Name: שיטות לבדיקת הפרעה אנדוקרינית בדרוזופילה מלאנוסטר (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: למדו שיטות לבדיקת הפרעה אנדוקרינית ב-Drosophila melanogaster. הפרוטוקול מעריך השפעות של מפריעים אנדוקריניים על פוריות, פוריות, תזמון התפתחות ותוחלת חיים במודל זה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים לאורסולינה פטורו לקבלת תמיכה טכנית. המחברים מודים לד ר מריארטריה אלטה (CNR) לתמיכה ביבליוגרפית. המחברים מודים לד ר גוסטבו דמייאנו מיטה עבור הצגת אותם בעולם EDC. המחברים מודים לייקה מיקרוסיסטמס ופסקואלה רומנו על עזרתם. מחקר זה נתמך על ידי Project PON03PE_00110_1. "המילה הטובה ביותר היא מילה של משפחה, ולהשתלות את הצ" בדונטויטיקה, לאחר שacronimo, הייתה מאוד מלאה בשיניים ובקללות. Committente: פו FESR 2014-2020 קמפאנייה; פרויקט פו פהאב קמפאנייה 2007-2013 "ננו-לוגי לפני RILASCIO בלטו בסין".

. למחברים אין מה לגלות

זבוב הפירות D. melanogaster היה מועסק בהרחבה כמו במערכת vivo model כדי לחקור את ההשפעות הפוטנציאליות של הסביבה edcs כגון dbp28, BPA, 4-NP, 4-tert-OP29, MP30, EP31, 32, dehp33, ו EE234. מספר סיבות הובילו את השימוש בו כמודל בתחום זה של המחקר. מלבד היתרונות הבלתי מעורער שלה כמערכת מודל, מחולקת דרוזופילה מידה גבוהה של שימור גנים עם בני אדם...

