Name: הערכת התגובה החיסונית הסלולר של זבוב הפירות, דרוזופילה melanogaster, שימוש ב Vivo Phagocytosis Assay (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 50 s
Description: חקור מבחן בליעה תאית חיה ב-Drosophila melanogaster לכימות פעילות תאי דם בוגרים. שיטה זו מאפשרת זיהוי גנים חדשים המסדירים תגובות חיסון ומנקי מיקרואורגניזמים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים גונזלס בט ר ו ד ר Aprajita Garg על תמיכה בביצוע הניסויים phagocytosis ויוו. גרנט זרע של ה-NSF UMD מראש, UMD NIH T32 הכשרה, התא, ביולוגיה מולקולרית (מק) ומענקים של פתוגן-פונדקאי אינטראקציות (מדד מחירי הבתים של), מימנו את העבודה הזאת.

1. מכינים את חלקיקי Fluorescein להזרקה
<ol><li>לשקם 10 מ ג של חיידקים זמינים מסחרית, חום-נהרג חלקיקים המסומנת fluorescein (ראה טבלה של חומרים) כדי ריכוז מניות של 10 מ"ג/מ"ל על-ידי הוספת 990 µL עקר 1 x PBS אזיד הנתרן 50 מ מ µL 10. מערבולת לערבב.<ol>
<li>לחלק לשימוש יחיד aliquots µL 8 צינורות 0.2 מ"ל ולאחסן בקופסא כהה ב 4 ° C כדי למזער את רגישות לאור המשויך. הערה: משמר אזיד הנתרן הוא אופציונלי והוא יכול להיות מושמט אם המניות 10 מ"ג/מ"ל נעשים עם PBS עקר 1 x 1 מ"ל, aliquoted, ומאוחסן ב-20 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להפוך את פתרון 10 מ"ל של 5% מאכל ב- PBS 1 x על ידי ערבוב 500 µL מזרק מסונן אוכל ירוק צביעה ו- 9.5 mL x 1 סטרילי PBS.</li>
	<li>רחץ חלקיקים לפני הזרקת להסיר אזיד הנתרן. מיקס 42 µL 1 סטרילי-PBS ו- µL 8 של 10 מ"ג/מ"ל בשפופרת 1.7 מ. צנטריפוגה-מהירות מקסימלית 2.5 דקות בטמפרטורת החדר.<ol>
<li>הסר את תגובת שיקוע, להוסיף 50 µL 1 x PBS צנטריפוגה בכל מהירות מקסימלית 2.5 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>חזור על שלבים 1.3 ו 1.3.1 x 2, עבור סכום כולל של 3 מנקי.</li>
		<li>לאחר השטיפה הסופית למחוק את תגובת שיקוע, מחדש להשעות חלקיקי 1.6 מ"ג/מ"ל ב- 50 µL של 5% מאכל ב- 1 x PBS.</li>
		<li>לעטוף את הצינור בנייר אלומיניום כדי להגן מפני אור. לאחסן ב 4 ° C, למחוק לאחר שבוע אחד.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. מכינים את הזרקת תחנת וזבובים
<ol><li>להכין משטח הזרקה. כדי להזריק עד 4 אחרים של זבובים באותו זמן, שימוש בקלטת מעבדה כדי לחלק זבוב2 CO מלבני פאד לתוך 4 סעיפים. על הספסל ליד המיקרוסקופ, לייעד שטחים כדי למקם את הבקבוקונים ברגע זבובים גויסו על משטח (אחד לכל פינה של כרית).</li>
	<li>מכינים צלוחיות של גיל-מתאימים, 4-7 ימים-זקן, זבובים להזרקה. עבור כל זן להיבדק, להעביר 5 זכרים ונקבות 5 לתוך בקבוקון טריים, עם תוויות של אוכל מוכן לטוס ולשמור על 25 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>להכין את מזרק פנאומטיים (ראה טבלה של חומרים) על-ידי הגדרת המכשיר מצב מתוזמן -100 מילישניות (צרורות קצרים של גז בלחץ לגרש את הנוזל – המאפשר את המשלוח של אמצעי אחסון תת-nanoliter).</li>
	<li>הכינו את שקופיות מיקרוסקופ. לחתוך רצועות 1.5 אינץ של איזולירבנד, מקפלים לתוך לולאה עם הצד דבק החוצה, ולמקם לשקופית שכותרתו מיקרוסקופ.</li>
</ol>3. מכינים מחטים נימי זכוכית
<ol><li>משוך זכוכית מחטים (נימים זכוכית קיר דק) באמצעות של פולר המחט.<ol>
<li>להחזיק את המחט מתחת למיקרוסקופ מיקרומטר, שבור את הקצה באמצעות מלקחיים נירוסטה הצבע בסדר #5. 100 מיקרומטר טיפים מספיקים לחדור לקוטיקולה של הזבוב תוך מזעור ופצעו.</li>
		<li>למדוד את עוצמת הקול של נוזל זה יוזרקו כל זבוב. לטעון את המחט עם 5% סטרילי מאכל ב- PBS 1 x ולגרש את הנוזל על טיפה של שמן מינרלי-מיקרומטר הבמה 0.01 מ מ. הערה: אם ה-droplet נוזלי כדורית, עוצמת הקול של picoliters מחושבת (גודל)3/1910. 30 מחט בקוטר 100 מיקרומטר יפלוט ~ 2 nL ב-100 מילישניות.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. להזריק זבובים
<ol><li>פיפטה µL 10 חלקיקים 1.6 מ"ג/מ"ל אל כיכר קטנה של מצלמות-מיקרוסקופים.<ol>
<li>משוך את הנוזל לתוך המחט והר בתוך הצינור מזרק (ראה טבלה של חומרים).</li>
		<li>עזים ומתנגד זבובים עם CO2 , סדר אותם בשורה באזור המיועד שלהם על flypad, עם הצד הבטני למעלה וראשי הפונה לכיוון החלק הקדמי של משטח. מניחים צלוחיות באזורים המתאימים על הספסל.</li>
		<li>להזריק זבובים בפינה העליונה של הבטן עם משאבות 5, 100 ms של נוזל (~ 10 nL סה כ).</li>
		<li>להעביר את הזבובים מוזרק הבקבוקונים המתאים, שים לב הפעם על המבחנה. לשמור על 25 מעלות צלזיוס.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לטעון מחט חדשה עם 0.4% Trypan Blue פתרון.</li>
	<li>הגדר את מזרק פנאומטיים מגודרת, אשר מאפשר זרם קבוע של אוויר כדי לדחוף את הנוזלים המחט.</li>
	<li>עזים ומתנגד זבובים אחרי שנחו למשך 30 דקות, להזריק Trypan Blue עד הבטן נפוחה ומלאים. הערה: כאשר בחינת ההבשלה phagosome עם חלקיקים עם צבע pH רגיש תוויות, לאפשר זבובים לנוח לשעה, לא להזריק trypan blue לפני הרכבה זבובים.</li>
	<li>הר זבובים על שקופיות מיקרוסקופ עם איזולירבנד, בצד הגחוני למטה. לדחוף את הכנפיים לצד של הזבוב ולאבטח אותם לקלטת. בנוסף, בעדינות לדחוף את הראש לתוך הקלטת כדי להבטיח כי הזבוב לא יזוז.</li>
	<li>מיד לעבור שלב 5.</li>
</ol>5. הדמיה זבובים
<ol><li>התמונה זבובים, אחד בכל פעם, 25 x או 32 x הגדלה באמצעות מיקרוסקופ פלורסצנטיות הפוכה המצורפת ממצלמה דיגיטלית, מחשב (ראה טבלה של חומרים). להתמקד בכלי הגבי של הזבוב באמצעות תוכנת מחשב עבור המצלמה הדיגיטלית.</li>
	<li>להקליט את זמן החשיפה ואת ההגדלה בין ניסויים. הערה: איבוד תחושת אחרים היא מקור פוטנציאלי של שגיאה כאשר מצלמים זנים מרובים במכה אחת. כדי להימנע המטעות זבובים, רשום את מספר התמונה התצלום הראשון והאחרון לטוס עבור כל גנוטיפ.</li>
</ol>6. לכימות, נורמליזציה של קרינה פלואורסצנטית
<ol><li>לפתוח את התוכנה ופתח תמונה אחת בכל פעם.<ol>
<li>למדוד את עוצמת קרינה פלואורסצנטית של כלי השיט הגבי. לצייר מצולע סביב הספינה הגבי. בחר מדד ולהקליט את עוצמת קרינה פלואורסצנטית בתוך המצולע.</li>
		<li>קבע את עוצמת קרינה פלואורסצנטית רקע. להעתיק את המצולע הראשונה ולהעביר אותה לאזור סמוך לכלי השיט הגבי של הזבוב. בחר מדד עוצמת קרינה פלואורסצנטית הרשומה של אזור רקע.</li>
		<li>לנרמל את הכלי הגבי זריחה על-ידי קרינה פלואורסצנטית הרקע: כלי הגבי ÷ רקע.</li>
		<li>לחשב שהממוצע מנורמל עוצמת קרינה פלואורסצנטית כלי הגבי זבובים כל זן.</li>
		<li>חזור על הניסוי 2 פעמים נוספות.</li>
		<li>שימוש תלמיד של אינטראקצית t-test כדי להשוות עוצמות קרינה פלואורסצנטית היחסי רשע זבובים שליטה ולבדוק טסה 3 ניסויים. לחשב את גודל האפקט באמצעות הנוסחה: של כהן d = (ז1- M2) ÷ SDבמאגר, כאשר M1 הוא הממוצע של גנוטיפ 1 ו- M2 הוא הממוצע של גנוטיפ 2 &amp; SD במאגר =<img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/59543/59543eq1.jpg"> כאשר SD1 הוא סטיית התקן של גנוטיפ 1 ו- SD2 הוא סטיית התקן של גנוטיפ 2.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Akira, S., Uematsu, S., Takeuchi, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogen+recognition+and+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Pathogen recognition and innate immunity.</a> Cell. 124 (4), 783-801 (2006).</li>
