Name: הגנוזות של כלנית ימית במהלך ההתפתחות המוקדמת (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-13T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: למד שיטת גנוטיפינג לא קטלנית לכלנית ימית במהלך ההתפתחות המוקדמת. טכניקה זו מאפשרת זיהוי מוטנטים ב-Nematostella vectensis מבלי להקריב את העובר, ותומכת בניתוח פנוטיפים לאחר ההתפתחות העוברית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לסוקרים אנונימיים על הערות על הגרסה המוקדמת של כתב היד, ששיפרו את כתב היד. עבודה זו נתמכת על ידי קרנות מאוניברסיטת ארקנסו.

1. אינדוקציה של השאיפה, הפריה חוץ גופית , ו-דה-jellying
<ol><li>שמירה על שלפוחית הזרע בתוך מי ים עם מליחות של 12 חלקים לאלף (ppt) בחשיכה ב -16 ° c, האכלה artemia מדי יום.</li>
	<li>ביום לפני הבהיית השראה, מניחים בעלי חיים בחממה בטמפרטורה ובשליטה קלה. לתכנת את החממה כך שבעלי החיים ייחשפו ל -8 מעלות של אור ב -25 ° c. אופציונלי: האכילו חתיכה קטנה (< 1 מ"מ3) של צדפה לבעלי חיים בודדים לפני הצבת אותם לתוך החממה כדי לשפר את ההשריץ.</li>
	<li>השאירו את החיות בחממה במשך 1 h ב -16 ° c.</li>
	<li>הסר את בעלי החיים מהאינקובטור והשאר אותם על שחקן ספסל עם אור בטמפרטורת החדר (RT) כדי לאפשר השאיפה. ההשמה מתרחשת בדרך כלל בתוך 1.5-2 h הבאה.</li>
	<li>אם הזכרים והנקבות מצויים במכולות שונות, מניחים חבילות ביצים מהמכולה הנשית לתוך מכולה גברית המכילה זרע באמצעות פיפטה העברה שקצהו נחתך כדי להגדיל את הפתח כך שהביצים לא ניזוקו על-ידי לחץ מכני במהלך עברת. לאפשר לביצים להיות מופרות על ידי השארת אותם במיכל זכר לפחות 15 דקות.</li>
	<li>דה-ג'לי חבילות הביצית במי ים המכילים 3% ציסטאין (pH 7.4) על צלחת פטרי או בשפופרת של 15 מ ל. בעדינות מתפרעים על שייקר עבור 12 דקות.</li>
	<li>השתמש בפיפטה פלסטי כדי לפרק את הגושים ולהמשיך להיות מתפרעים לעוד 2-3 דקות עד לחלוטין דה-ג'אליאד.</li>
	<li>להסיר את ציסטאין על ידי החלפת המדיה עם מי ים טריים לפחות 5x.</li>
	<li>שמרו את הביצים המוופרות על צלחת פטרי מזכוכית ב -16 ° c או RT.</li>
</ol>2. הסרה כירורגית של רקמת הבורג מעובר הגסטרולה
<ol><li>להכין מאגר הפקת ה-DNA המורכב של 10 mM טריס-HCl (pH 8), 50 mM KCl, 1 מ"מ EDTA, 0.3% Tween20, 0.3% NP40, ו 1 מ"ג/mL פרוטטינואז K. שימוש 20 מ ל של מאגר החילוץ לכל העובר. מערבבים היטב על ידי vortexing ו סדרת מחלקים את המאגר לתוך צינורות PCR.</li>
	<li>מתמוסס 1% התעורר במי ים ויוצקים אותו צלחת פטרי כדי לכסות את הקרקעית. מגניב על שחקן ספסל. להכין מיטת ג'ל יוצקים מי ים טריים כדי לכסות את מיטת ג'ל בצלחת פטרי.</li>
	<li>העבר 24 h לאחר הפריה (hpf) עוברים (שלב מוקדם עד באמצע הבמה) לתוך צלחת פטרי המכילה מיטת ג'ל agarose.</li>
	<li>הכנס מחט טונגסטן למחזיק מחט לחטא על ידי לטבול את קצה המחט באלכוהול (70% או יותר) והצבת אותו להבה כדי לשרוף את האלכוהול.</li>
	<li>תחת מיקרוסקופ מבתר (ב 20x כדי 40x ההגדלה), להשתמש במחט טונגסטן כדי לעשות דיכאון על מיטה agarose על ידי הסרת פיסת משטח על גבי גודל של העובר כדי להיות מניפולציות, ומניחים את העובר על הדיכאון עם לרוחב שלה צד כלפי מטה כדי להגביל את תנועת העובר עבור ניתוח מיקרו.</li>