פעילויות אנושיות משחררים לסביבה כמות עצומה של כימיקלים, המייצגים בעיה רצינית לאורגניזמים ולמערכת אקולוגית טבעית1. מזהמים אלה, מעריכים כי על 1,000 כימיקלים שונים עשויים לשנות את האיזון הרגיל של מערכות אנדוקריניות; לפי תכונה זו, הם מסווגים כימיקלים המערכת האנדוקרינית משבש (EDCs). באופן ספציפי, מבוסס על הגדרה לאחרונה על ידי החברה האנדוקרינית, EDCs הם "כימיקל אקסוגני, או תערובת של כימיקלים, כי יכול להפריע לכל היבט של פעולה הורמונלית"2. בשלושת העשורים האחרונים, יש כבר גידול ראיות מדעיות כי edcs יכול להשפיע על רבייה ופיתוח של בעלי חיים וצמחים3,4,5,6,7, שמונה. יתר על כן, חשיפה edc היתה קשורה השכיחות הגוברת של כמה מחלות האדם, כולל סרטן, השמנת יתר, סוכרת, מחלות בלוטת התריס, הפרעות התנהגותיות9,10,11.
מנגנונים כלליים של EDC
עקב התכונות המולקולריות שלהם, edcs להתנהג כמו הורמונים או הורמונים מקדים3,4,5,6,7,8,9, . עשר,11,12 במובן זה, הם יכולים לאגד קולטן הורמון לשבש מערכות אנדוקריניות או על ידי מחקה פעילות הורמון או על ידי חסימת הורמונים אנדוגניים מחייב. במקרה הראשון, לאחר הכריכה לקולטן, הם יכולים להפעיל אותו כמו הורמון הטבעי שלו יעשה. במקרה השני, קשירה של ה-EDC לקולטן מונע את הכריכה של הורמון הטבעי שלה, כך הקולטן חסומה ולא ניתן עוד להפעיל, אפילו בנוכחות הורמון טבעי3. כתוצאה מכך, EDCs יכול להשפיע על מספר תהליכים, כגון סינתזה, הפרשה, תחבורה, חילוף החומרים, או פעולה היקפית של הורמונים אנדוגניים האחראים לתחזוקת הומאוסטזיס, רבייה, פיתוח, ו/או התנהגות של האורגניזם כריכת הקולטן אינה הדרך היחידה לפעולה המתוארת עד כה ל-EDCs. כעת ברור כי הם יכולים גם לפעול על ידי גיוס מפעילים או corepressors ב מסלולים אנזימטיים או על ידי שינוי סמנים אפיגנטיים להסיר ביטוי גנים10,11,12,13 ,14, עם השלכות לא רק עבור הדור הנוכחי אלא גם עבור בריאות של דורות לבוא8.
הורמוני דרוזופילה
ההשפעות הפוטנציאליות של ה-EDCs שנבחרו נחקרו רבות, הן במינים של חיות הבר והן במערכות מודל מסוימות בהן מנגנונים אנדוקריניים ידועים באופן סביר. עבור חסרי חוליות, מערכות אנדוקריניות המשפיעות על הצמיחה, הפיתוח והרבייה האופיינים בהרחבה בחרקים מכמה סיבות, תוך שימוש נרחב בתחום המחקר הביולוגי, החשיבות הכלכלית שלהם ו לבסוף התפתחות של קוטלי חרקים המסוגלים להתערב במיוחד במערכת ההורמונים של חרקים מזיקים.
במיוחד, בין חרקים, זבוב הפירות D. melanogaster הוכיחה להיות מערכת מודל רבת עוצמה כדי להעריך את ההשפעות האנדוקריניות הפוטנציאליות של edcs. ב D. melanogaster, כמו גם בעלי חוליות, הורמונים לשחק תפקיד חשוב לאורך כל מחזור החיים. באורגניזם זה, יש שלוש מערכות הורמונליות הראשי, אשר כרוכות הורמון הסטרואידים 20-hydroxyecdysone (20e)15,16, הורמון הקטין לנוער sesquאיטראיד (jh)17, ואת נוירופפטידים ו פפטיד/חלבון הורמונים18. קבוצה שלישית זו מורכבת ממספר פפטידים שהתגלו לאחרונה אך בבירור מעורבים במגוון עצום של תהליכים פיזיולוגיים והתנהגותיים, כגון אריכות ימים, הומאוסטזיס, חילוף החומרים, רבייה, זיכרון, ו locomotor control. 20E הוא הומוולוגי להורמונים סטרואידים נגזרים כולסטרול כגון estradiol, בעוד JH שותפים כמה קווי דמיון עם חומצה retinoic; שניהם הורמונים ידועים יותר. בדרוזוהילה19,20 האיזון שלהם חיוני בתיאום המולטינג והגלגול, כמו גם בשליטה על מספר תהליכים פוסט-התפתחותיים, כגון רבייה, תוחלת חיים, והתנהגות21, ובכך מציעה אפשרויות שונות לבדיקה אנדוקרינית הפרעה בדרוזופילה. יתרה מזאת, הורמונים ecdysteroid ו-JHs הם המטרות העיקריות של האינסקטיצידים הדור השלישי, שפותחו כדי להפריע לתהליכים התפתחותיים והרבייה בתיווך בחרקים. הסוג האגוניסט או מצב היריב של הכימיקלים האלה ידוע היטב, ולכן הם יכולים לשמש כסטנדרטים להתייחסות להערכת ההשפעות של מחשבי ה-EDCs הפוטנציאליים על הצמיחה, הרבייה והפיתוח של חרקים22. לדוגמה, מתיונין, אשר כבר בשימוש נרחב בשליטה יתושים וחרקים מימיים אחרים23,24, עובד כמו אגוניסט jh ו לוחץ מחדש 20e המושרה שעתוק ומטמורפוזה.
בנוסף להורמונים הורמונים, הקולטן הגרעינית (NR) בדרוסופילה ידועה גם כן; הוא מורכב מ -18 מקדמי שימור ושימור שימור הקשורים במסלולים התפתחותיים תלויי הורמונים, כמו גם רבייה ופיזיולוגיה25. הורמון זה NRs שייך לכל ששת מיני-משפחה של ה-NR, כולל אלה מעורבים נוירותמסורת26, שניים עבור חומצה Retinoic nrs, אלה עבור סטרואידים nrs כי, בעלי חוליות, מייצגים אחד היעדים העיקריים של edcs27.
דרוסופילה כמערכת מודל לחקר הפקולטה למדעי המחשב
כיום, על בסיס של תכונות מולקולריות, מספר סוכנויות סביבתיות ברחבי העולם מייחס את הפוטנציאל להפריע למערכות האנדוקריניות לכימיקלים שונים מעשה ידי אדם. בהינתן כי EDCs הם בעיה גלובלית בכל מקום עבור הסביבה ועבור אורגניזמים, המטרה הכוללת של המחקר בתחום זה היא להפחית את נטל המחלה שלהם, כמו גם כדי להגן על אורגניזמים חיים מהשפעות שליליות שלהם. על מנת להעמיק את ההבנה על ההשפעות האנדוקריניות הפוטנציאליות של כימיקל, יש צורך לבחון אותו בvivo. למטרה זו, ד. מלאנוגסטר מייצג מערכת מודל תקפה. עד היום, זבוב הפירות היה בשימוש נרחב כמו במודל vivo כדי להעריך את ההשפעות של מספר EDCs סביבתיים; דווח כי חשיפה לכמה edcs, כגון דיבוטיל פתלאט (dbp)28, בינתנול A (BPA), 4-nonylphenol (4-NP), 4-tert-octylphenol (4-tert-OP)29, מתיל paraben (MP)30, ethylparen (EP)31, 32, bis-(2-ethylyl) פתלאט (dehp)33, ו-17-α-ethinyלסטרנול (EE2)34, משפיע על חילוף החומרים ופונקציות אנדוקריניות כמו במודלים בעלי חוליות. מספר סיבות הובילו לשימוש בו כמודל בתחום זה של המחקר. מעבר לידע מצוין של המערכות האנדוקריניות שלה, יתרונות נוספים כוללים את מחזור החיים הקצר שלה, עלות נמוכה, בקלות manipulable הגנום, היסטוריה ארוכה של מחקר, ומספר אפשרויות טכניות (לראות את האתר FlyBase, http://flybase.org/). ד. melanogaster מספק גם מודל רב עוצמה לחקר בקלות השפעות טרנסדוריים ותגובות האוכלוסייה לגורמים סביבתיים8 ונמנע בעיות אתיות הרלוונטיות למחקרים vivo בבעלי חיים גבוהים יותר. בנוסף, זבוב הפירות משתף מידה גבוהה של שימור גנים עם בני אדם שעשויים לאפשר לדרוזוהילה edc בחני לסייע בחיזוי או בהצעת השפעות פוטנציאליות של כימיקלים אלה לבריאות האדם. מלבד הרחבת ההבנה על השפעות בריאותיות של האדם, דרוזופילה יכול לעזור להעריך את הסיכונים של חשיפת EDC לסביבה, כגון אובדן מגוון המינים והשפלה סביבתית. לבסוף, זבוב הפירות מציע את היתרון הנוסף של השימוש במעבדות, שבו הגורמים העלולים להשפיע על התפתחותו, הרבייה ותוחלת החיים ניתן לשמור תחת שליטה על מנת לייחס כל וריאציה על החומר להיבדק.
עם זאת בראש, יש לנו אופטימיזציה כושר פשוטה ואיתנה לקביעת אפקטים של EDC על כמה מאפיינים הורמונליים של דרוזוהילה, כגון פוריות/פוריות, עיתוי התפתחותי, ותוחלת חיים של מבוגרים. מספר זה שימשו באופן נרחב לכמה מהנגמ ש23,24,25,26,27. בפרט, השתמשנו בפרוטוקולים הבאים כדי להעריך את ההשפעות של החשיפה לאסטרוגן סינתטי EE234 ו BPA ו ביפרונול AF (BPA F) (נתונים שלא פורסמו). פרוטוקולים אלה עשויים להיות שונה בקלות כדי לחקור את ההשפעות של EDC נתון בכל פעם, כמו גם את ההשפעות המשולבות של מספר Edc ב D. melanogaster.