<li>Kim, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+host-pathogen+interactions+and+innate+immunity+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Studying host-pathogen interactions and innate immunity in Caenorhabditis elegans.</a> Disease Models & Mechanisms. 1 (4-5), 205-208 (2008).</li>
<li>Lemaitre, B., Hoffmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+host+defense+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+Immunology%22%5BJournal%5D)">The host defense of Drosophila melanogaster.</a> Annual Review Immunology. 25, 697-743 (2007).</li>
<li>Wu, L. P., Choe, K. M., Lu, Y., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+Immunity%3A+Genes+on+the+Third+Chromosome+Required+for+the+Response+to+Bacterial+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Drosophila Immunity: Genes on the Third Chromosome Required for the Response to Bacterial Infection.</a> Genetics. 159 (1), 189-199 (2001).</li>
<li>De Gregorio, E., Spellman, P. T., Tzou, P., Rubin, G. M., Lemaitre, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Toll+and+Imd+pathways+are+the+major+regulators+of+the+immune+response+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">The Toll and Imd pathways are the major regulators of the immune response in Drosophila.</a> EMBO Journal. 21 (11), 2568-2579 (2002).</li>
<li>Michel, T., Reichhart, J. M., Hoffmann, J. A., Royet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+Toll+is+activated+by+Gram-positive+bacteria+through+a+circulating+peptidoglycan+recognition+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Drosophila Toll is activated by Gram-positive bacteria through a circulating peptidoglycan recognition protein.</a> Nature. 414 (6865), 756-759 (2001).</li>
<li>Choe, K. M., Werner, T., Stoven, S., Hultmark, D., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+for+a+peptidoglycan+recognition+protein+%28PGRP%29+in+Relish+activation+and+antibacterial+immune+responses+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Requirement for a peptidoglycan recognition protein (PGRP) in Relish activation and antibacterial immune responses in Drosophila.</a> Science. 296 (5566), 359-362 (2002).</li>
<li>Wu, J., Randle, K. E., Wu, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ird1+is+a+Vps15+homologue+important+for+antibacterial+immune+responses+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">ird1 is a Vps15 homologue important for antibacterial immune responses in Drosophila.</a> Cellular Microbiology. 9 (4), 1073-1085 (2007).</li>
<li>Lemaitre, B., Nicolas, E., Michaut, L., Reichhart, J. M., Hoffmann, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dorsoventral+regulatory+gene+cassette+spatzle%2FToll%2Fcactus+controls+the+potent+antifungal+response+in+Drosophila+adults%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The dorsoventral regulatory gene cassette spatzle/Toll/cactus controls the potent antifungal response in Drosophila adults.</a> Cell. 86 (6), 973-983 (1996).</li>
<li>Zambon, R. A., Nandakumar, M., Vakharia, V. N., Wu, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Toll+pathway+is+important+for+an+antiviral+response+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The Toll pathway is important for an antiviral response in Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 102 (20), 7257-7262 (2005).</li>
<li>Lemaitre, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+recessive+mutation%2C+immune+deficiency+%28imd%29%2C+defines+two+distinct+control+pathways+in+the+Drosophila+host+defense%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A recessive mutation, immune deficiency (imd), defines two distinct control pathways in the Drosophila host defense.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 92 (21), 9465-9469 (1995).</li>
<li>Leulier, F., Rodriguez, A., Khush, R. S., Abrams, J. M., Lemaitre, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+caspase+Dredd+is+required+to+resist+gram-negative+bacterial+infection%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">The Drosophila caspase Dredd is required to resist gram-negative bacterial infection.</a> EMBO Reports. 1 (4), 353-358 (2000).</li>
<li>Meister, M., Lagueux, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophilablood+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Drosophilablood cells.</a> Cellular Microbiology. 5 (9), 573-580 (2003).</li>
<li>Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+biology+of+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+Pathology%22%5BJournal%5D)">The cell biology of phagocytosis.</a> Annual Review Pathology. 7, 61-98 (2012).</li>
<li>Anderson, R. A., Sando, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+expression+of+cDNA+encoding+human+lysosomal+acid+lipase%2Fcholesteryl+ester+hydrolase.+Similarities+to+gastric+and+lingual+lipases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Cloning and expression of cDNA encoding human lysosomal acid lipase/cholesteryl ester hydrolase. Similarities to gastric and lingual lipases.</a> Journal of Biological Chemistry. 266 (33), 22479-22484 (1991).</li>
<li>Ross, G. D., Reed, W., Dalzell, J. G., Becker, S. E., Hogg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+cytoskeleton+association+with+CR3+and+CR4+regulates+receptor+mobility+and+phagocytosis+of+iC3b-opsonized+erythrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">Macrophage cytoskeleton association with CR3 and CR4 regulates receptor mobility and phagocytosis of iC3b-opsonized erythrocytes.</a> Journal of Leukocyte Biology. 51 (2), 109-117 (1992).</li>
<li>Elrod-Erickson, M., Mishra, S., Schneider, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+the+cellular+and+humoral+immune+responses+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Interactions between the cellular and humoral immune responses in Drosophila.</a> Current Biology. 10, 781-784 (2000).</li>
<li>Ramet, M., Pearson, A. M., Manfruelli, P., Li, X., Koziel, H., Gobel, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+Scavenger+Receptor+CI+Is+a+Pattern+Recognition+Receptor+for+Bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Drosophila Scavenger Receptor CI Is a Pattern Recognition Receptor for Bacteria.</a> Immunity. 15 (6), 1027-1038 (2001).</li>