	<li>השתמש במחט טונגסטן כדי בניתוח בוהן פיסת של רקמת הבורג הממוקם מול הפתיחה אוראלי בלייסטופה. בדרך כלל מספיקה הבורג השלישי לרבע של הרקמה העוברה לאורך ציר הפה-הבורג.</li>
	<li>השתמש בפיפטה P20 כדי להעביר את רקמת הבורג המבודד (ב< 2 מ ל) לצינור PCR המכיל 20 מ ל של מאגר חילוץ DNA.</li>
	<li>להעביר את העובר אחרי הניתוח לתוך היטב המכיל לפחות 500 mL של מי ים טריים בצלחת 24 או 96-באר.</li>
	<li>חזור על שלבים 2.4 – 2.8 עבור מספר העוברים לפי הצורך.</li>
	<li>מניחים את הצלחת היטב המכילה העוברים לאחר הניתוח בחממה ב -16 ° צ' או RT עד השלמת הגנוהקלדה.</li>
</ol>3. הוצאת דנ א גנומית ו-PCR הקלדה
<ol><li>בקצרה לסובב את צינורות ה-PCR המכיל את מאגר החילוץ DNA ורקמות עובריות מבודדים באמצעות מיני צנטריפוגה (למשל ב 2,680 x g עבור 10 s).</li>
	<li>כדי לחלץ דנ א גנומית של עוברים בודדים, מודפת את צינורות ה-PCR ב 55 ° c עבור 3 h. מערבולת עבור 30 כל 30 דקות כדי להבטיח התמוטטות של גושי תאים ולשפר את הליזה תאים.</li>
	<li>מודטה את צינורות ה-PCR ב 95 ° צ' עבור 5 דקות כדי להשבית את האבטחה K.</li>
	<li>לשמור על תמציות gDNA ב 4 ° צ' או על קרח, ומיד להמשיך ל-PCR. הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן על ידי הצבת תמציות gDNA במקפיא של 20 ° c.</li>
	<li>הגדר תגובת PCR באמצעות gDNA חילוץ כתבנית כדי להגביר את מקור גנומית של עניין.<ol>
<li>אם האללים שונים במיקום הריבית שונים בגודלם, כך שהפרש הגודל ניתן לזיהוי על ידי האלקטרופורזה בג ג'ל, עיצוב קבוצה אחת של התחל כדי להגביר את היקום כולו.</li>
		<li>לחילופין, השתמש בצבעי היסוד של allele היוצרים מוצרים PCR רק בנוכחות האלל המסוים; למשל, על ידי עיצוב פריימר הנקשר לאזור המכיל מוטציות הכניסה/מחיקה.</li>
		<li>השתמש ב-20 מ ל התגובה האופיינית ל-PCR כדלקמן: 5 מ ל של תמציות gDNA, 8 מ ל של nuclease-מים ללא תשלום, 4 מ ל של מאגר PCR, 0.2 מ ל של 10mM dNTPs, 0.6 מ ל של DMSO, 1 מ מ של 10 מ"מ בהילוך קדמי, 1 מ ל של 10 מ"מ תחל , ו 0.2 מ ל של דנ א פולימראז (ראה טבלת חומרים). הערה: ניתן להשתמש בצבעי יסוד מרובים בתגובת PCR. למשל, אחד לשלב הקדמי האוניברסלי ושני התחל הפוך הספציפי האחרון ניתן לשלב, כל עוד שני התחל לאחור נועדו לייצר מוצרים PCR בגדלים שונים, כך הנוכחות/העדר של שני האללים יכול להיות חד משמעית שנקבע על ידי ג'ל אלקטרופורזה (ראה סעיף תוצאות מייצג).</li>
	</ol>
</li>
	<li>הפעל אלקטרופורזה בג ג'ל כדי לקבוע את הגודל והנוכחות/היעדרות של מוצרי PCR. כוונן את מצבם של האלקטרופורזה בג ג'ל (למשל, אחוז ג'ל מעלה, V/cm ומשך) בהתאם לגודל הצפוי של מוצרי ה-PCR.</li>
	<li>השתמש בתוצאות מ-PCR לגבי הגודל והנוכחות/היעדרות של מוצרי PCR כדי להקצות גנוטיפ לכל עובר שלאחר ניתוח. לדוגמה, אם האללים שונים צפויים ליצור מוצרי PCR בגדלים שונים, השתמש בנתוני הגודל כדי להקצות את ה-גנוטיפ עבור כל עובר. אם נעשה שימוש בצבעי היסוד הספציפיים של allele, יש להשתמש בנתונים בנוכחות/היעדרות של מוצרי PCR כדי להקצות גנוטיפ לכל עובר.</li>
	<li>מיון עוברים לפי גנוטיפ.</li>
</ol>