<table><tbody><tr><td>17&alpha;-Ethinylestradiol</td><td>Sigma</td><td>E4876-1G</td><td></td></tr><tr><td>אגר עבור Drosophila</td><td>בינוני BIOSIGMA</td><td>789148</td><td></td></tr><tr><td>ביספנול A</td><td>Sigma</td><td>239658-50G</td><td></td></tr><tr><td>ביספנול AF</td><td>סיגמא</td><td>90477-100MG</td><td></td></tr><tr><td>קמח תירס</td><td>CA' ביאנקה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>דיאתיל אתר</td><td>סיגמא</td><td></td><td></td></tr><tr><td>בקבוקוני דרוזופילה</td><td>BIOSIGMA</td><td>789008</td><td>25 מ"מ x 95 מ"מ</td></tr><tr><td>בקבוקוני דרוזופילה</td><td>BIOSIGMA</td><td>789009</td><td>29 מ"מ x 95 מ"מ</td></tr><tr><td>בקבוקוני דרוזופילה</td><td>קלטק</td><td>187</td><td>22 מ"מ x 63 מ"מ</td></tr><tr><td>כלוב איסוף עוברים</td><td>מלאכת יד</td><td></td><td>גליל פרספקס (12.5 מ"מ על 7 ס"מ) עם קצה פתוח והקצה השני סגור על ידי בסיס מלבני בו חריץ מאפשר הכנסה של מגשים מיוחדים להנחת</td></tr><tr><td>אתנול</td><td>FLUKA</td><td>2860</td><td></td></tr><tr><td>Etherizer</td><td>Crafts</td><td></td><td>מיכל זכוכית גלילי עם תקע כותנה</td></tr><tr><td>בקבוק</td><td></td><td></td> זכוכית <td>250 מ"ל בקבוקוני</td></tr><tr><td>זכוכית</td><td>Microtech</td><td>ST 10024</td><td>צינור תחתון שטוח 100 x 24</td></tr><tr><td>בלנדר ידני מעבד מזון Pimmy</td><td>Ariete</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מיידי שמרים מוצלחים</td><td>ESKA</td><td></td><td>מגש הנחת אבקת שמרים</td></tr><tr><td></td><td>מלאכת יד</td><td></td><td>מגשי פרספקס (11 ס"מ על 2.6 ס"מ) בהם ניתן לשפוך מדיום להנחת</td></tr><tr><td>Methyl4-hydroxybenzoate</td><td>SIGMA</td><td>H5501</td><td></td></tr><tr><td>Petri Dish</td><td>Falcon</td><td>351016</td><td>60x5</td></tr><tr><td>צבע אדום מס' 40</td><td>SIGMA</td><td>16035</td><td></td></tr><tr><td>סטריאומיקרוסקופ עם נורות LED</td><td>Leica</td><td></td><td>S4E</td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>HIMEDIA</td><td>MB025</td><td></td></tr><tr><td>רוטב עגבניות</td><td>Cirio</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

