצם ופיתוח הסחוס הומאוסטזיס בתנאים מבוקרים תוך לכידה בתהליך vivo.

Culturing ומדידת עוברי והיילוד מורנה עצמות ארוכות

Long bones are complex and dynamic structures, which arise from endochondral ossification via a cartilage intermediate. The limited access to healthy ...

שיטה זו מתאימה את פרוטוקול התרבות המטא-טארסלית לעצמות גדולות יותר, ומאפשרת שילוב של מניפולציה ישירה בעצמות עם מודלים גנטיים מורכבים לטיפול בתהליכים הקשורים להתפתחות העצם. טכניקה זו מאפשרת מניפולציה וניתוח של צמיחת העצם כי אינם אפשריים ב vivo, כגון הדמיה חיה או מניפולציה פיזית ופרמקולוגית ישירה. שיטת תרבות אקס ויוו זו מאפשרת מחקר ספציפי של ההשפעות המקומיות של ההתפרצות הגנטית בעצם המפרידה אותה מההשפעה המערכתית שיש לטיפול על האורגניזם.התחל על ידי עיקור אזור הבטן של יום הריון בהריון 14.5 כדי 18.5 עכבר עם 80% אתנול ושימוש מספריים קטנים כדי לפתוח את העור ואת שרירי הבטן כדי לגשת קרני הרחם. כדי לחלץ את הרחם מחלל הבטן, להסיר את mesometrium לחתוך את הבסיס של הקרניים. לאחר מכן, מעבירים את הרחם לצלחת פטרי 60 מ"מ המכילה מדיום ניתוח קר כקרח על קרח.ב ארון biosafety לחתוך בין השקים עם מספריים כדי להפריד את העוברים בודדים, ולהעביר שק בודדים לתוך צלחת חדשה 60 מילימטר עם מדיום ניתוח טרי תחת מיקרוסקופ סטריאו ניתוח. השתמש פינצטה כדי להפריד את העוברים מן שליה כדי לנקות את העוברים מן הממברנות. השתמש פיפטה פלסטיק גזוז להעביר את הגוף לתוך צלחת חדשה 60 מילימטר, לערוף את העובר לפני ניתוח נוסף.לאחר מכן השתמש פינצטה כדי להסיר את העור, החל מאחור מתקלף אל בהונות. השתמש פינצטה לחתוך קרוב לעמוד השדרה ולהפריד את הג

culturing-and-measuring-fetal-and-newborn-murine-long-bones

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

פרוטוקול זה מתאר הליך לדגימה סדרתית של מח עצם הירך (BM) מבלי לדרוש הקרבה של עכברים. הליך זה מקל על מחקרי אורך של הרכב ה-BM של עכברים לאורך זמן ומספק גישה סדרתית לתאים בתוך ה-BM למחקרי ex vivo והשתלות.

הירך מח עצם שאיפה בעכברים חיים

כאן אנו מציגים פרוטוקול לדיסקציה של עצמות ארוכות של הגפיים האחוריות (עצם הירך והשוקה) מעכבר המעבדה. אנו מתארים עוד טכניקה מהירה לבידוד מח עצם מעצמות אלו המשתמשת בצנטריפוגה להסרת מח עצם מחלל מח העצם.

Murine הינד לימב ארוך עצם Dissection ובידוד מח העצם

אנו מציגים פרוטוקול לניתוח ותרבית עצמות מטטרסל עובריות של עכברים ביום 15 (E15). מודל ex vivo פיזיולוגי זה של התעצמות אנדוכונדרלית מספק תנאים קרובים יותר למצב in vivo מאשר תאים בתרבית חד-שכבתית או תלת מימדית והוא כלי חיוני לחקירת צמיחה והתפתחות עצם.

תרבות של Murine העוברי metatarsals: מודל פיסיולוגי של Endochondral התאבנות

כתב יד זה מתאר פרוטוקול כדי לנתק את ותרבות osteoclasts במבחנה ממח העצם העכבר, וכדי ללמוד את התפקיד של מטרת מידע יונקים/מכניסטית rapamycin 1 מורכבים במבנה אוסטאוקלסט.