<li>Ramet, M., Manfruelli, P., Pearson, A. M., Mathey-Prevot, B., Ezekowitz, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+genomic+analysis+of+phagocytosis+and+identification+of+a+Drosophila+receptor+for+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional genomic analysis of phagocytosis and identification of a Drosophila receptor for E. coli.</a> Nature. 416 (6881), 644-648 (2002).</li>
<li>Philips, J. A., Rubin, E. J., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+RNAi+screen+reveals+CD36+family+member+required+for+mycobacterial+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Drosophila RNAi screen reveals CD36 family member required for mycobacterial infection.</a> Science. 309, 1251-1253 (2005).</li>
<li>Agaisse, H., Burrack, L. S., Philips, J. A., Rubin, E. J., Perrimon, N., Higgins, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+RNAi+screen+for+host+factors+required+for+intracellular+bacterial+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide RNAi screen for host factors required for intracellular bacterial infection.</a> Science. 309 (5738), 1248-1251 (2005).</li>
<li>Stuart, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+to+Staphylococcus+aureus+requires+CD36-mediated+phagocytosis+triggered+by+the+COOH-terminal+cytoplasmic+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Response to Staphylococcus aureus requires CD36-mediated phagocytosis triggered by the COOH-terminal cytoplasmic domain.</a> Journal of Cell Biology. 170 (3), 477-485 (2005).</li>
<li>Stroschein-Stevenson, S. L., Foley, E., O’Farrell, P. H., Johnson, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Drosophila+gene+products+required+for+phagocytosis+of+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Identification of Drosophila gene products required for phagocytosis of Candida albicans.</a> PLoS Biology. 4 (1), e4(2006).</li>
<li>Kocks, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eater%2C+a+transmembrane+protein+mediating+phagocytosis+of+bacterial+pathogens+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Eater, a transmembrane protein mediating phagocytosis of bacterial pathogens in Drosophila.</a> Cell. 123 (2), 335-346 (2005).</li>
<li>Nehme, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relative+roles+of+the+cellular+and+humoral+responses+in+the+Drosophila+host+defense+against+three+gram-positive+bacterial+infections%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Relative roles of the cellular and humoral responses in the Drosophila host defense against three gram-positive bacterial infections.</a> PLoS One. 6 (3), e14743(2011).</li>
<li>Garver, L. S., Wu, J., Wu, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+peptidoglycan+recognition+protein+PGRP-SC1a+is+essential+for+Toll+signaling+and+phagocytosis+of+Staphylococcus+aureus+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The peptidoglycan recognition protein PGRP-SC1a is essential for Toll signaling and phagocytosis of Staphylococcus aureus in Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 103 (3), 660-665 (2006).</li>
<li>Garg, A., Wu, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+Rab14+mediates+phagocytosis+in+the+immune+response+to+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Drosophila Rab14 mediates phagocytosis in the immune response to Staphylococcus aureus.</a> Cellular Microbiology. 16 (2), 296-310 (2014).</li>
<li>Gonzalez, E. A., Garg, A., Tang, J., Nazario-Toole, A. E., Wu, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+glutamate-dependent+redox+system+in+blood+cells+is+integral+for+phagocytosis+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">A glutamate-dependent redox system in blood cells is integral for phagocytosis in Drosophila melanogaster.</a> Current Biology. 23 (22), 2319-2324 (2013).</li>
<li>Nazario-Toole, A. E., Robalino, J., Okrah, K., Corrada-Bravo, H., Mount, S. M., Wu, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Splicing+Factor+RNA-Binding+Fox+Protein+1+Mediates+the+Cellular+Immune+Response+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology+%28Baltimore%2C+Md%3A+1950%29%22%5BJournal%5D)">The Splicing Factor RNA-Binding Fox Protein 1 Mediates the Cellular Immune Response in Drosophila melanogaster.</a> Journal of Immunology (Baltimore, Md: 1950). 201 (4), 1154-1164 (2018).</li>
<li>Guille, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGuille%2C+M+%22Molecular+Methods+in+Developmental+Biology%3A+Xenopus+and+Zebrafish%22">Molecular Methods in Developmental Biology: Xenopus and Zebrafish</a>. , Springer Science & Business Media. (1999).</li>
<li>Koundakjian, E. J., Cowan, D. M., Hardy, R. W., Becker, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Zuker+collection%3A+a+resource+for+the+analysis+of+autosomal+gene+function+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The Zuker collection: a resource for the analysis of autosomal gene function in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 167 (1), 203-206 (2004).</li>
<li>Horn, L., Leips, J., Starz-Gaiano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytic+ability+declines+with+age+in+adult+Drosophila+hemocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Phagocytic ability declines with age in adult Drosophila hemocytes.</a> Aging Cell. 13 (4), 719-728 (2014).</li>
<li>Brennan, C. A., Delaney, J. R., Schneider, D. S., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Psidin+is+required+in+Drosophila+blood+cells+for+both+phagocytic+degradation+and+immune+activation+of+the+fat+body%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Psidin is required in Drosophila blood cells for both phagocytic degradation and immune activation of the fat body.</a> Current Biology. 17 (1), 67-72 (2007).</li>
<li>Akbar, M. A., Tracy, C., Kahr, W. H., Kramer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+full-of-bacteria+gene+is+required+for+phagosome+maturation+during+immune+defense+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The full-of-bacteria gene is required for phagosome maturation during immune defense in Drosophila.</a> Journal of Cell Biology. 192 (3), 383-390 (2011).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