שיטות לבדיקת הפרעה אנדוקרינית בדרוזופילה מלאנוסטר

Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster

בשנים האחרונות הוכחה גוברת כי כל האורגניזמים והסביבה חשופים לכימיקלים כמו הורמונים, המכונה המערכת האנדוקרינית כימיקלים (EDCs). כימיקלים אלה עשויים לשנות את האיזון הרגיל של מערכות אנדוקריניות להוביל לתופעות לוואי, כמו גם מספר גדל והולך של הפרעות הורמונליות באוכלוסייה האנושית או צמיחה מופרעת ורבייה מופחתת במינים חיות הבר. עבור חלק מ-EDCs, קיימים השפעות בריאותיות מתועדות והגבלות על השימוש בהם. עם זאת, עבור רובם, עדיין אין ראיות מדעיות במובן הזה. כדי לאמת את ההשפעות האנדוקריניות הפוטנציאליות של כימיקל באורגניזם המלא, אנו צריכים לבדוק אותו במערכות מודל מתאימות, כמו גם בזבוב הפירות, דרוזופילה מלאנוגסטר. כאן אנו מדווחים מפורט בפרוטוקולים vivo כדי לחקור את ההפרעה האנדוקרינית בדרוזוהילה, מטפל בהשפעות EDC על פוריות/פוריות, התפתחות העיתוי, ותוחלת החיים של הזבוב. בשנים האחרונות, השתמשנו בתכונות אלה החיים הדרוזובית כדי לחקור את ההשפעות של חשיפה 17-α-ethinyלסטרנול (EE2), ביאגנול A (BPA), ו ביאגנול AF (BPA F). בסך הכל, אלה האומרים מכוסים כל החיים Drosophila ילה והפכה את האפשרות להעריך את ההפרעה האנדוקרינית בכל תהליכי הורמון בתיווך. פוריות/פריון והתפתחות עיתוי התפתחותי היו שימושיים למדוד את השפעת ה-EDC על ביצועי הרבייה לטוס ועל שלבים התפתחותיים, בהתאמה. בסופו של דבר, שיטת תוחלת החיים מעורבת בחשיפות EDC כרוניות למבוגרים ומדדו את ההישרדות שלהם. עם זאת, תכונות חיים אלה יכולים גם להיות מושפעים על ידי כמה גורמים ניסיוניים כי צריך להיות נשלט בקפידה. לכן, בעבודה זו, אנו מציעים סדרה של הליכים שאנו ממוטבים עבור התוצאה הנכונה של אלה מספר. שיטות אלה מאפשרות למדענים להקים שיבוש אנדוקריניות עבור כל EDC או לתערובת של מחשבי ה-Edc שונים בדרוזוהילה, למרות שכדי לזהות את המנגנון האנדוקרינית האחראי לאפקט, ניתן יהיה לדרוש חיבורים נוספים.

