ויזואליזציה של חלבון קינאז פעילות בראש-קבוע עכברים התנהגות באמצעות Vivo Two-פוטון מיקרוסקופ החיים הדמיה מיקרונטית

רלוונטיות תעשייתית למנהלים

ויזואליזציה של דינמיקת סיגנלינג תוך-תאי בבעלי חיים המפגינים התנהגות מגשרת על הפער שבין מנגנונים מולקולריים לבין פנוטיפים התנהגותיים, שלב קריטי בתיקוף מטרות (target validation) עבור גילוי תרופות למערכת העצבים המרכזית (CNS). שיטה זו מאפשרת ניטור בזמן אמת ברזולוציית תא בודד של פעילות PKA — נקודת התכנסות למסלולים נוירומודולטוריים מרובים — במהלך התנהגויות מוגדרות, ובכך מספקת הפחתת סיכונים מנגנונית עבור מטרות שמעלה סיגנלינג של cAMP. על ידי ביצוע קורלציה בין פעילות קינאז לבין לוקומוציה בעכברים מקובעי-ראש, הגישה תומכת בביטחון חיזוי לגבי מעורבות המטרה (target engagement) ומודולציה של המסלול, ובכך מסייעת בקבלת החלטות מוקדמות של go/no-go בתוכניות לפיתוח תרופות נוירופסיכיאטריות.

יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה

גילוי מוקדם ותיקוף מטרה

• ערך מדעי: בחינת השערות טיפוליות באמצעות ויזואליזציה של פעילות PKA כמדד (readout) לאיתות של GPCR נוירומודולטורי באוכלוסיות נוירונליות מוגדרות.
• ערך תפעולי: מאפשר תיקוף פונקציונלי של מטרות במעגלים עצביים שלמים במהלך התנהגות, ובכך מפחית עמימות מכניסטית בבחירת המטרה.
• ערך חיזוי: תומך בסינון ותעדוף (triage) של פורטפוליו על ידי קישור של מודולציה של המטרה לשינויים מדידים בפעילות קינאז במהלך מצבים התנהגותיים רלוונטיים.

סריקה ופיתוח בדיקה

• מוכנות הבדיקה: הכנת מערכות ביולוגיות שעברו תיקוף (נוירונים קורטיקליים המבטאים tAKARα) לסריקת תרכובות המשך נגד מטרות נוירומודולטוריות.
• פלט כמותי: מספק קריאות FLIM מבוססות FRET המאפשרות מדידה סטנדרטית וניתנת לשחזור של שינויים בפעילות PKA בתגובה להפרעות פרמקולוגיות.
• יכולת הרחבה: החלון הגולגולתי הכרוני וההכנה עם קיבוע הראש מאפשרים מפגשי דימות חוזרים, התומכים בהערכה אורכית של השפעות התרכובות על דינמיקת האיתות.

מחקר תרגומי ופרה-קליני

• רלוונטיות למחלה: רלוונטי לחקר הפרות בויסות של PKA במודלים של הפרעות נוירופסיכיאטריות שבהן הסיגנלינג הנוירומודולטורי פגום.
• המשכיות תרגומית: מגשר בין שלב התיקוף של המטרה (target validation) לבין בדיקות יעילות פרה-קליניות, באמצעות שמירה על קריאה עקבית של פעילות המסלול לאורך השלבים השונים.
• קידום מותאם סיכון: מאפשר הערכה מוקדמת של השאלה האם תרכובות מועמדות נקשרות למטרות ומודולטורים של סיגנלינג במורד המסלול (downstream) בבעלי חיים בעלי התנהגות, ובכך מסייע בבחירת מינון ובזיהוי ביומרקרים מבוססי-מנגנון.

שילוב תהליכי עבודה וקווי עיבוד

השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מבדיקת היפותזות למטרות, דרך זיהוי מובילים ועד לתיקוף פרה-קליני, ומספקת קריאה מכניסטית המנחה החלטות על התקדמות בכל שלב.

• ביולוגיה של הגילוי: תומכת בבדיקת השערות באמצעות ויזואליזציה של שינויים בפעילות PKA בתגובה לשחרור נוירומודולטורים או למניפולציה של רצפטורים במהלך התנהגות.
• סריקה: מאפשרת מוכנות של בדיקה להערכת השפעת תרכובות על סיגנלינג של cAMP/PKA ברשתות נוירונליות ברזולוציה תאית.
• אנליטיקה: מייצרת מדידות FRET כמותיות מבוססות FLIM המאפשרות השוואה של דינמיקת סיגנלינג בין תנאים, גנוטיפים או טיפולים שונים.
• מחקר תרגומי: מקשרת לעבודות פרה-קליניות על ידי אספקת קריאה תרגומית של מעורבות המסלול, שניתן לשחזר באסטרטגיות של ביומרקרים.
• שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמה ניתנת לשימוש חוזר לחקר מטרות נוירומודולטוריות מרובות המתכנסות על PKA, ישימה באזורי מוח ובפראדיגמות התנהגותיות שונות.

השפעה תפעולית וארגונית

• ערך מדעי: מספק ביטחון חיזוי במנגנון המטרה על ידי ויזואליזציה ישירה של פעילות קינאז כקריאה פונקציונלית של מודולציית המסלול.
• ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה של מדידת אותים תוך-תאיים באמצעות חיישנים מקודדים גנטית ו-FLIM, ובכך מפחית את השונות בהערכת המסלול.
• ערך אסטרטגי: משפר החלטות go/no-go על ידי קישור מעורבות המטרה לשינויים באותות במורד המסלול בהקשרים התנהגותיים רלוונטיים.
• השפעה על הפורטפוליו: מקל על תיעדוף תרכובות מותאם-סיכון בהתבסס על יכולתן למודולציית פעילות PKA בבעלי חיים הפועלים, ובכך מפחית כישלונות בשלבים מאוחרים עקב היעדר מודולציה של מסלול המטרה.

שיקולי יישום

• דורש מומחיות בהעברת וקטורים ויראליים או באלקטרופורציה תוך-רחמית (in utero electroporation) לצורך ביטוי עצבי של חיישנים מקודדים גנטית.
• תלוי בתשתית של מיקרוסקופיית דימות זמן חיים של פלואורסצנציה דו-פוטונית (two-photon fluorescence lifetime imaging microscopy) ובמומחיות ברכישת נתוני FLIM ובניתוחם.
• מצריך פרוטוקולים סטנדרטיים להכנה של קיבוע ראש, אימון התנהגותי ותחזוקה כרונית של חלון צפייה כדי להבטיח הדירות בין מחקרים.
• כולל שיקולי התאמה בעת יישום השיטה באזורי מוח שונים או במערכי בדיקה התנהגותיים מעבר לתנועה (locomotion).
• מגבלות מעשיות כוללות מורכבות ניתוחית ושונות פוטנציאלית ברמות ביטוי החיישן, אותן יש לבקר לצורך השוואות כמותיות.

שאלות נפוצות בתחום הביו-פרמה