<ol><li>Medina, M., Collins, A. G., Silberman, J. D., Sogin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+hypotheses+of+basal+animal+phylogeny+using+complete+sequences+of+large+and+small+subunit+rRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Evaluating hypotheses of basal animal phylogeny using complete sequences of large and small subunit rRNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (17), 9707-9712 (2001).</li>
<li>Erwin, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Cambrian+Conundrum%3A+Early+Divergence+and+Later+Ecological+Success+in+the+Early+History+of+Animals%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The Cambrian Conundrum: Early Divergence and Later Ecological Success in the Early History of Animals.</a> Science. 334 (6059), 1091-1097 (2011).</li>
<li>Putnam, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sea+anemone+genome+reveals+ancestral+eumetazoan+gene+repertoire+and+genomic+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Sea anemone genome reveals ancestral eumetazoan gene repertoire and genomic organization.</a> Science. 317 (5834), 86-94 (2007).</li>
<li>Magie, C. R., Daly, M., Martindale, M. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastrulation+in+the+cnidarian+Nematostella+vectensis+occurs+via+invagination+not+ingression%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Gastrulation in the cnidarian Nematostella vectensis occurs via invagination not ingression.</a> Developmental Biology. 305 (2), 483-497 (2007).</li>
<li>Nakanishi, N., Martindale, M. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+knockouts+reveal+an+endogenous+role+for+ancient+neuropeptides+in+regulating+developmental+timing+in+a+sea+anemone%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">CRISPR knockouts reveal an endogenous role for ancient neuropeptides in regulating developmental timing in a sea anemone.</a> eLife. 7, e39742(2018).</li>
<li>He, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+axial+Hox+code+controls+tissue+segmentation+and+body+patterning+in+Nematostella+vectensis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">An axial Hox code controls tissue segmentation and body patterning in Nematostella vectensis.</a> Science. 361 (6409), 1377(2018).</li>
<li>Ikmi, A., McKinney, S. A., Delventhal, K. M., Gibson, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TALEN+and+CRISPR%2FCas9-mediated+genome+editing+in+the+early-branching+metazoan+Nematostella+vectensis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">TALEN and CRISPR/Cas9-mediated genome editing in the early-branching metazoan Nematostella vectensis.</a> Nature Communications. 5, 5486(2014).</li>
<li>Servetnick, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cas9-mediated+excision+of+Nematostella+brachyury+disrupts+endoderm+development%2C+pharynx+formation+and+oral-aboral+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cas9-mediated excision of Nematostella brachyury disrupts endoderm development, pharynx formation and oral-aboral patterning.</a> Development. 144 (16), 2951-2960 (2017).</li>
<li>Kraus, Y., Aman, A., Technau, U., Genikhovich, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-bilaterian+origin+of+the+blastoporal+axial+organizer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Pre-bilaterian origin of the blastoporal axial organizer.</a> Nature Communications. 7, 11694(2016).</li>
<li>Fritzenwanker, J. H., Genikhovich, G., Kraus, Y., Technau, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+development+and+axis+specification+in+the+sea+anemone+Nematostella+vectensis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Early development and axis specification in the sea anemone Nematostella vectensis.</a> Developmental Biology. 310 (2), 264-279 (2007).</li>
<li>Lee, P. N., Kumburegama, S., Marlow, H. Q., Martindale, M. Q., Wikramanayake, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetric+developmental+potential+along+the+animal-vegetal+axis+in+the+anthozoan+cnidarian%2C+Nematostella+vectensis%2C+is+mediated+by+Dishevelled%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Asymmetric developmental potential along the animal-vegetal axis in the anthozoan cnidarian, Nematostella vectensis, is mediated by Dishevelled.</a> Developmental Biology. 310 (1), 169-186 (2007).</li>
<li>Shinzato, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+the+Acropora+digitifera+genome+to+understand+coral+responses+to+environmental+change%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+%28London%29%22%5BJournal%5D)">Using the Acropora digitifera genome to understand coral responses to environmental change.</a> Nature (London). 476 (7360), 320-323 (2011).</li>
<li>Gold, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genome+of+the+jellyfish+Aurelia+and+the+evolution+of+animal+complexity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Ecology+%26+Evolution%22%5BJournal%5D)">The genome of the jellyfish Aurelia and the evolution of animal complexity.</a> Nature Ecology & Evolution. 3 (1), 96-104 (2019).</li>
<li>Clevesa, P. A., Strader, M. E., Bay, L. K., Pringle, J. R., Matz, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-mediated+genome+editing+in+a+reef-building+coral%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-mediated genome editing in a reef-building coral.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (20), 5235-5240 (2018).</li>
<li>Momose, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+doses+of+CRISPR%2FCas9+ribonucleoprotein+efficiently+induce+gene+knockout+with+low+mosaicism+in+the+hydrozoan+Clytia+hemisphaerica+through+microhomology-mediated+deletion%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">High doses of CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein efficiently induce gene knockout with low mosaicism in the hydrozoan Clytia hemisphaerica through microhomology-mediated deletion.</a> Scientific Reports. 8, 11734(2018).</li>
<li>Artigas, G. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gonad-expressed+opsin+mediates+light-induced+spawning+in+the+jellyfish+Clytia%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">A gonad-expressed opsin mediates light-induced spawning in the jellyfish Clytia.</a> eLife. 7, e29555(2018).</li>
</ol>