בסעיף זה, מדווחים שלבי המפתח של הפרוטוקולים הנ ל בצורה של סכימות פשוטות יותר. בהינתן כי זבובים נוטים להימנע תרכובות טעים, הדבר הראשון לעשות הוא לקבוע את הטעם של EDC נבחר. זה יכול להיעשות על ידי ערבוב של צביעה מזון (למשל, צבע אדום מאכל no. 40)35 עם המזון שיושלם עם edc נבחר במינונים שונים או עם הממס לבד. זבובים הניזונים ממדיה אלה נבדקים תחת stereomicroscope וצריכת המזון מוערך על ידי צביעה הבטן שלהם (איור 1). המצב הרצוי אופייני מוצג באיור 1 ...

המערכת האנדוקרינית (EDCs) מייצגת בעיה רצינית עבור אורגניזמים ובסביבות טבעיות. דרוזופילה מלאנוסטר מייצגת מודל אידיאלי לחקר אפקטי edc בvivo. כאן אנו מציגים שיטות לחקירת שיבוש המערכת האנדוקרינית בדרוזוהילה, לטיפול באפקטי EDC על פוריות, פוריות, תזמון התפתחותי ותוחלת חיים של הזבוב.

In recent years there has been growing evidence that all organisms and the environment are exposed to hormone-like chemicals, known as endocrine disruptor ...

