Name: דור של Organoids של צינורות המרה Extrahepatic העכבר (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: למדו לייצר אורגנואידים תלת-ממדיים מצינורות המרה extrahepatic בעכבר לחקר ביולוגיית כולנגיוציטים. שיטה זו מאפשרת גידול תאים אפיתליים מקוטבים לחקר התחדשות רקמות ואינטראקציות בין תאיות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי האגודה האמריקאית את פרס מחקר של פסגת מחלות הכבד (ל. נ) מכוני הבריאות הלאומיים, במכון הלאומי של סוכרת ואת העיכול ומחלות כליה (פרסים P30 DK34933 נ, DK062041 P01 כדי J.L.M.). אנו מודים ד ר רמון Ocadiz-רואיז (אוניברסיטת מישיגן) על העזרה שלו עם פיתוח מתודולוגיה זו.

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) של אוניברסיטת מישיגן.
1. הכנת ציוד וחומרים לבידוד EHBD העכבר
<ol><li>להכין בינונית זריעה, מאגר כביסה (טבלה של חומרים) ב- 50 מ ל צינורות חרוט ולשמור אותם ב 4 ° C או על קרח עד השימוש.</li>
	<li>בצע כיוונון טבלה כירורגי (איור 1B). להכין כלי כירורגי סטיריליים (איור 1C).</li>
	<li>מניחים צלחת 24-ובכן סטרילי בחממה תרביות רקמה 37 ° C כדי לחמם אותה.</li>
	<li>במקום של aliquot של מטריקס במרתף על קרח. השתמש במרתף מטריקס רק כאשר זה הוא נוזלי לגמרי.</li>
</ol>2. EHBD בידוד ותרבות תא צורב בכיס המרה
<ol><li>
בידוד והכנה של השעיה תא בודד של העכבר EHBD
	<ol>
<li>המתת חסד של העכבר למבוגרים (שגילן עולה על 2 חודשים) על פי הנחיות מוסדיים. הנח את העכבר במצב פרקדן. פתח הבטני תוך שימוש בגישה קו האמצע, תמשוך את הכבד על הסרעפת.</li>
		<li>לזהות את צינור המרה ממוקם ממש מתחת hilum בכבד על ידי משיכה עדינה התריסריון צינתור עם עוצר דימום. להפריד בין EHBD לבין הרקמות הסובבות באמצעות סכין ומהדקים. מחזיק בסוף צינור המרה צינתור עם מלקחיים, לנתח את זה יש מעל החיבור שלה עם התריסריון ולאחר מכן לנתח הסוף הפרוקסימלית של התעלה מהכבד (איור 1D). מיד מקום מבודד EHBD (איור 1E) אל תוך קר שטיפה מאגר.</li>
		<li>הסר את EHBD מתוך המאגר כביסה, מינצ למקטעים 0.5 מ מ בעזרת סכין האזמל סטרילי. מניחים את הרקמה על צלחת זכוכית על קרח במהלך ההליך (איור 1B).</li>
		<li>במקום הסעיפים EHBD לתוך צינור המכיל 500 µL של המאגר דיסוציאציה. תקופת דגירה של 20 דקות ב 37 º C. לנטרל את המאגר דיסוציאציה על-ידי הוספת 500 µL תא קר כקרח תרבות בינוני.</li>
		<li>Triturate התליה תא למעלה ולמטה מתקדם באמצעות מחטים 18 G ו 20 גרם, 20 פעמים כל אחד. לסנן את המתלים תא דרך מסננת תא מיקרומטר 70 ולאסוף את הזרימה דרך צינור 50 מ. הערה: תנאי קדם את מסננת עם µL 500 תמיסת סטרילית באגירה פוספט (PBS) לפני הסינון כדי להקל את המעבר של התליה תא.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
הקמת EHBD organoids
	<ol>
<li>צנטריפוגה הזרימה דרך מהשלב 2.1.5 ב x 300 גרם במשך 5 דקות ב 4 º C.</li>
		<li>הסר בזהירות את תגובת שיקוע. Resuspend תאי 1 מ"ל של PBS סטרילי קר כקרח. להעביר את resuspension לתוך צינור 1.5 mL החדש. חזור על שלב 2.2.1.</li>
		<li>לאחר צנטריפוגה, הסר בזהירות את תגובת שיקוע מתאי שטף שנאספו בתחתית צינור. Resuspend בגדר תא ב- 120 µL של מטריקס המרתף כקרח נוזלי על-ידי pipetting למעלה ולמטה באמצעות P200 טיפים. הערה: תא resuspension צנפה במטריצת המרתף חייב להתבצע על אמבטיית קרח.</li>
		<li>צלחת µL 40 של resuspension תא במטריצה המרתף למרכז באר צלחת 24-ובכן ומחוממת מראש. הערה: הימנע suctioning אוויר זמן מניפולציה מטריקס המרתף כדי למנוע היווצרות בועה.</li>
		<li>להחזיר את הצלחת עם תאים resuspended במטריצת המרתף כדי החממה תרביות רקמה 37 º C למשך 15 דקות, או עד פני השטח למוצק המרתף מטריקס. הוסף 600 µL של המדיום זריעה חימם עד 37 ° C עד מכל קידוח (טבלה של חומרים). להחזיר את הצלחת החממה תרביות רקמה 37 º C.</li>
		<li>החלף את המדיום זריעה 600 µL של המדיום תרבות תא צורב טריים 3 ימים, כל 3 ימים לאחר מכן. צג צמיחה תא צורב עם מיקרוסקופ הפוכה. שימוש organoids עבור יישום במורד הזרם או פיצול כל 7 עד 9 ימים לפני הצטברות של צמצום פסולת, תא צורב intraluminal שנצפו (איור 2 א).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. EHBD תא צורב מעבר ואחסון