חלקיקים זמינים מסחרית, שכותרתו fluorescently משמשים כדי להעריך phagocytosis באופן כללי (0.2 µm carboxylate-השתנה microspheres) או phagocytosis של חיידקים (שכותרתו fluorescently חום - או כימית להרוג חיידקים או שמרים). כדי להעריך את ההבשלה phagosome, החוקרים יכולים לבחור חלקיקים עם צבע pH רגיש הזה שזוהר כאשר pH מקטין מ ניטראלי כדי חומצי, כמו phagolysosome תוויות. לחלופין, לבחון את השלבים הראשונים של phagocytosis, זיהוי הפתוגן, ספיגת, חוקרים צריך לבחור חלקיקים המסומנות בתגי פלורסנט לזרוח מחוץ לתאים.
<p clas...

מערכות ההגנה החיסוניות מולדת יוצרים את השורה הראשונה של הגנה מפני חיידקים פתוגניים. תגובות אלה ניתן לחלק באופן פונקציונלי לתוך ההורמונאלית וסלולריות מולדת חסינות, אשר שניהם נמצאים מתווך על ידי קולטנים זיהוי התבנית בקידוד germline (PRRs) לחוש פתוגן-הקשורים דפוסי מולקולרית (PAMPs)1. רבים מן המסלולים איתות ומנגנונים אפקטור של מולדת חסינות נשמרים יונקים, חסרי חוליות, כגון של תולעים נימיות, Caenorhabditis elegans, זבוב הפירות, דרוזופילה melanogaster2. זבוב הפירות התפתחה מערכת חזקה ללמוד מארח הגנה מפני מיקרואורגניזמים זיהומיות3. דרוזופילה הוא צייתן גנטית, בקלות ובזול גדלו במעבדות, ויש לו זמן דור קצר. יתר על כן, זבוב הפירות המוצגים ההגנה היעילה ביותר נגד מערך של חיידקים, המאפשר הבחינה של המארח חסינות מפני גורמי מחלה ויראלי, חיידקי, פטרייתי או טפילים.
דרוזופילה immunologists היסטורית מסויימת קדימה מסכי גנטי, הגנום כולו בתיווך RNA הפרעה (RNAi) הקרנה של שורות תאים חרקים, קיימים זנים לעוף מוטנטים לבחון מולדת חסינות – המוביל זיהוי ואפיון של מספר המסלולים החיסונית ההורמונאלית אבולוציונית שנשמרת4,5,6,7,8. התגובה החיסונית מולדת ההורמונאלית, ניתן לטעון, הכי טוב מאופיין ההגנה החיסונית של זבובי פירות. לאחר ההדבקה, התגובה ההורמונאלית מוביל ייצור ושחרור מערכתית של פפטיד מיקרוביאלית (כח) מולקולות לתוך hemolymph, הדם המקביל בחרקים. מגברים המיוצרים על ידי אגרה מאוד שנשמרת Imd מסלולי איתות. מסלול אגרה זה הומולוגי ל בתרבית של קולטן TLR/IL-1R איתות, מסלול Imd הומולוגי ל הגידול נקרוזה מקדם יונקים-אלפא איתות. ב . דרוזופילה, אגרה איתות הנגרמת על ידי חיידקים גראם חיוביים, פטריות ו viru דרוזופילה Xs6,9,10 , Imd איתות הנגרמת על ידי חיידקים גראם שליליים11 ,12.
חסינות תאית, המורכב כימוס, melanization ו- phagocytosis של פתוגנים פולשני, שביצעו תאי דם מיוחד הנקרא hemocytes13. ישנם שלושה סוגים של hemocytes זבוב הפירות: קריסטל תאים, lamellocytes ו- plasmatocytes13. קריסטל תאים, אשר מהווים 5% של hemocytes במחזור של הזחלים, שחרור אנזימים proPhenoloxidase (צע) שמוביל melanization של פתוגנים ורקמות מארח באתרים הפצע. Lamellocytes, אשר לא כלל נמצאים העוברים בריאים או הזחלים, הם תאים חסיד הכומסים חפצים זרים. תאים אלה הם המושרה על pupariation או כאשר הביצים צרעה parasitizing מופקדים הזחלים. Plasmatocytes phagocytic, אשר מהווים 95% של מחזורי hemocytes של הזחלים, כל שנותר hemocytes אצל מבוגרים, לשחק תפקיד רקמת שיפוץ במהלך הפיתוח ולשמש, ראוי לציין, התא אפקטור הראשי של חסינות תאית דרוזופילה .
Phagocytosis קו מיידית וגם קריטיים של ההגנה החיסונית מולדת; חיידקים זה לפרוץ את מחסום האפיתל של המארח במהירות אפף, חוסל על ידי תאי דם phagocytic (לסקירה מקיפה של ביולוגיה של התא של phagocytosis ראה אסמכתא 14). תהליך זה הוא יזם בעת זיהוי תבניות מקודד germline רצפטורים (PRRs) על hemocytes מזהה את הפתוגן הקשורים דפוסי מולקולרית (PAMPs) של חיידקים. פעם קשור אל המטרות שלהם, PRRs ליזום cascades איתות להוביל להיווצרות של pseudopods דרך אקטין שיפוצים שלד התא. Pseudopods מקיפים תא החיידק, אשר לאחר מכן נבלע, הפנימו לתוך אברון המתהווה, phagosome. חיידקים מושמדים כמו phagosome עובר התהליך של התבגרות phagosome כאשר phagosome הוא הנסחר לכיוון הפנים של hemocyte acidifies דרך סדרה של אינטראקציות עם lysosomes. חוץ גופית ו תא לימודי ביולוגיה בתרבית של תאי העיקרי היה אינסטרומנטלי זיהוי ואפיון הגורמים לווסת phagocytosis, כגון בתרבית של קולטן Fc-גמא ו- C3b קולטנים15,16. ובכל זאת, היכולת לבצע מסכי בקנה מידה גדול או לימודים ויוו מוגבלים במערכות יונקים.
כאן נציג של assay ויוו עבור phagocytosis ב זבובי פירות למבוגרים, אשר מבוססת על הליך הוצג לראשונה על ידי המעבדה של דוד שניידר 200017. המעבדה שניידר הראה כי hemocytes sessile אכילת הכלי הגבי בטן בקלות phagocytose חרוזי פוליסטירן וחיידקים. כדי להמחיש phagocytosis, זבובים מוזרקים עם חלקיקים fluorescently שכותרתו (כגון e. coli המסומנת fluorescein isothiocyanate (e. coli -FITC)), מודגרות במשך 30 דקות לאפשר זמן hemocytes להחריב את החלקיקים, ולאחר מכן הזריקו trypan blue, אשר המרווה את זריחה של חלקיקים לא phagocytosed במהלך תקופת הדגירה. כלי הגבי לעוף ואז עם תמונה באמצעות מיקרוסקופ פלורסנט הפוכה. את העבודה הזו, באמצעות ניסוי פשוט יחסית, הדגימו כי hemocytes phagocytose חיידקים, חרוזים לייטקס, הזה phagocytosis חיידקי יכול להיות מעוכב מראש הזרקת טס עם חרוזים לייטקס, ואת זה לא טס בלי הסלולר והן ההורמונאלית תגובות חיסוניות רגישים אפילו e. coli. וזמינותו שהובאו בדו ח זה מתבסס על העבודה של המעבדה שניידר לכמת phagocytosis ויוו על ידי מדידת עוצמת קרינה פלואורסצנטית של חלקיקים נבלע על ידי כלי הגבי הקשורים hemocytes.
בדומה את הגישה במערכות יונקים, גנטיקאים דרוזופילה השתמשו בתחילה ברמת הגנום RNAi במבחנה מסכי לזיהוי גנים הדרושים עבור התגובה החיסונית הסלולר18,19,20 ,21,22,23. עם זאת, התפתחות וזמינותו phagocytosis ויוו למבוגרים מופעלת ניסויים מעקב יבוצע בקלות אצל בעלי חיים שלמה, ובכך מאפשר לחוקרים לוודא הביולוגי את התפקיד של הגורמים שזוהו במחקרים במבחנה. כזה היה המקרה עם הקולטן transmembrane אוכל, אשר זיהה לראשונה את כל קולטן חיידקי במסך RNAi באמצעות S2 תאים24 מוצג מאוחר יותר כדי לתווך Escherichia coli (e. coli), Enterococcus faecalis, , Staphylococcus aureus (S. aureus) phagocytosis מבוגרים25.
במעבדה מועסקים וזמינותו phagocytosis ויוו מסכי גנטי קדימה ולימודים הגנום כולו האגודה (באמצעות את דרוזופילה גנטי הפניה לוח (DGRP)) לזיהוי הרומן גנים המווסתים phagocytosis ב hemocytes למבוגרים. מחקרים אלה הובילו איפיון קולטני PGRP-SC1A, PGRP-SA26, את שלפוחית תאיים סחר חלבון Rab1427, גלוטמט טרנספורטר פוליפמוס28ו RNA-מחייב חלבון פוקס-129.
אנו צופים מסכי לעתיד שילוב של phagocytosis ויוו עלול להוביל הזיהוי של גנים נוספים חשובים עבור התגובה החיסונית הסלולר דרוזופילה. המסכים באמצעות וסודרו באופן מלא שורות המפגרים, כגון DGRP או את דרוזופילה סינתטי האוכלוסייה משאבים (DSPR), ניתן לזהות משתנים טבעיים המשפיעים על התפתחות phagocytosis או hemocyte. יתר על כן, הטכניקה בפרשה מינים אחרים של דרוזופילה או בשימוש למשאבי קהילה חדש המסך, כגון האוסף של 250 מינים דרוזופילה , נשמר על ידי נבחרת דרוזופילה מינים מניות מרכז (NDSSC ) בקורנל. ניסויים אלה יכולים להתבצע באמצעות fluorescently-ידי חיידקי או פטרייתי קיר bioparticles זמינים מסחרית או יכול להתבצע באמצעות מספר כלשהו של חיידקי או פטרייתי מינים – סיפק החיידק מבטאת את סמני פלורסנט .