Drosophila melanogaster הוא מודל רב עוצמה כדי להעריך vivo את ההשפעות הרעילות והאנדוקריניות הפוטנציאליות של כימיקלים, כגון משבשים אנדוקריניים, המייצגים בעיה רצינית לבריאות האדם וסביבות טבעיות. טיפול בהשפעה של EDCs על תכונות החיים ההורמונליות של הזבוב, כגון פוריות, פוריות, זמן התפתחותי ותוחלת החיים. זוהי דרך קלה, זולה ומהירה לחקור הפרעה אנדוקרינית ב vivo.הפוריות, ההתפתחות ותוחלת החיים בדרוסופילה יכולים להיות מושפעים ממספר גורמים שיש לשלוט בהם בקפידה כדי להבטיח את התוצאה המוצלחת של פרוטוקול זה. לכן, נדרשת תשומת לב מרבית לגידול וטיפול בזבובים. כדי להתוות את הטעם של EDC שנבחר, לאחר הרדמה, להעביר 15 זבובים צעירים ממיטת הזבוב לארבעה בקבוקונים מקבילים המכילים מדיום קמח תירס מעורבב עם צבעי מזון.בקבוקון הבקרה מכיל את הממס בלבד, ושלושת הבקבוקונים האחרים מתווספים במינונים שונים של ה- EDCs שנבחרו. שמרו את הבקבוקונים באינקובטור לח ליום אחד עם אור טבעי של 12 שעות. לאחר הרדמה של הזבובים שוב, העבר את הזבובים משותקים לנייר לבן, והצב אותו תחת מיקרוסקופ סטריאו כדי להתבונן.השווה את צביעת הבטן של כל קבוצת טיפול ביחס לקבוצת הביקורת. כדי להתבנות את ביצועי הרבייה של הזבובים, להכין שלושה בקבוקונים של זבובים עבור כל EDC כמו בקבוקונים הורים, עם שמונה נקבות וארבעה זכרים ב 10 מיליליטר של מדיום קמח תירס בתוספת EE2. לשליטה, להכין שישה בקבוקונים של זבובים, כל אחד עם שמונה נקבות וארבעה זכרים ב 10 מיליליטר של מזון בינוני קמח תירס בתוספת ממס EE2.אחורי זבובים באינקובטור ב 25 מעלות צלזיוס. במהלך התפתחותם, הימנע צפיפות הזחלים. לאחר ארבעה ימים, להפוך כל בקבוקון על אתר כדי להסיר את ההורים ולהחזיר את הבקבוקונים לאינקובטור במשך חמישה ימים נוספים.בשעות אחר הצהריים המאוחרות של היום התשיעי, הפוך כל בקבוקון מעל אתרייזר כדי להסיר את כל הזבובים החדשים שיצאו מהבקבוקונים ולשים את הבקבוקונים באינקובטור אחר ב 18 מעלות צלזיוס לילה. בבוקר יום 10, בתחנת עבודה של דרוסופילה פחמן דו חמצני, בזהירות להפוך את בקבוקון התרבות כדי למנוע זבובים הרדמה ליפול על בינוני ולהכניס צינור גומי עם מחט לתוך הבקבוקון בין פקק הכותנה וקיר הבקבוקון. פתח את השסתום כדי לספק פחמן דו חמצני.תוך שניות ספורות, העבר את הזבובים למיטת זבוב מתחת למיקרוסקופ. לאסוף נקבות בתולות זכרים צעירים בנפרד לשתי קבוצות על מיטת הזבוב. באופן אקראי subdivide כל קבוצה של זבובים בקבוצות משנה קטנות, עם 10 נקבות או 20 זכרים לכל בקבוקון מלא בינוני קמח תירס מתאים טרי.המשך הדגירה ולאסוף 30 נקבות בתולות ו 30 זכרים עבור כל EDC, ו 90 נקבות בתולה ו 90 זכרים לשליטה. שכן קבוצות אלה של זבובים ב 25 מעלות צלזיוס עד שהם גיל ארבעה ימים לאחר eclosion. ואז להעביר אותם בקבוקונים חדשים המכילים מדיום מתאים טרי כל יומיים.בדוק שאין זחלים בבקבוקונים של נקבות. לאחר מכן תייג בקבוקונים עם סדרה שונה של מספרים רציפים לטיפול הבא. לאחר הרדמה, להעביר נקבה אחת EE2 ממיס מטופל לתוך בקבוקון קטן המכיל עגבניות קמח טרי מדיום ללא EE2 ולהוסיף אחד EE2 ממיס מטופלים זכר עבור הפקד על פני.התאם זכר שטופל ב-EE2 עם נקבה שטופלה בממס EE2 או נקבה שטופלה ב-EE2 עם זכר שטופל בממס EE2 לכל טיפול. בית 20 צלבים בודדים ב-25 מעלות צלזיוס. מעבירים כל זוג הזדווגות לבקבוקונים בינוניים של עגבניות קמח תירס טריות ללא EDC כל יום במשך 10 הימים הבאים.ויזואלית לבדוק כל בקבוקון כל יום עבור הביצים ולדווח על מספרם על גיליון אלקטרוני פוריות. בכל בקבוקון, בדוק מקרוב אם יש זבובים שזה עתה הופיעו ורשם את המספר היומי של צאצאים בוגרים במהלך 10 הימים. לאחר 10 ימים מההזדווגות הראשונית, יש להסיר את ההורים מסדרת הבקבוקונים האחרונה.בפרוטוקולים של אקלוזה, ראשית, עבור כל קבוצת טיפול, הקימו 10 בקבוקונים של זבובים צעירים ובריאים בני פחות מיומיים, כל אחד עם שש נקבות ושלושה זכרים ב -10 מיליליטר של מזון קמח תירס ללא EDC. לגדל את הזבובים על מזון במשך 24 שעות ולאפשר להם להזדווג. לאחר מכן להכין עוד 10 בקבוקונים מקבילים לכל קבוצת טיפול עם 10 מיליליטר כל מזון קמח תירס טרי בתוספת ריכוזי EDC שונים או ממס EE2 לבד לבקרה.העבר את הזבובים ההמומים לבקבוקונים החדשים האלה. הפוך גיליון אלקטרוני התפתחותי כדי להקליט את הסדרות השונות. אפשר לזבובים להטיל ביצים במשך 16 שעות.לאחר מכן, להסיר את ההורים מן הבקבוקונים. דגירה הבקבוקונים ב 25 מעלות צלזיוס במשך שלושה עד ארבעה ימים, או עד זחלים נודדים גלויים. בכל יום, לספור את מספר הגלימות החדשות בכל בקבוקון על ידי כתיבת מספר ברצף על ידי כל גולם בצד החיצוני של הבקבוקון, כדי למנוע לספור את אותו גלמה פעמיים.דווח על מספר הגלם החדש שהתגלה במשך שלושה עד ארבעה ימים, או עד שלא יהיה עוד צורת גלם. החל מהיום התשיעי, לספור את מספר המבוגרים המתעוררים מדי יום, עד לא יותר מבוגרים להגיח. דווח על כך בגיליון האלקטרוני ההתפתחותי ובצע את שאר בדיקת האקלוזה על פי כתב היד.בפרוטוקול תוחלת החיים, הקימו תחילה 20 בקבוקונים עם שמונה נקבות וארבעה זכרים, שכל אחד מהם מלא ב-10 מיליליטר של מזון קמח תירס ושכן אותם ב-25 מעלות צלזיוס. לאחר ארבעה ימים, השליכו את הזבובים והחזרו את הבקבוקונים לאנקובטור. בשעות אחר הצהריים המאוחרות של היום התשיעי, הסירו את כל הזבובים החדשים שיצאו מהבקבוקונים והחזירו את הבקבוקונים לאנקובטור.לאחר 16 עד 24 שעות, מחלקים 250 זבובים בוגרים בני יום אחד משני המינים לארבע קבוצות תחת הרדמה קלה של פחמן דו חמצני ומעבירים אותם לבקבוקים של 250 מיליליטר המכילים מזון בינוני למבוגרים, שלושה בתוספת ריכוזי EDC שונים ואחד עם ממס EE2 בלבד. לשמור על הזבובים ב 25 מעלות צלזיוס במשך יומיים עד שלושה ימים כדי לאפשר להם להזדווג. לאחר מכן, מיין כל קבוצה של זבובים לפי מין לשתי קבוצות.בתוך כל מצב טיפול, עבור שני המינים, באופן אקראי subdivide כל קבוצה לחמישה בקבוקונים מקבילים בצפיפות של 20 אנשים לכל בקבוקון. הכינו גיליון אלקטרוני של תוחלת חיים שבו מספר הזבובים המתים מנוטרל ממספר הזבובים ששרדו מההעברה הקודמת, כך שמספר הניצולים בכל העברה מתקבל באופן אוטומטי. לאחר שלושה ימים, להעביר את הזבובים ללא הרדמה בקבוקונים חדשים המכילים את המזון המתאים באותו זמן ולבדוק את המוות.רשום את גיל הזבובים ואת מספר הזבובים המתים. חזור על ההעברה כל שלושה ימים עד שכל הזבובים ימותו. בניסוי זה, עקומות תוחלת החיים התווה כמו הישרדות מצטברת לעומת הימים שחלפו עבור כל ריכוז EDC ואת השליטה.עבור הבקרה, לאחר תקופה ראשונית ארוכה שבה עקומת הניצולים נותרה גבוהה יחסית, היא ירדה באופן אקספוננציאלי לאחר כ-60 יום. בעקבות חשיפת EDC, עקומת הניצול של הזבובים המטופלים הושפעה באופן משמעותי והראתה ירידה דרמטית לאחר 36 ימים. מומלץ על כך בקבוקונים מקבילים תחת ניתוח צריך להיות דומה מאוד, אחרת זה יהיה קשה להבין איזה להשליך.לכן, אנו ממליצים לנהוג בזהירות רבה, לאמץ תרגול ניסיוני טוב, באמצעות גודל מדגם גדול. בעקבות פרוטוקולים אלה, ניתן גם להעריך את ההשפעה הטרנסג'נדרית של משבש אנדוקריני נבחר, כמו גם לבדוק את ההשפעות התוסף הפוטנציאלי של שילוב של משבשים אנדוקריניים שונים.