. לסופר אין מה לגלות

המתואר כאן פרוטוקול PCR על מנת גנוטיפ בודד העובר כלנית ים מבלי להקריב את החיה. הביצים המוופרות מורשות להתפתח בעקבות ההשאיפה והדה-מיולים. האזור הבורג של העובר כל גאורולה הוא הוסר בניתוח, ואת רקמת הבורג המבודד משמש להפקת DNA הבאים גנומית, בעוד העוברים שלאחר ניתוח שנותרו לרפא ולהמשיך בפיתוח. תמציות ה-Dna משמשות לצורך שיטת PCR כדי לקבוע את ה-גנוטיפ של כל עובר. שיטה זו מנצלת את היכולת של החצאים אוראלי של העובר כלנית הים לווסת ולפתח10,11, ואת רוב העוברים (> 90%) בדרך כ...

החברה מייצגת קבוצה מגוונת של בעלי חיים הכוללים מדוזה, אלמוגים וכלניות ים. הם דיפלותקיעות, המורכב מעור ומעור, המופרדים על-ידי מטריצה מיגלנת (מזוגליא). Cנדבך היא קבוצת אחיות לסוגז בילוניה, שאליה מודלים מסורתיים של בעלי חיים כגון דרוסוהילה ומיוז שייכים ל- 1. בנוסף, הסטייה מהקטריה-בילוניה התרחשה בתקופה הקדם-קמברנית2. ככזה, מחקרים השוואתיים של בילנים ובילואים חיוניים לקבלת תובנות לגבי הביולוגיה של הקדמון המשותף העדכני ביותר שלהם. לאחרונה, גנומיקה השוואתית גילה כי הקטנים ו bilaterians חולקים הרבה גנים ערכת הכלים התפתחותיים כגון חריץ ו bhlh, רומז כי אבותינו המשותפים כבר היו אלה גנים3. עם זאת, התפקיד של גנים אלה ההתפתחותית הקדמון המשותף האחרון של Cנדבך ו Bilateria הוא זהובה פחות הבין היטב. כדי לטפל בבעיה זו, חשוב ללמוד כיצד לתפקד הגנים העמוקים הללו בתוך הקטרים.
אחד המודלים הגנטיים המתעוררים . הגנום שלה יש רצף3, ומגוון של כלים גנטיים, כולל שורסטינו-בתיווך גנים הסתרה, meganuclease-תיווך טרנסגנזה, ו CRISPR-Cas9-בתיווך גן knockins ו הסתרה, זמינים כעת לשימוש בחיה זו. בנוסף לכך , התפתחות ההתפתחות של הניפה מובנת באופן יחסי. במהלך הembryogenesis, הגסטרוציה מתרחשת על ידי הגבנות4, והעובר מתפתח לזחל בשחייה חופשית. לאחר מכן, הפלולה הופך לפוליפ סלוח עם פה וזרועות מעומות. הפוליפ גדל ומגיע לבגרות מינית.
Crispr-Cas9-בתיווך מוטגנזה ממוקדת המשמש כעת שימוש באופן שגרתי כדי ללמוד את התפקוד הגנטי בתוך להיות סטלה vectensis5,6,7,8,9. כדי ליצור מוטציות הנוקאאוט ב ne, קוקטייל המכיל לוקוס ספציפי מדריך יחיד rnas ו endonuclease Cas9 חלבון מוזרק תחילה לתוך ביצים לא מופרות או מופרות לייצר חיות מייסד F0 בדרך כלל להראות פסיפס. F0 בעלי חיים מוגשים לאחר מכן לבגרות מינית ועברו אחד עם השני כדי לייצר אוכלוסייה F1, תת קבוצה של אשר עשוי להיות מוטציות הנוקאאוט6. לחילופין, בוגרת מינית בעלי חיים F0 יכול להיות חצה עם חיות מסוג פראי כדי ליצור heterozygous בעלי חיים f1, ו f1 הטרוזיטים כי לשאת את אלל הנוקאאוט בתוך מקום העניין יכול אז להיות חצה אחד עם השני כדי לייצר הצאצאים F2, אחד ברבעון מהם צפויים להיות. מוטציות בנוקאאוט5 שתי הגישות דורשות שיטה לזיהוי מוטציות הסתרה מאוכלוסיה הטרוגנית גנטית. הפוליפ זרועות ניתן להשתמש כדי לחלץ דנ א גנומית עבור גנוהקלדה6,7. עם זאת, במקרים שבהם הפונקציה ההתפתחותית של גן העניין היא להיחקר ועוברי מוטציה אינם מגיעים לשלב הפוליפ (כלומר, עקב הפרשות הזחל הקשורות למוטציה), יש לזהות מוטציות הסתרה בתחילת האירוע. המתואר כאן הוא פרוטוקול PCR המבוסס על בעלי חיים בודדים בשלב הגסטרולה מבלי להקריב את בעל החיים, אשר מאפשר זיהוי של מוטציות נוקאאוט מאוכלוסיה הטרוגנית גנטית של עוברים. משך תהליך ההקלדה כולו תלוי במספר העוברים להיות מוקרן, אבל זה מינימלית דורש 4-5 h.