<ol><li>
מעבר של EHBD organoids 1:3 ל- 1:4 כל 7-9 ימים
	<ol>
<li>להסיר את המדיום מן הבאר ולהוסיף µL 400 ל- PBS קר כקרח. Resuspend את organoids על ידי בעדינות pipetting את התערובת למעלה ולמטה פי 10 בתוך הבאר. להעביר את התערובת צינור 1.5 מ.</li>
		<li>המעבר התערובת דרך מחט 25 גרם 4 פעמים לנתק את organoids. Centrifuge את התערובת ב x 400 g למשך 4 דקות ב 4 º C.</li>
		<li>הסר בזהירות את תגובת שיקוע resuspend התאים במטריצת המרתף (1:3 ל- 1:4) עבור נוסף culturing (שלב 2.2.4.) או לשטוף את התאים עם PBS קר קרח עיבוד נוסף. הערה: בדרך כלל, 250-300 תאים הם מצופה על המשקולת 24-ובכן ליישומים במורד הזרם. ציפוי יעילות יכול להיות מוערך על ידי מיקרוסקופיית שדה בהיר באמצעות מיקרוסקופ הפוכה על יום 3-5 לאחר passaging על ידי ספירת מספר organoids וחישוב שלהם אחוזים ממספר תאים הראשונית. mRNA יכול להיות מבודד EHBDOs שטף ב- PBS באמצעות פרוטוקול סטנדרטי באמצעות guanidinium thiocyanate-פנול-כלורופורם החילוץ.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
אחסון לטווח ארוך של EHBD organoids
	<ol>
<li>להסיר את המדיום מן הבאר ולשטוף את organoids עם טמפרטורת החדר PBS. הסר PBS מן הבאר מבלי להפריע הירידה מטריקס במרתף.</li>
		<li>להוסיף 500 µL של תא קר כקרח קפוא בינוני אל הבאר. בעדינות resuspend את organoids מטריקס המרתף נוזלי, תא הקפאה בינוני ולהעביר את התערובת לתוך מבחנות הקפאה.</li>
		<li>אחסן הבקבוקונים ב-80 מעלות צלזיוס במשך 48 ה העברת את הבקבוקונים למיכל חנקן לאחסון לטווח ארוך שלב אדי.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. EHBD Pprocessing תא צורב להטבעת פרפין
<ol><li>Resuspend את EHBDOs ב µL 500 ל- PBS קר כקרח (4 ° C) על ידי pipetting למעלה ולמטה 5 כדי 10 פעמים. איסוף EHBDO resuspended במטריצת המרתף נוזלי בשפופרת 1.5 mL. הערה: כדי למנוע את שבירת organoids, לחתוך את החלק התחתון 2-3 מ מ טיפ P1000 ולהסיר את תגובת שיקוע בזהירות רבה.</li>
	<li>צנטריפוגה organoids EHBD ב x 350 גרם במשך 5 דק הסר בזהירות את תגובת שיקוע מבלי להפריע בגדר תא צורב.</li>
	<li>להוסיף 1 מ"ל של 4% קר כקרח paraformaldehyde (PFA) organoids, דגירה של organoids % 4 מחברים בין לילה ב 4 º C. להסיר 4% כדורגלן מ organoids באמצעות טיפ P1000 לאחר דגירה בין לילה.</li>
	<li>להוסיף 1000 µL של טמפרטורת החדר PBS ברכבת התחתית עם organoids, תקופת דגירה של 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT). Centrifuge ברכבת התחתית עם organoids ב- PBS ב 350 x גרם במשך 5 דק. חזור על תהליך זה פעמיים נוספות.</li>
	<li>הסר PBS ולהוסיף 1 מ"ל של 30% כוהל organoids. תקופת דגירה של 5 דקות ב- RT.</li>
	<li>Centrifuge את הצינור ב x 350 גרם במשך 5 דקות-הסר RT. 30% אתנול. להוסיף 1 מ"ל אתנול 70% ולאחר תקופת דגירה של 5 דקות ב- RT.</li>
	<li>Centrifugate ב 350 x גרם במשך 5 דק הסר 70% אתנול. להוסיף 1 מ"ל אתנול 100%, נדרשת תקופת דגירה של 5 דקות ב- RT. הערה: Organoids ניתן לשמור ב- 100% אתנול בטמפרטורת החדר במשך עד 48 שעות לפני עיבוד נוסף.</li>
	<li>מחממים ג'ל עיבוד הדגימה במיקרוגל 20 s או עד מעובה. הוסף µL 50 של הדגימה עיבוד ג'ל לתוך הצינור עם organoids. מניחים את הצינור על הקרח עד פני השטח למוצק הדגימה עיבוד ג'ל.</li>
	<li>הסר את טיפת הדגימה עיבוד ג'ל עם organoids ברכבת התחתית והציבו בין הידיות ספוג כחול ב קלטת לשם עיבוד נוסף במעבד רקמות. לשימוש 15 דקות בכל שלב ושלב embedder פרפין במהלך עיבוד נוסף.</li>
	<li>סעיף פרפין-מוטבע organoids הדגימה עיבוד ג'ל ב 4 מיקרומטר. להמשיך עם immunohistochemical מכתים כפי שתואר לעיל16.</li>
</ol>

<ol><li>Lazaridis, K. N., LaRusso, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Cholangiopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Mayo+Clinic+Proceedings%22%5BJournal%5D)">The Cholangiopathies.</a> Mayo Clinic Proceedings. 90 (6), 791-800 (2015).</li>