<table><tbody><tr><td>0.2&mu; m אדום פלואורסצנטי קרבוקסילט שונה FluoSpheres</td><td>Invitrogen</td><td>F8810</td><td>חרוזי לטקס עם תווית פלואורסצנטית לבדיקת יכולת פגוציטית כללית של פגוציטים. (~580/~605 ננומטר) יש להזריק דילול של 1:20 ב-PBS עם 5% צבע.</td></tr><tr><td>5430-10 PicoNozzle Kit</td><td>World Precision Instruments</td><td>5430-10</td><td>מחזיק לחלקיקים ביולוגיים של פיפטה</td></tr><tr><td>E. coli (זן K-12) בגודל 1.0 מ"מ, Alexa Fluor 488 מצומד</td><td>Invitrogen</td><td>E13231</td><td>הרוג E. coli מסומן ב-Alexa Fluor 488. השתמש כדי לבדוק זיהוי וספיגה של פגוציטים של חיידקים גראם שליליים. (~495/~519 ננומטר)</td></tr><tr><td>E. coli (זן K-12) חלקיקים ביולוגיים, Alexa Fluor 594 מצומד</td><td>Invitrogen</td><td>E23370</td><td>הרוג E. coli מסומן ב-Alexa Fluor 594. השתמש כדי לבדוק זיהוי וספיגה של פגוציטים של חיידקים גראם שליליים. (~590/~617 ננומטר)</td></tr><tr><td>E. coli (זן K-12) חלקיקים ביולוגיים, פלואורסצאין מצומד</td><td>Invitrogen</td><td>E2861</td><td>הרוג E. coli מסומן ב-FITC (פלואורסצאין). השתמש כדי לבדוק זיהוי וספיגה של פגוציטים של חיידקים גראם שליליים. (~494/~518 ננומטר)</td></tr><tr><td>E. coli (K-12 Strain) חלקיקים ביולוגיים, טקסס אדום מצומד</td><td>Invitrogen</td><td>E2863</td><td>הרוג E. coli מסומן בטקסס אדום. השתמש כדי לבדוק זיהוי וספיגה של פגוציטים של חיידקים גראם שליליים. (~595/~615 ננומטר)</td></tr><tr><td>E. coli (K-12 Strain) חלקיקים ביולוגיים, טקסס אדום מצומד</td><td>Invitrogen</td><td>E2863</td><td>הרוג E. coli מסומן בטקסס אדום. השתמש כדי לבדוק זיהוי וספיגה של פגוציטים של חיידקים גראם שליליים. (~595/~615 ננומטר)</td></tr><tr><td>חולץ פיפטות מחט</td><td>דיוויד קופף מכשירים</td><td>דגם 725</td><td></td></tr><tr><td>pHrodo Red E. coli BioParticles מצומדים לפגוציטוזיס</td><td>Invitrogen</td><td>P35361</td><td>הרוג E. coli מסומן ב-pHrodo Red. השתמש כדי לבדוק התחדשות פגוציטים, ספיגה והתבגרות פגוזומים של חיידקים גראם שליליים. (~560/~585 ננומטר). אין צורך להרוות עם Trypan Blue.</td></tr><tr><td>pHrodo Red S. aureus BioParticles מצומדים ל-Phagocytosis</td><td>Invitrogen</td><td>A10010</td><td>Killed S. aureus מסומן ב-pHrodo Red. השתמש לבדיקת התחדשות, ספיגה והתבגרות פגוזומים של חיידקים גראם-פוזיטיביים. (~560/~585 ננומטר). אין צורך להרוות עם Trypan Blue.</td></tr><tr><td>Pneumatic PicoPump PV820</td><td>World Precision Instruments</td><td>SYS-PV820</td><td>World Precision Instruments Pneumatic PicoPump PV820 משתמש בלחצים דיפרנציאליים כדי להחזיק נוזל במחט הזכוכית בין הזרקות. המשתמש שולט באופן ידני בפרצי לחץ גז קצרים כדי להוציא את הנוזל &ndash; המאפשר אספקה של נפחים תת-ננו-ליטר. כמות הנוזל המועברת תלויה בשני משתנים עיקריים &ndash; גודל פתח מחט הזכוכית ומשך הזמן שמופעל לחץ הזרקה. הגדר את המכשיר ל-100 אלפיות השנייה " מתוזמן" מצב.</td></tr><tr><td>S. aureus (זן עץ ללא חלבון A) BioParticles, Alexa Fluor 488 מצומד</td><td>Invitrogen</td><td>S23371</td><td>Killed S. aureus מסומן ב-Alexa Fluor 488. השתמש לבדיקת זיהוי פגוציטים וספיגה של חיידקים גראם חיוביים. (~495/~519 ננומטר)</td></tr><tr><td>S. aureus (זן עץ ללא חלבון A) BioParticles, Alexa Fluor 594 מצומד</td><td>Invitrogen</td><td>S23372</td><td>הרג S. aureus מסומן ב-Alexa Fluor 594. השתמש לבדיקת זיהוי פגוציטים וספיגה של חיידקים גראם חיוביים. (~590/~617 ננומטר)</td></tr><tr><td>S. aureus (זן עץ ללא חלבון A) BioParticles, Fluorescein מצומד</td><td>Invitrogen</td><td>E2851</td><td>הרוג S. aureus מסומן ב-FITC (Fluorescein). השתמש לבדיקת זיהוי פגוציטים וספיגה של חיידקים גראם חיוביים. (~494/~518 ננומטר)</td></tr><tr><td>נימי זכוכית דקים</td> Wall <td>Precision Instruments</td><td>TW100F-3</td><td>מחטים להזרקה. OD = 1.0 מ"מ</td></tr><tr><td>תמיסת טריפן כחולה (0.4%)</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td>משמש לכיבוי פלואורסצנטיות חוץ-תאית של חלקיקים המסומנים ב-Fluorescein, Alexa Fluor או Texas Red.</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ ZEISS SteREO (Discovery.V8)</td><td>Zeiss</td><td>SteREO Discovery.V8</td><td>מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך להדמיית זבובים. השתמש במצלמה דיגיטלית (לדוגמה: מצלמת AxioCam HC) ובתוכנה הנלווית (לדוגמה: תוכנת AxioVision 4.7) כדי לצלם תמונות.</td></tr><tr><td>Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) חלקיקים ביולוגיים, Alexa Fluor 488 מצומד</td><td>Invitrogen</td><td>Z23373</td><td>נהרג מסומן ב-Alexa Fluor 488. השתמשו כדי לבדוק זיהוי פגוציטים וספיגה של שמרים. (~495/~519 ננומטר)</td></tr><tr><td>Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) חלקיקים ביולוגיים, Alexa Fluor 594 מצומד</td><td>Invitrogen</td><td>Z23374</td><td>נהרג מסומן ב-Alexa Fluor 594. השתמשו כדי לבדוק זיהוי פגוציטים וספיגה של שמרים. (~590/~617 ננומטר)</td></tr><tr><td>Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) חלקיקים ביולוגיים, מצומד פלואורסצאין</td><td>Invitrogen</td><td>Z2841</td><td>נהרג מסומן ב-FITC (פלואורסצאין). השתמשו כדי לבדוק זיהוי פגוציטים וספיגה של שמרים. (~494/~518 ננומטר)</td></tr><tr><td>Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) חלקיקים ביולוגיים, טקסס אדום</td><td>Invitrogen</td><td>Z2843</td><td>נהרג מסומן באדום טקסס. השתמשו כדי לבדוק זיהוי פגוציטים וספיגה של שמרים. (~595/~615 ננומטר)</td></tr></tbody></table>