<table><tbody><tr><td>Drosophila Peltier חממה מקוררת</td><td>Shellab</td><td>SRI6PF</td><td>משמש לאינדוקציה אינדוקציה</td></tr><tr><td>אינסטנט אוקיינוס מלח ים</td><td>מיידי אוקיינוס</td><td>138510</td><td></td></tr><tr><td>ציסטות שרימפס מלח</td><td>Aquatic Eco-Systems, Inc.</td><td>BS90</td><td></td></tr><tr><td>L-ציסטאין הידרוכלוריד</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>C7352</td><td></td></tr><tr><td>שייקר אורביטלי סטנדרטי, דגם 3500</td><td>VWR</td><td>89032-092</td><td></td></tr><tr><td>TRIS-HCl, 1M, pH8.0</td><td>איכות ביולוגית</td><td>351-007-01</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן כלורי</td><td>VWR</td><td>BDH9258</td><td></td></tr><tr><td>EDTA, 0.5M pH8</td><td>VWR</td><td>BDH7830-1</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet-P40 תחליף</td><td>US ביולוגי</td><td>N3500</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K תמיסה (20 מ"ג/מ"ל), RNA כיתה</td><td>ThermoFisher</td><td>25530049</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>VWR</td><td>710</td><td></td></tr><tr><td>מחזיק מחט מיקרו חיתוך</td><td>Roboz</td><td>RS-6060</td><td></td></tr><tr><td>מחט ניתוח טונגסטן</td><td></td><td>Roboz RS-6063</td><td></td></tr><tr><td>PCR Eppendorf Mastercycler Thermal Cyclers</td><td>Eppendorf</td><td>E6336000024</td><td></td></tr><tr><td>Phusion פולימראז DNA בנאמנות גבוהה</td><td>ניו אינגלנד BioLabs</td><td>M0530L</td><td></td></tr><tr><td>dNTP mix</td><td>ניו אינגלנד BioLabs</td><td>N0447L</td><td></td></tr><tr><td>GLWamide פריימר</td><td></td><td></td> קדימה אוניברסלי <td>5'- CATGCGGAGACCAAGCGCAAGGC-3'</td></tr><tr><td>פריימר הפוך ספציפי ל-glw-a</td><td></td><td></td><td>5'-CCAGATGCCTGGTGATAC-3'</td></tr><tr><td>פריימר הפוך ספציפי ל-glw-c </td><td></td><td></td><td>5'- CGGCCGGCGCATATATAG-3'</td></tr></tbody></table>

הגנוזות של כלנית ימית במהלך ההתפתחות המוקדמת

Genotyping of Sea Anemone during Early Development

המתואר כאן הוא פרוטוקול ה-PCR כדי גנוטיפ העובר בשלב הגאולה של האנתוזואן לאחר הדלקת הקרום האנוטזיס מבלי להקריב את חיי החיה. בעקבות הפריה חוץ גופית ו-de-jellying, הזיטים מורשים להתפתח 24 שעות בטמפרטורת החדר כדי להגיע לשלב מוקדם עד באמצע הגאולה. העוברים הגאוטרולה מונחים לאחר מכן על מיטת ג'ל בצלחת פטרי המכילה מי ים. תחת מיקרוסקופ מבתר, מחט טונגסטן משמש בניתוח להפריד משבר רקמת הבורג מעובר כל. העוברים לאחר הניתוח מורשים להירפא ולהמשיך בפיתוח. דנ א גנומית מופק מרסיס רקמות מבודדים משמש כתבנית ל-PCR ספציפי לוקוס. ה-גנוטיפ ניתן לקבוע בהתבסס על גודל מוצרי ה-PCR או נוכחות/היעדרות של מוצרי PCR ספציפיים של allele. העוברים לאחר הניתוח ממוינים לאחר מכן לפי ה-גנוטיפ. משך תהליך ההקלדה כולו תלוי במספר העוברים שיוקרנו, אך הדבר מחייב את השעה 4 – 5 h. שיטה זו יכולה לשמש כדי לזהות מוטציות הסתרה מתוך אוכלוסיה הטרוגנית גנטית של עוברים ומאפשר ניתוח של פנוטיפים במהלך הפיתוח.