<li>Carpino, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem%2FProgenitor+Cell+Niches+Involved+in+Hepatic+and+Biliary+Regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">Stem/Progenitor Cell Niches Involved in Hepatic and Biliary Regeneration.</a> Stem Cells International. 2016, 3658013(2016).</li>
<li>DiPaola, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+intramural+epithelial+networks+linked+to+peribiliary+glands+that+express+progenitor+cell+markers+and+proliferate+after+injury+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Identification of intramural epithelial networks linked to peribiliary glands that express progenitor cell markers and proliferate after injury in mice.</a> Hepatology. 58 (4), 1486-1496 (2013).</li>
<li>Venter, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+functional+characterization+of+extrahepatic+cholangiocyte+lines+from+normal+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Digestive+And+Liver+Disease%22%5BJournal%5D)">Development and functional characterization of extrahepatic cholangiocyte lines from normal rats.</a> Digestive And Liver Disease. 47 (11), 964-972 (2015).</li>
<li>Glaser, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+and+functional+heterogeneity+of+the+mouse+intrahepatic+biliary+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratry+Investigation%22%5BJournal%5D)">Morphological and functional heterogeneity of the mouse intrahepatic biliary epithelium.</a> Laboratry Investigation. 89 (4), 456-469 (2009).</li>
<li>Cardinale, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multipotent+stem%2Fprogenitor+cells+in+human+biliary+tree+give+rise+to+hepatocytes%2C+cholangiocytes%2C+and+pancreatic+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Multipotent stem/progenitor cells in human biliary tree give rise to hepatocytes, cholangiocytes, and pancreatic islets.</a> Hepatology. 54 (6), 2159-2172 (2011).</li>
<li>De Assuncao, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+characterization+of+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cholangiocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratry+Investigation%22%5BJournal%5D)">Development and characterization of human-induced pluripotent stem cell-derived cholangiocytes.</a> Laboratry Investigation. 95 (6), 684-696 (2015).</li>
<li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+expansion+of+single+Lgr5%2B+liver+stem+cells+induced+by+Wnt-driven+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration.</a> Nature. 494 (7436), 247-250 (2013).</li>
<li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+culture+of+genome-stable+bipotent+stem+cells+from+adult+human+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver.</a> Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).</li>
<li>Kruitwagen, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-Term+Adult+Feline+Liver+Organoid+Cultures+for+Disease+Modeling+of+Hepatic+Steatosis%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Long-Term Adult Feline Liver Organoid Cultures for Disease Modeling of Hepatic Steatosis.</a> Stem Cell Reports. 8 (4), 822-830 (2017).</li>
<li>Spence, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taming+the+Wild+West+of+Organoids%2C+Enteroids%2C+and+Mini-Guts%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+And+Molecular+Gastroenterology+And+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Taming the Wild West of Organoids, Enteroids, and Mini-Guts.</a> Cellular And Molecular Gastroenterology And Hepatology. 5 (2), 159-160 (2018).</li>
<li>Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease+Modeling+in+Stem+Cell-Derived+3D+Organoid+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+In+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Disease Modeling in Stem Cell-Derived 3D Organoid Systems.</a> Trends In Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).</li>