הערכת התגובה החיסונית הסלולר של זבוב הפירות, דרוזופילה melanogaster, שימוש ב vivo phagocytosis assay

Assessing the Cellular Immune Response of the Fruit Fly, Drosophila melanogaster, Using an In Vivo Phagocytosis Assay

כל בעלי החיים, מולדת חסינות מספקת של הגנה חזקה ומיידית נגד קשת רחבה של פתוגנים. תגובות חיסוניות ההורמונאלית וסלולריות הענפים העיקריים של מולדת חסינות הינם רבים הגורמים ויסות התגובות הללו אבולוציונית נשמרים בין חסרי חוליות, יונקים. Phagocytosis, היא מרכיב מרכזי של מולדת חסינות תאית, מבוצעת על ידי תאים מיוחדים דם של המערכת החיסונית. זבוב הפירות, דרוזופילה melanogaster, התפתחה מודל גנטי חזק כדי לחקור את המנגנונים המולקולריים ואת ההשפעות הפיזיולוגיות של phagocytosis בבעלי חיים שלם. כאן אנחנו מדגימים מבוססת על הזרקת phagocytosis ויוו assay לכמת את ספיגת החלקיקים ואת הרס על ידי דרוזופילה כדוריות הדם, hemocytes. ההליך מאפשר לחוקרים הבקרה בדיוק את ריכוז החלקיקים ואת המינון, מאפשר להשיג תוצאות מאוד לשחזור בתוך זמן קצר. הניסוי הוא כמותי, קל לביצוע, וניתן להחילם על המסך עבור גורמים מארח את זיהוי פתוגן השפעת ספיגת, סיווג.