methods-to-test-endocrine-disruption-in-drosophila-melanogaster

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

איתות אינסולין נשמרת המסלולים נמצא זבוב...

הזרקת אינסולין ו Extraction Hemolymph כדי למדוד את הרגישות לאינסולין אצל מבוגרים תסיסנית melanogaster</em

מדענים משתמשים בפרוטוקול תוחלת החיים של דרוזופילה כדי למדוד כיצד תנאי ניסוי שונים משפיעים על תוחלת החיים של הזבובים וליצור עקומות הישרדות בתהליך כדי לכמת את תוצאות הניסוי. פרוטוקול הדגימה כולל את הבדיקה המיושמת כדי לחקור את ההשפעות על אריכות ימים מחשיפה לריכוזים משתנים של כימיקלים משבשים אנדוקריניים, או EDCs, כגון 17-α-ethinylestradiol (EE2).

פרוטוקול תוחלת חיים עבור Drosophila melanogaster: יצירת עקומות הישרדות לזיהוי הבדלים בתוחלת החיים של זבובים

סרטון זה מתאר בדיקת האכלה לזבובי פירות שבה משתמשים במזון צבעוני כדי לפקח על האכלה ועל ההשפעה שעשויה להיות לתרכובות נוספות על פעילות ההאכלה. הפרוטוקול לדוגמה בודק את ההשפעות של מספר כימיקלים משבשים אנדוקריניים (EDC).