הגנום Ne, סטלה יש לוקוס יחיד המקודד חלבון מקודמן עבור GLWamide נוירופפטיד. שלוש הנוקאאוט של המוטציות בלוקוס זה (glw-a, glw-b, ו -glw-c) דווחו בעבר5. ארבעה זכרים heterozygous נושאת אלל פראי (+) ו הנוקאאוט אלל glw-cב glwamide לוקוס (גנוטיפ: +/glw-c) נחצה עם נקבה heterozygous נושאת אלל פראי ונוקאאוט שונים אלל glw-a באותו לוקוס (גנוטיפ: +/glw<sup...

המטרה של פרוטוקול זה היא גנוטיפ של כלנית המים ne, שושנת הימים במהלך המאבק מבלי להקריב את העובר.

Described here is a PCR-based protocol to genotype the gastrula stage embryo of the anthozoan cnidarian Nematostella vectensis without sacrificing the ...

פרוטוקול זה מאפשר לחוקר לזהות כלניות ים מוטנטיות במהלך העוברים המוקדמים, כך שניתן יהיה לנתח פנוטיפ התפתחותי פוסט-עוברי. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן להשתמש בה כדי גנוטיפ כלניות ים בודדות בשלב מוקדם של ontogeny מבלי להקריב את חייו של החיה. הוכחת הליך זה יהיה מיגל סילבה, סטודנט לתואר שני מהמעבדה שלי.ביום שלפני השראת אינדוקציה, מניחים את הנמאטוסטלה וקטנסיס הכלית באינקובטור מבוקר טמפרטורה ואור, מתכנתים את החממה כך שבעלי החיים נחשפים לשמונה שעות אור בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס. למחרת, מוציאים את בעלי החיים מהחמה ומשאירים אותם על ספסל עליון בטמפרטורת החדר כשהאור דול כדי לאפשר השרצאה, שתתרחש בתוך שעה וחצי עד שעתיים. השתמש פיפטה העברה מי קצה נחתך כדי להגדיל את הפתח כדי למקם חבילות ביצה מן המיכל הנשי לתוך מיכל זכר המכיל זרע ולהשאיר אותם במיכל הגברי לפחות 15 דקות כדי לאפשר הפריה.לאחר ההפריה, כדי dejelly את חבילות הביציות, מניחים אותם במי ים המכילים 3% ציסטאין על צלחת פטרי זכוכית בעדינות להתסיס על שייקר במשך 12 דקות. ואז לשבור גושים עם פיפטה פלסטיק ולהמשיך להתסיס עוד שתיים עד שלוש דקות עד dejellied לחלוטין. שומרים את הביציות המופריות על אותה מנה בטמפרטורה של 16 מעלות צלזיוס או בטמפרטורת החדר.ביום שלמחרת, הכינו את מאגר שאיבת הדנ"א כמתואר בכתב היד, ערבבו היטב על ידי מערבולת, והגדילו אותו לצינורות PCR על ידי הוספת 20 מיקרוליטרים לכל צינור. ממיסים 1% במים, יוצקים אותו לתוך צלחת פטרי כדי לכסות את התחתית, ומצננים על ספסל עליון כדי להכין מיטת ג'ל. מכסים את מיטת הג'ל במי ים מתוקים.מעבירים עוברים 24 שעות ביממה לאחר ההפריה באמצעות פיפטה לתוך צלחת פטרי המכילה ג'ל אגרוז. הכנס מחט טונגסטן לתוך בעל צורך וחיטוי על ידי טבילת הקצה שלה באלכוהול והנחת אותו בלהבה כדי לשרוף את האלכוהול. תחת מיקרוסקופ לנתח, לעשות דיכאון על agarose באמצעות מחט טונגסטן כדי להסיר חתיכת משטח התעוררה בערך בגודל של עובר להיות מניפולציה.לאחר מכן, באמצעות מחט טונגסטן, למקם את העובר לתוך הדיכאון עם הצד הצדדי שלה פונה כלפי מטה על מנת להגביל את התנועה של העובר עבור מיקרוכירורגיה. על מנת לבצע ניתוח מוצלח, חיוני להגביל את תנועת העובר. עם מחט טונגסטן, להסיר בניתוח חתיכת רקמה aboral לאורך הציר aboral אוראלי, הממוקם מול פתח blastoporal אוראלי.