תיאור סכמטי של וזמינותו phagocytosis ויוו באמצעות חלקיקים התווית על-ידי fluorescein מוצג איור 1A. זבובים הם נטענים בצד הגחוני למטה על פיסת סרט בידוד והוא קודם שני מגזרים של הבטן, איפה נמצא כלי הקיבול הגבי, נראה בבירור (איור 1B). מפתח מקורות השגיאה ניסיוני עולות על הזריקה והדמיה השלבים של ההליך (איור 1C). שימוש באותה המחט להזריק זבובים מרובים עלול לגרום לה סתומים עם רקמת לעוף או חלקיקים (העליון פאנל ש...

פרוטוקול זה מתאר וזמינותו של phagocytosis ויוו ב מבוגרים דרוזופילה melanogaster לכמת פגוציט הכרה ואישור של זיהומים חיידקים.

הערכת התגובה החיסונית הסלולר של זבוב הפירות, דרוזופילה melanogaster, שימוש ב Vivo Phagocytosis Assay

In all animals, innate immunity provides an immediate and robust defense against a broad spectrum of pathogens. Humoral and cellular immune responses are ...

בדיקה זו של vivo phagocytosis מאפשרת לחוקרים לבצע מסכים גנטיים וחוקרים של אסוציאציה כלל-גנומית כדי לזהות גנים חדשניים המווסתים phagocytosis בתאי דם בוגרים. ניסוי זה הוא כמותי, קל לביצוע, ו ניתן ליישם אותו על הקרנת בעלי חיים חיים עבור גורמים מארחים המשפיעים על זיהוי פתוגן, ספיגה וסיווג. לאחר משיכת נימי זכוכית דקים עם מושך מחט, השתמש במיקרומטר כדי להחזיק את המחט מתחת למיקרוסקופ, ולהשתמש פינצטה מספר חמש, נקודה עדין, נירוסטה כדי לשבור את הקצה לקוטר קצה 100 מיקרומטר.כדי למדוד את נפח הנוזל כי יוזרק לתוך כל זבוב, לטעון מחט נימי עם 5% צבעי מזון סטרילי PBS, ולגרש את הנוזל על טיפת שמן מינרלי על מיקרומטר שלב 0.01 מילימטר. לוותר על 10 microliters של 1.6 מיליגרם לכל חלקיקים מיליליטר על ריבוע קטן של Parafilm, ולמשוך את הנוזל לתוך המחט. הר את המחט לתוך הזרבובית מזרק, ומרפדים את זבובים הרדמה לאורך האזור המיועד שלהם על כרית לטוס, צד הגחוני למעלה, עם הראשים מכוונים לכיוון החלק הקדמי של כרית.מניחים את הבקבוקונים באזורים המתאימים על הספסל, ומזריקים את הזבובים בפינה העליונה של הבטן עם חמש, משאבות 100 אלפיות שנייה של נוזלים כדי לספק כ -10 ננוליטר של חלקיקים בסך הכל. להעביר כל זבוב לתוך הבקבוקון המתאים כפי שהוא מוזרק, ונוי על הזמן על הבקבוקון. לאחר מכן, לטעון מחט חדשה עם 0.4% פתרון טריפאן כחול, ולהגדיר את מזרק פנאומטי מגודר, כדי לאפשר זרימה מתמדת של אוויר לדחוף את הנוזל מתוך המחט.30 דקות לאחר ההזרקה הראשונית, להזריק כל בטן זבוב עם טריפאן כחול עד הבטן מלאים ונומרד. הר את הזבובים על מגלשות מיקרוסקופ עם סרט חשמלי, צד גחוני למטה, דוחף את הכנפיים לצד הזבוב כדי לאבטח אותם לקלטת. לאחר מכן, בעדינות לדחוף את הראש לתוך הקלטת כדי להבטיח כי הזבוב לא יזוז.מיד לאחר שכל הזבובים אובטחו, תדמיינו את החרקים, בזה אחר זה, בהגדלה של פי 25 או 32 במיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך המחובר למצלמה דיגיטלית ולמחשב, תוך התמקדות בכלי הגב של כל זבוב באמצעות תוכנת המחשב למצלמה הדיגיטלית. לאחר מכן, רשום את זמן החשיפה וההגדלה בין הניסויים. כדי לכמת את הפלואורסצנטיות, פתח תוכנית ניתוח הדמיה מתאימה ופתח תמונה אחת.כדי למדוד את עוצמת הפלואורסצנטיות של כלי הגב, צייר מצולע סביב כלי הגב, ובחר למדוד כדי לתעד את עוצמת הפלואורסצנטיות בתוך המצולע. כדי לקבוע את עוצמת הפלואורסצנטיות ברקע, העתק את המצולע הראשון והזז אותו לאזור הסמוך לכלי הגב של כל זבוב. לאחר מכן, בחרו 'מדידה' והקליטו את עוצמת הפלואורסצנטיות של אזור הרקע.כדי לנרמל את פלואורסצנטיות כלי הגב על ידי פלואורסצנטיות הרקע, לאחר מדידת עוצמות פלואורסצנטיות של שאר הזבובים, לחלק את פלואורסצנטיות כלי הגב על ידי פלואורסצנטיות הרקע, ולחשב את עוצמת פלואורסצנטיות כלי הגב מנורמל הממוצע של כל הזבובים בזן אחד. לאחר רכוב בצד הגחוני למטה על פיסת סרט חשמלי, שני החלקים הראשונים של הבטן, שבו כלי הגב ממוקם, גלויים בבירור. מקורות עיקריים של שגיאה ניסיונית מתעוררים בשלבי ההזרקה וההדמיה של ההליך.שימוש באותה מחט כדי להזריק זבובים מרובים עלול לגרום לו להיות סתום עם רקמת זבוב או חלקיקים. זבובים שלא מקבלים מספיק פלואורסצנטיות כחולה טריפאן בבהירות לאורך כל הבטן שלהם, אשר יכול להפחית את היחס של כלי הגב אל פלואורסצנטיות הרקע, ובכך להקטין את יחס עוצמת הפלואורסצנטיות האמיתי של החיה. זבובים צריכים להצטלם בעודם משותקים על ידי פחמן דו חמצני, כיוון שזבובים נעים באופן פעיל מייצרים תמונות מטושטשות שלא ניתן לכמת.קו מוטנטים מאוסף צוקר של זבובים שטופלו באתיל מתנסולפונט אינם מסוגלים לפגוציטוז חיידקים גרם שליליים וגרם חיוביים ומציג כמעט שום פלואורסצנטיות של כלי הגב בהסתע in vivo phagocytosis, יחד עם זן צוקר הרקע היזוגניים ועוד זן בקרת מעבדה נפוץ. עקוב אחר הזמן והסדר שבו מוזרקים זבובים כדי להבטיח שזבובים נמצאים בשלבים דומים של זיהוי פתוגן וקליטה בעת הדמיה. ניתן לקבוע את המנגנונים המולקולריים שבבסיס פגמים פאגוציטים על ידי לימוד המוציטים בודדים עם מיקרוסקופיה קונפוקרטית או לאחר מיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות או על ידי בידוד חרוזים מגנטי של המוציטים בוגרים.