מבחן האכלה: הערכת העדפות האכלה בדרוזופילה מלנוגסטר

מבוא של מולקולות קטנות לעובר דרוזופילה הפיתוח מציע פוטנציאל גדול לאפיון פעילות ביולוגית של תרכובות רומן, סמים ורעלים כמו גם לחיטוט מסלולים התפתחותיים בסיסיים. שיטות שתוארו במסמך זה מתארים את שלבים שלהתגבר על מחסומים טבעיים לגישה זו, המרחיב את התועלת של מודל עובר דרוזופילה.

שיטה של ​​permeabilization של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עוברים למבחנים של מולקולה קטנה פעילות

בנייר זה, אנו מספקים פרוטוקול מפורט עבור חשיפת מינים של הסוג דרוזופילה לחומרים מזהמים עם המטרה של הלומדים את ההשפעה של חשיפה על מגוון של תפוקות פנוטיפי בשלבים התפתחותיים שונים, יותר מאשר דור אחד.

נסיוני באמצעות דרוזופילה כמערכת מודל הגעה לבדיקת רעילות במעבדה

פרוטוקול זה מתאר שיטה כדי להקליט את הפעילות החשמלית יורד של מערכת העצבים המרכזית דרוזופילה melanogaster כדי לאפשר את עלות-יעיל ונוח בדיקה של סוכנים תרופתי, מוטציות גנטיות של חלבונים עצבית, ו/או את התפקיד של מסלולים פיזיולוגיים נחקרו.

הקלטה אלקטרופיזיולוגיות של פעילות מערכת העצבים המרכזית השלישית-לחלל דרוזופילה Melanogaster

פרוטוקול זה נועד להעריך את הכדאיות של דרוסופילה בכל שלב התפתחותי, מעובר למבוגר. ניתן להשתמש בשיטה כדי לקבוע ולהשוות בין הכדאיות של גנוסוגים שונים או תנאי גדילה.

שיטה ישירה ופשוטה להערכת דרוזופילה מלאנוגסטרהכדאיות מעובר למבוגר

שלמות מכשול הדם במוח. היא קריטית לתפקוד מערכת העצבים בדרוזופילה מלאנוסטר, מכשול המוח בדם נוצר על ידי תאי גלאל במהלך הembryogenesis המאוחרות. פרוטוקול זה מתאר שיטות לטיפול בתפקוד ותחזוקה של מחסומי מוח בדם בד. מלאנוגסטר עוברים והזחלים השלישי.

שיטת שלמות המוח בדם בדרוזופילה מלאנוסטר

פרוטוקול זה מתאר שיטה יעילה וזולה המשתמשת במדיה נוזלית כדי להעריך את ההשפעות של רעלים כימיים על הכדאיות של Drosophila melanogaster בוגר.

הערכת רעילות כימית במלנוגסטר דרוזופילה למבוגרים

כאן, שיטה מתוארת להאכיל Drosophila melanogaster עם תרופות ותמציות צמחים ולהעריך את השפעתם על מערכת העיכול על ידי ניתוח זבובי פירות צואה פיקדונות. הזבובים שטופלו בתרופות יכולים לשמש כמודל למחקר נוסף.

הערכת ההשפעה של תרופות נוגדות שלשול ותמציות צמחים על Drosophila melanogaster

הפרוטוקול מציג שיטה בעלת תפוקה גבוהה וחסכונית להערכת רעילות עצבית בזבוב הפירות באמצעות כימות תפקוד לקומוטורי כחלופה למודלים מסורתיים של יונקים. מטרתו להעריך את ההשפעות הנוירוטוקסיות של תרכובות פרמצבטיות, גורמים סביבתיים או שינויים גנטיים באמצעות מודל רגיש, ניתן לשחזור וחיובי מבחינה אתית.

ניתוח התנהגותי של תפקוד לקומוטורי ב-Drosophila melanogaster כקריאה לרעילות עצבית

למדו שיטות לבדיקת הפרעה אנדוקרינית ב-Drosophila melanogaster. הפרוטוקול מעריך השפעות של מפריעים אנדוקריניים על פוריות, פוריות, תזמון התפתחות ותוחלת חיים במודל זה.

שיטות לבדיקת הפרעה אנדוקרינית בדרוזופילה מלאנוסטר

גלה סרטונים נוספים