<li>Sampaziotis, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+better+bile+ducts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Building better bile ducts.</a> Science. 359 (6380), 1113(2018).</li>
<li>Sampaziotis, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+of+the+mouse+extrahepatic+biliary+tree+using+primary+human+extrahepatic+cholangiocyte+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Reconstruction of the mouse extrahepatic biliary tree using primary human extrahepatic cholangiocyte organoids.</a> Nature Medicine. 23 (8), 954-963 (2017).</li>
<li>Nakagawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biliary+epithelial+injury-induced+regenerative+response+by+IL-33+promotes+cholangiocarcinogenesis+from+peribiliary+glands%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+Of+The+Natural+Academy+Of+Science+Of+The+United+States+Of+America%22%5BJournal%5D)">Biliary epithelial injury-induced regenerative response by IL-33 promotes cholangiocarcinogenesis from peribiliary glands.</a> Proceedings Of The Natural Academy Of Science Of The United States Of America. 114 (19), E3806-E3815 (2017).</li>
<li>Razumilava, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hedgehog+signaling+modulates+IL-33-dependent+extrahepatic+bile+duct+cell+proliferation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology+Communications%22%5BJournal%5D)">Hedgehog signaling modulates IL-33-dependent extrahepatic bile duct cell proliferation in mice.</a> Hepatology Communications. , (2018).</li>
<li>Boyer, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bile+formation+and+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Comprehensive+Physiology%22%5BJournal%5D)">Bile formation and secretion.</a> Comprehensive Physiology. 3 (3), 1035-1078 (2013).</li>
<li>Carpino, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biliary+tree+stem%2Fprogenitor+cells+in+glands+of+extrahepatic+and+intraheptic+bile+ducts%3A+an+anatomical+in+situ+study+yielding+evidence+of+maturational+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">Biliary tree stem/progenitor cells in glands of extrahepatic and intraheptic bile ducts: an anatomical in situ study yielding evidence of maturational lineages.</a> Journal Of Anatomy. 220 (2), 186-199 (2012).</li>
<li>Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrigel%3A+a+complex+protein+mixture+required+for+optimal+growth+of+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture.</a> Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).</li>
<li>Williamson, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+High-Throughput+Organoid+Microinjection+Platform+to+Study+Gastrointestinal+Microbiota+and+Luminal+Physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+And+Molecular+Gastroenterology+And+Hepatology%22%5BJournal%5D)">A High-Throughput Organoid Microinjection Platform to Study Gastrointestinal Microbiota and Luminal Physiology.</a> Cellular And Molecular Gastroenterology And Hepatology. 6 (3), 301-319 (2018).</li>
<li>Wan, A. C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recapitulating+Cell-Cell+Interactions+for+Organoid+Construction+-+Are+Biomaterials+Dispensable%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+In+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Recapitulating Cell-Cell Interactions for Organoid Construction - Are Biomaterials Dispensable?</a> Trends In Biotechnology. 34 (9), 711-721 (2016).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי יש להם אין אינטרסים מתחרים.