מבוסס רנקל אוסטאוקלסט תרבות וזמינותו של העכבר מח העצם כדי לחקור את התפקיד של mTORC1 במבנה אוסטאוקלסט

במאמר זה, נציג שיטות כדי לבודד, להבדיל תאי סטרומה מח עצם של תאי גזע hematopoietic עצמות ארוכות העכבר. שני פרוטוקולים שונים מוצגים מניב אוכלוסיות תאים שונים עבור הרחבת ובידול לתוך תאי העצם, adipocytes ו osteoclasts.

בידוד, תרבות, התמיינות של תאי סטרומה מח עצם ו אוסטאוקלסט אבות של עכברים

התרבות vivo ex של explants העצם יכול להיות כלי רב ערך לחקר הפיזיולוגיה של העצם ואת הערכה פוטנציאלית של תרופות שיפוץ העצם ומחלות העצם. הפרוטוקול המוצג מתאר את ההכנה והתרבות של calvarias מבודדים מגולגלות העכברים היילוד, כמו גם את יישומיה.

שיפוץ עצם מדידה ויצירה משולבת של מיקרוסביבה של עצם הגידול באמצעות Calvaria Co-תרבות והימאנורמוטוריקה

הפרוטוקול הנוכחי מתאר את הפיתוח של פלטפורמת בדיקה לשחזור עבור צוואר הירך מורין במערך כיפוף cantilever. קווי עזר מודפסים תלת-ממדיים מותאמים אישית שימשו לתיקון עקבי וקשיח של עצמות הירך ביישור אופטימלי.

כיפוף הקנטילבר של צווארי הירך מורין

פרוטוקול זה מתאר שיטה לא אנזימטית ופשוטה לבידוד תאי מח עצם של עכבר יילודים בני 7-9 ימים ויצירת מקרופאגים ממוינים באמצעות סופרנאטנט של תאי L929 כמקור לגורם מגרה מושבת גרנולוציטים (M-CSF). המקרופאגים שמקורם במח עצם נותחו עוד יותר עבור אנטיגנים פני השטח F4/80, CD206, CD11b וכשירות תפקודית.

עכבר יילודים בידוד מח עצם והכנת מקרופאגים שמקורם במח עצם

פרוטוקול זה מתאר מודל עכבר משופר עבור פציעות לוחיות גדילה של עצם בגיל ההתבגרות. באמצעות עכברים טרנסגניים עם כתבים פלואורסצנטיים תלת-שושלותיים עבור סוגי קולגן I, II ו-X, המטריצות העיקריות הקשורות לשלוש תת-שכבות שונות של לוחית הגדילה, מיקום הפציעה מונחה על ידי פלואורסצנטיות טבעית מתחת למיקרוסקופ.

מודל מורין מהונדס טריקולור לחקר פגיעה בלוחיות גדילה

מודל הפגיעה במח העצם של העכברים הוא כלי שימושי לחקר אוסטאוגנזה לאחר לידה באמצעות התעצמות פנימית. פרוטוקול כירורגי פשוט זה מתאר את הליך אבלציה של מח העצם להערכה במורד הזרם של היווצרות עצם חדשה ותגובות תאיות לאחר פציעה.

מתודולוגיה משופרת לחקר אוסטאוגנזה לאחר לידה באמצעות אוסיפיקציה אינטרמברנית במודל פגיעה במח עצם של עכברים

למד שיטת תרבית ex vivo לעצמות ארוכות בעכברים עובריים ונולדים לניתוח פיתוח עצם וסחוס. טכניקה זו מאפשרת הדמיה חיה ומניפולציה ישירה של גידול עצם בהפרדה מהשפעות מערכתיות.

Culturing ומדידת עוברי והיילוד מורנה עצמות ארוכות

גלה סרטונים נוספים