עם פיפטה P20, להעביר את הרקמה aboral מבודד לצינור PCR המכיל 20 microliters של מאגר מיצוי DNA. מעבירים את העובר שלאחר הניתוח לתוך באר של צלחת 24 באר המכילה לפחות 500 מיקרוליטרים של מי ים מתוקים. ומ מניחים את הצלחת המכילה עוברים לאחר הניתוח באינקובטור ב 16 מעלות צלזיוס עד genotyping הושלם.כדי לחלץ דנ"א גנומי עוברים בודדים, תחילה לסובב בקצרה את צינורות PCR המכילים את מאגר מיצוי ה- DNA ורקמות עובריות מבודדות באמצעות מיני צנטריפוגה. לאחר מכן דגירה הצינורות ב 55 מעלות צלזיוס במשך שלוש שעות תוך מערבולת במשך 30 שניות כל 30 דקות כדי להבטיח פרידה של גושים התא ולשפר את תות התא. לאחר השבתת פרוטאינאז K ב 95 מעלות צלזיוס במשך ארבע דקות, להגדיר תגובת PCR באמצעות DNA גנומי שחולצו כתבנית כדי להגביר את הפוקוס של עניין.העיצוב רצה פריימרים כמתואר בכתב היד. הגדר תגובת PCR של 20 מיקרוליטר. לאחר השלמת PCR, להפעיל אלקטרופורזה ג'ל agarose כדי לקבוע את הגודל והנוכחות או היעדר של מוצרי PCR, הקפדה להתאים את המצב של אלקטרופורזה ג'ל agarose בהתאם לגודל הצפוי של מוצרי PCR.השתמש בתוצאות PCR לגבי גודל ונוכחות או היעדרות או מוצרי PCR כדי להקצות גנוטיפ לכל עובר לאחר הניתוח ולאחר מכן למיין עוברים על פי הגנוטיפ שלהם. הגנום nematostella יש לוקוס יחיד המקודד חלבון מבשר עבור נוירופפטיד, GLWamide. שלושה אללים מוטנטים נוקאאוט על הלוקוס דווחו בעבר.PCR נובע עוברים שנדגמו באופן אקראי בין צאצאים של צלב F1 בין נקבה הטרוזיגוס אחת נושאת אלל נוקאאוט זכרים הטרוזיגים הנושאים אלל נוקאאוט C להראות גנוטיפים שונים. עוברים 1 ו-2 מציגים רצועת PCR אחת המתאימה לגודל הצפוי של אלל נוקאאוט. עוברים שלוש ושש להראות שתי להקות PCR עם הגדלים הצפויים עבור אללים נוקאאוט A ו- C.Embryos ארבע, שבע, ושמונה להראות להקה אחת PCR המתאים לגודל הצפוי של אלל נוקאאוט C.עובר 5 לא מראה להקות, מה שמרמז על היעדר כריכת פריימר. כדי לשלול את האפשרות של כשל מיצוי DNA גנומי, PCR אחר היה לרוץ באמצעות פריימר הפוך שיכול להיקשר לרצף סוג פראי. כאשר מוצר PCR בגודל צפוי זוהה, מיצוי DNA גנומי היה מוצלח.בעוד שאף מוצר לא הציע כשל בחילוץ. למרות פרוטוקול זה מיועד לעוברים כלנית הים, זה בטוח ניתן ליישם שיטה זו על cnidarians אחרים, כגון אלמוגים מדוזה, שם מידע גנומי ועוברים נגישים. בעקבות הליך זה, המוטנטים שזוהו משמשים להערכת פנוטיפ התפתחותי.לדוגמה, טכניקות היסטולוגיות כגון immunostaining ניתן להשתמש כדי להעריך פגמים במורפולוגיה, בעוד היברידיזציה situ, כמותי בזמן אמת RT-PCR, ו RNA-seq יכול לשמש כדי להעריך פגמים בביטוי גנים. כמו כן, הדמיה חיה יכולה לשמש להערכת פגמים בהתנהגות במהלך התפתחות פוסט-עוברית, כגון בזחלים או בפוליפים מוקדמים.

genotyping-of-sea-anemone-during-early-development

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

Microinjection הוא טכניקה נפוצה בשימוש כדי לספק בונה DNA, mRNAs, אנטיסנס morpholino או טיפולים אחרים לביציות, עובר, ותאים של מינים שונים.

התפוקה microinjections גבוה של zygotes קיפודי הים

Hawaiensis amphipod Parhyale הוא אורגניזם מודל מבטיח ללימודים של אמבריולוגיה הסרטנים ופיתוח arthropod השוואתי ואבולוציה. פרוטוקול זה מתאר שיטה להסרה ידנית של לסטומרים אחד מעוברים בשלב המוקדמים של מחשוף Parhyale.