עבודה זו מתארת את הדור של מודל תלת-ממדי organotypic של העכבר EHBD cholangiocytes. צעדים חשובים בדור תרבות EHBDO כוללים ניתוח קפדני EHBD כדי למנוע זיהום תא לבלב, תחזוקת בתנאים סטריליים כדי למנוע זיהום חיידקים ופטריות, מניפולציה זהיר לאחר צנטריפוגה כדי למנוע אובדן חומר הסלולר. הדבקות קרוב בתנאי טמפרטורה שתואר נדרש. ישנן כמה מגבלות על הטכניקה. EHBDs של עכברים בוגרים הם קטנים (כ- 1 מ מ בקוטר; איור 1E), אשר דורשים עדינות לבידוד. מיקרוסקופ ניתוח יכול לשמש כדי לסייע עם לנתיחה.
<p class="jove_co...

Cholangiopathies הן הפרעות פרוגרסיבית כרונית חשוכת מרפא המשפיעים על תאים בכיס המרה ממוקם אינטרה - ו צינוריות המרה extrahepatic (EHBDs)1. Cholangiopathies מסוימים, כמו מחלת כבד כרונית חסימתית, cholangiocarcinoma, בהכנת בכיס המרה, ציסטות choledochal, משפיעים בעיקר על EHBDs. ההתפתחות של טיפולים cholangiopathies הוא מוגבל על ידי המוגבל של מודלים פרה. בנוסף, מחקרים קודמים התמקדו cholangiopathies המקובצים יחד: הכבד, אינטרה- ו EHBDs. עם זאת, אינטרה - EHBDs של מקור עובריים שונים והם יהיו, לכן, צריך להיחשב פתולוגיות מולקולרית ברורים. צינורות המרה intrahepatic להתפתח הלוחות ductal intrahepatic והחלק הגולגולת של הסעיף הכבד, EHBDs כל לפתח מן החלק סימטרית של הסעיף הכבד2. הם גם להסתמך על תאים תאים קדמון שונים הומאוסטזיס למבוגרים, כולל תעלות של הרינג צינורות המרה intrahepatic ובלוטות peribiliary2,EHBDs3. השימוש במודלים ללימודי פרה מוגבל על ידי הוצאות, צריך להיות ממוזער מסיבות מוסריות. לכן, רדיוקציוניסטי, לשחזור, זמן ומודלים במבחנה חסכוניים הן רצוי מאוד.
רוב המחקרים מוקדמת של cholangiopathies מנוצל העכבר הרגיל או עכברוש סרטן מודלים, או שורות תאים אנושיים cholangiocarcinoma נגזר אינטרה - ו6,5,4,EHBDs7. אולם, אלו הם דגמי תאים טרנספורמציה, לא מסכם את הדברים cholangiocyte נורמלי ביולוגיה או הומאוסטזה במצב בריא. התקדמות האחרונות בפיתוח מודלים של תרבות organotypic אפשרה הפיתוח של מבנים תלת-ממדי של סוגי רקמות שונות, כולל רקמות כיס המרה, למרות העכבר הרגיל לא EHBDs8,9, 10. מבנים אלה "איברים כמו" מכוון מחקה רקמות העיקרי, גדלים בנישה מלאכותי תמיכה התחדשות עצמית של תאי גזע ייחודיים/קדמון11.