assessing-cellular-immune-response-fruit-fly-drosophila-melanogaster

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

כדי להבין את קשר בין התגובה החיסונית ובהתנהגות, שאנו מתארים שיטה למדידת התנהגות רצוניים...

מדידת כמותית של התגובה החיסונית ובשינה<em&gt; דרוזופילה</em

סרטון זה מתאר כיצד לבצע הזרקה של זבובים בוגרים חיים וכולל פרוטוקול לדוגמה שבו חלקיקים מסומנים וטריפאן כחול מוזרקים בבטן הזבוב כדי להעריך פגוציטוזה.

הזרקה של זבובי דרוזופילה בוגרים: שיטה של משלוח תרכובת או תווית

סרטון זה מדגים טכניקת צביעה חיסונית כדי לדמיין בליעת תאים אפופטוטיים בתאים עובריים הומוגניים של Drosophila melanogaster. שיטה זו מספקת תובנות לגבי הפיזיולוגיה התאית על ידי קביעת מידת הבליעה של תאים אפופטוטיים.

בדיקת פגוציטוזיס: טכניקה של צביעה חיסונית כדי לדמיין בליעת תאים אפופטוטיים בתאים עובריים של Drosophila melanogaster

סרטון זה מדגים בדיקת in vivo שנועדה למדוד פגוציטוזה חיידקית בזבובי דרוזופילה בוגרים. בעקבות הזרקת חיידקים בעלי תווית פלואורסצנטית לבטנם של זבובים בוגרים, המוציטים הקשורים לכלי הדם הגבי עוסקים בפאגוציטוזה. הכנסת צבע כחול טריפאן משמשת כדי להרוות את הפלואורסצנטיות הנפלטת על ידי חיידקים חוץ-תאיים, שאינם פגוציטוזיים. תהליך מרווה זה משפר את הזיהוי של חיידקים phagocytosed כאשר נצפה תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

בדיקת In Vivo לכימות פגוציטוזה חיידקית בזבובי דרוזופילה בוגרים

Drosophila melanogaster הוא אורגניזם מודל יוצא דופן לחקר מערכות חיסון מולדות וההשלכות הפיזיולוגיות של זיהום ומחלות. פרוטוקול זה מתאר כיצד לספק זיהומים חיידקיים חזקים וניתנים לחזרה כמותית ל-D. melanogaster, וכיצד למדוד לאחר מכן את חומרת הזיהום ולכמת את התגובה החיסונית של המארח.

זיהום חיידקים מערכתי וחיסון ביטחון פנוטיפים ב<em&gt; דרוזופילה melanogaster</em

תאי דם דרוזופילה, או המוציטים, עוברים בין אתרי מגורים למחזור הדם.  בזחל, המוציטים תושבים (יושבים) מתמקמים במיקרו-סביבות אינדוקטיביות, הכיסים ההמטופויאטיים, בעוד המוציטים במחזור נעים בחופשיות בהמולימפה. מטרת פרוטוקול זה היא בידוד וכימות סטנדרטיים של שתי אוכלוסיות ההמוציטים הללו, הנבדלות מבחינה התנהגותית אך משתנות זו בזו.

אוכלוסיות תאי דם Assaying של<em&gt; תסיסנית melanogaster</em&gt; זחל

בדיקת FEeder (CAFE) היא שיטה פשוטה, ידידותית לתקציב ואמינה ביותר לחקירת מנגנונים העומדים בבסיס צריכת מזון. בשימוש עם אורגניזם המודל הגנטי הרב-תכליתי Drosophila melanogaster, הוא מספק אמצעי רב עוצמה להשגת תובנות חדשות לגבי מנגנוני ויסות צריכת מזון.

את assay נימי מזין מודד צריכת המזון ב<em&gt; תסיסנית</em

אנו כאן לתאר assay phagocytosis באמצעות תאים עובריים מפוזרים של תסיסנית . זה מאפשר לנו בקלות ובמדויק לכמת רמות phagocytosis vivo , וכדי לזהות מולקולות חדשות הנדרשות phagocytosis של תאים אפופטוטיים.

Assay Phagocytosis עבור תאים אפופטוטיים ב תסיסנית עוברים

שיטה זו מדגימה כיצד להמחיש הפתוגן הפלישה לתוך תאים חרקים עם דגמים תלת ממדיים (3D). Hemocytes של הזחלים דרוזופילה נדבקו בנגיף פתוגנים נגיפי או חיידקי, או vivo לשעבר או ויוו. Hemocytes נגוע היו לאחר מכן קבועה, צבעונית עבור הדמיה עם מיקרוסקופ קונפוקלי, עוקבות שיחזור תאי תלת-ממד.

החילוץ של Hemocytes של הזחלים דרוזופילה melanogaster זיהום מיקרוביאלי וניתוח

פרוטוקול זה מתאר בvivo של פאיגוציטוזה המשמש להערכת ולכמת את היכולת של דרוסופילה מלאנוזוזה בגיל צעיר ומיושן לחיידק הפאגוציטוז.

הערכת היכולת הייחודית ביותר לגיל מיוחד למבוגרים דרוזופילה מלאנוטציטים באמצעות שיטת בVivo פגוציטוזה

פרוטוקול זה מתאר שיטה יעילה וזולה המשתמשת במדיה נוזלית כדי להעריך את ההשפעות של רעלים כימיים על הכדאיות של Drosophila melanogaster בוגר.

הערכת רעילות כימית במלנוגסטר דרוזופילה למבוגרים

חקור מבחן בליעה תאית חיה ב-Drosophila melanogaster לכימות פעילות תאי דם בוגרים. שיטה זו מאפשרת זיהוי גנים חדשים המסדירים תגובות חיסון ומנקי מיקרואורגניזמים.

הערכת התגובה החיסונית הסלולר של זבוב הפירות, דרוזופילה melanogaster, שימוש ב Vivo Phagocytosis Assay

גלה סרטונים נוספים