אבלציה של תא בודד משמונה תאי עוברים של סרטנאים Amphipod<em&gt; Parhyale hawaiensis</em

שיטות המייצרות עוברי morphant חיוניות ללמוד מנגנוני התפתחות ורשתות רגולציה גן. כוכב הים Patiria miniata הוא מערכת מודל מתעורר ללימודים אלה. כאן אנו מציגים פרוטוקול לקבלת תאי רבייה, בהפקת תרבויות של עוברים, וmicroinjection המהיר של zygotes ממין זה.

שיטה לMicroinjection של Minata Patiria Zygotes

מטרת פרוטוקול זה היא לספק למשתמשים סט של שיטות לפירוק קפסולציה בתפוקה גבוהה של עוברים וזחלים של Lymnaea stagnalis כהכנה להכלאה שלמה באתר, ולטיפולים הבאים לפני ואחרי הכלאה.

הר שלם<em&gt; באתרו</em&gt; כלת שיטה עבור חלזון הרכיכות<em&gt; Stagnalis Lymnaea</em

כאן אנו מדגימים כיצד לגרום ולנטר התחדשות בשושנת ים הכוכב Nematostella vectensis, מודל אנתוזואן קנידרי.  אנו מדגימים כיצד לקטוע ולסווג התחדשות באמצעות מערכת בימוי מורפולוגית, ואנו משתמשים במערכת זו כדי לחשוף דרישה לאוטופגיה בהתחדשות מבני פוליפ.

התרמת התחדשות פוליפ שלמה מן Aboral Physa של שושנת ים הכוכבת Nematostella vectensis

במאמר זה וידאו מפרט פשוטה במתודולוגיה vivo, שניתן להשתמש בהם כדי בשיטתיות וביעילות לאפיין מרכיבי מסלולי איתות מורכבות ורשתות רגולטוריות בעוברים חסרי חוליות רבים.

כוחה של פשטות: עובר קיפוד ים כמו<em&gt; ב Vivo</em&gt; מודלים התפתחותי לימוד Cell ל-תא קומפלקס אינטראקציות רשת איתות

המטרה של פרוטוקול זה היא לבצע הכלאה בחיי עיר על דגימות אלמוגים מבוגרים שמוטבע פרפין, למחלקה על גבי מדרון זכוכית. זוהי שיטה איכותי המשמש כדי להמחיש את הביטוי המרחבי לווין אנטי-חוש RNA ברקמות פרפין-מוטבע.

בחיי עיר טכניקות הכלאה פרפין-מוטבע דגימות אלמוגים למבוגרים

פרוטוקול זה מאפשר הדמיה של ביטוי גנים בעובריים Astyanax cavefish. גישה זו פותחה במטרה למקסם את אות של ביטוי גנים, תוך מזעור צביעת הרקע לא ספציפית.

Wholemount ב באתרו הכלאה עבור עוברי Astyanax

עבודה זו מתארת פרוטוקול של תפוקה חצי-גבוהה המאפשרת הדמיה בו של embryogenesis בזמן בו במהירות של 80-100 ס מ עוברים בריצה אחת ללילה. בנוסף, כלי עיבוד תמונה ופריטים חזותיים נכללים כדי לייעל את ניתוח הנתונים. השילוב של שיטות אלה עם זני כתבת מותאמים אישית מאפשר ניטור מפורט של embryogenesis.

שיטת דימות למחצה של תפוקה גבוהה וערכת כלי הדמיה של נתונים כדי לנתח את הפיתוח העובריים של ס. אלאנס

כאן נתאר פרוטוקול להשגת תמצית ארס גולמית משכת ים וזיהוי פעילותה ההמוליטית והפוספוליפאזית.

זיהוי פעילות המוליטית ופוספוליפאזה בתמציות גולמיות מתוך שושנות ים על ידי מאמרים ביו-אסים פשוטים

מוצגת בדיקת משקעים חיסוניים של כרומטין (X-ChIP) כנגד סימן ההיסטון H3K4me3 עבור אורגניזם המודל Exaiptasia diaphana . הספציפיות והיעילות של הבדיקה מאושרות על ידי PCR כמותי וריצוף הדור הבא. פרוטוקול זה מאפשר חקירה מוגברת של אינטראקציות חלבון-דנ"א בשושנת הים E. diaphana.

כרומטין משקעים חיסוניים במערכת המודל Cnidarian Exaiptasia diaphana

למד שיטת גנוטיפינג לא קטלנית לכלנית ימית במהלך ההתפתחות המוקדמת. טכניקה זו מאפשרת זיהוי מוטנטים ב-Nematostella vectensis מבלי להקריב את העובר, ותומכת בניתוח פנוטיפים לאחר ההתפתחות העוברית.

הגנוזות של כלנית ימית במהלך ההתפתחות המוקדמת

גלה סרטונים נוספים