"תא צורב" היא רחבה בטווח זה רוב מתאר בדרך כלל מודלים תלת-ממדי רקמות שמקורם בתאי גזע. ניתן להפיק Organoids של pluripotent מחדש תאי גזע המיוצג על-ידי תאי גזע עובריים, המושרה בתאי גזע pluripotent. הם גם ניתן להפיק תאי גזע בוגרים ייחודיים12. דגמים תא צורב cholangiocyte הוצעו במחקרים קודמים של המחקר. לפיכך, organoids שמקורם בתאי גזע pluripotent האנושית כבר דווח על7,9,13 ולספק כלי רב ערך, זמן יעיל המאפשר לדור בו זמנית של סוגי תאים שונים. עם זאת, אלה organoids נגזר תאי גזע pluripotent אינן משקפות באופן מלא את המבנה ואת הפונקציונליות של ראשי cholangiocytes EHBD למבוגרים.
Organoids שמקורם בתאי גזע בוגרים של האדם9 , חתולים10 הכבד הוצעו גם. מודלים של חתולים אינם זמינים באופן נרחב, יש מוגבל כלי armamentarium למטרות מחקר. יתר על כן, אלה הכבד-derived מבוגרים נגזר תאי גזע organoids לא מודל extrahepatic cholangiocytes אבל cholangiocytes intrahepatic למדי.
EHBD תא צורב דור דווח בין אדם נורמלי EHBDs14 ו העכבר EHBD cholangiocarcinoma15. עם זאת, גישה EHBD-רקמה אנושית מוגבלת מאד ולאחר organoids נגזר מודל מאתר גנטי של cholangiocarcinoma15 אינם מייצגים הביולוגיה cholangiocyte בריא הומאוסטזיס נגזרים מתאי מהונדס גנטית.
כדי לטפל המגבלות של pluripotent תאי הגזע ואת הכבד-נגזר cholangiocyte תא צורב מודלים וגישה מוגבלת ברקמות אנושיות צורך במודלים פרה, פיתחנו מודל תא צורב EHBD מאתר (איור 1 א'). כתב יד זה מתאר את ההתפתחות של טכניקה עבור העכבר נגזר EHBD organoids מרקמות למבוגרים. אלה organoids EHBD בשם EHBDOs יהיה כלי במבחנה חשוב בחקר המנגנונים שבבסיס EHBDs cholangiocyte הומאוסטזיס ומחלות תהליכים, כגון cholangiopathies.

<table><tbody><tr><td><חזק>L-WRN תרבית תאים בינונית</חזקה></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מתקדמת DMEM/F12</td><td></td><td>Life Technologies</td><td>12634-010</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS)</td><td>1%</td> <td>Life Technologies</td><td>10437-028</td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין</td><td>100 U/mL</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td></tr><tr><td><חזק>מאגר כביסה</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS)</td><td>50 מ"ל</td><td>Life Technologies</td><td>10010-023</td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין</td><td>125 U/mL</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td></tr><tr><td>אמפוטריצין B&nbsp;</td><td>6.25 ומיקרו; g/mL</td><td>Life Technologies</td><td>15290-018</td></tr><tr><td><חזק>מדיום תרבית אורגנואידית</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-WRN מדיום ממוזג&nbsp;</td><td>1:1</td><td>ATCC</td><td>CRL-3276</td></tr><tr><td>מתקדם DMEM/F12</td><td>1:1</td><td>Life Technologies</td><td>12634-010</td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין</td><td>100 U/mL</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td></tr><tr><td>N-גלוטמין</td><td>10 ומיקרו; l/mL</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td></tr><tr><td>N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid, HEPES</td><td>10 mM</td><td>Life Technologies</td><td>15630-080</td></tr><tr><td>B27</td><td>10 ומיקרו; l/mL</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td></tr><tr><td>N2</td><td>10 ומיקרו; l/mL</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td></tr><tr><td><חזק>מדיום זריעה אורגנואידי</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מדיום תרבית אורגנואידית&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>גורם גדילה אפידרמיס (EGF)</td><td>50 ננוגרם/מ"ל</td><td>Invitrogen</td><td>PMG8041</td></tr><tr><td>גורם גדילה פיברובלסטים-10 (FGF10)</td><td>100 ננוגרם/מ"ל</td><td>PeproTech</td><td>100-26</td></tr><tr><td>><נוגדנים ראשוניים</נוגדנים חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>אנטי-ציטוקרטין 19 (CK19), ארנב</td><td>1:250</td><td>Abcam</td><td>ab53119</td></tr><tr><td>אזור קביעת מין נוגדן Y-Box 9 (SOX9), ארנב</td><td>1:200</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-20095</td></tr><tr><td>נוגדן תריסריון הלבלב 1 (PDX1), ארנב</td><td>1:2000</td><td>DSRB</td><td>F109-D12</td></tr><tr><td>נוגדן E-cadherin, עז</td><td>1:500</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-31020</td></tr><tr><td>נוגדן אצטילציה ואלפא;-טובולין, עכבר</td><td>1:500</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6793</td></tr><tr><td>נוגדנים</td><td></td><td></td> משניים<td></td></tr><tr><td>488 מתויג נגד ארנב, חמור IgG</td><td>1:1000</td><td>Invitrogen</td><td>A-21206</td></tr><tr><td>594 מסומן נגד עזים, חמור IgG</td><td>1:1000</td><td>Invitrogen</td><td>A-11058</td></tr><tr><td>568 מסומן נגד עכבר, עז IgG2b</td><td>1:500</td><td>Invitrogen</td><td>A-21144</td></tr><tr><td>TopFlash Wnt כתב מבחן</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><חזק>TopFlash HEK293 קו תאים</חזק></td><td></td><td>ATCC</td><td>CRL-1573</td></tr><tr><td>Luciferase Assay Kit</td><td></td><td>Biotium</td><td>30003-2</td></tr><tr><td>0.05% Trypsin-EDTA</td><td></td><td>Life Technologies</td><td>25300054</td></tr><tr><td>0.4% Trypan Blue Solution</td><td></td><td>Life Technologies</td><td>15250061</td></tr><tr><td><חזק>חומרים וריאגנטים נוספים </חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מטריצת מרתף, מטריג'ל</td><td></td> ללא פנול<td>CORNING</td><td>356237</td></tr><tr><td>מאגר דיסוציאציה, Accutase</td><td></td><td>Gibco</td><td></td></tr><tr><td>A1110501 מדיום הקפאת תרבית תאים, Recovery</td><td></td><td>Life Technologies</td><td>12648010</td></tr><tr><td>מסננת תאים (70 ומיקרו; מ', מעוקר)</td><td></td> <td>פישרברנד</td><td>22363548</td></tr><tr><td>מיצוי RNA גואנידיניום תיוציאנט-פנול, ג'ל לעיבוד דגימות 15596026 TRIzol</td><td></td><td>Invitrogen</td><td></td></tr><tr><td>, HistoGel</td><td></td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>HG-4000-012</td></tr><tr><td>ערכת זיהוי מיקופלזמה אוניברסלית</td><td>ATCC</td><td>30-1012K</td>1.5 מ"ל צינור מיקרוצנטריפוגה פישרברנד <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>05-408-129</td></tr><tr><td>צלחת</td><td></td> 24 באר <td>ארה"ב Scientific</td><td>CC7682-7524</td></tr><tr><td>צינור צנטריפוגה חרוטי 50 מ"ל</td><td>פישר מדעי</td><td>14-432-22</td>מיקרוסקופ פלואורסצנטי ניקון אקליפס E800 מיקרוסקופ הפוך ביוטיום 30003-2 מגש נקרופסי פישרברנד 13-814-61 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

דור של organoids של צינורות המרה extrahepatic העכבר

Generation of Organoids from Mouse Extrahepatic Bile Ducts

Cholangiopathies, אשר משפיעים על צינורות המרה extrahepatic (EHBDs), כוללים בהכנת בכיס המרה, מחלת כבד כרונית חסימתית ו- cholangiocarcinoma. להם אין אפשרויות טיפולית יעילה. כלים ללמוד EHBD מוגבלים מאוד. המטרה שלנו הייתה לפתח מודל ייחודיים, תכליתי למבוגרים, תאי גזע, נגזר, פרה cholangiocyte זה ניתן להפיק בקלות של פראי סוג ועכברים מהונדסים גנטית. לפיכך, אנו מדווחים על הטכניקה הרומן של פיתוח מערכת תרבות תא צורב (EHBDO) EHBD מ- EHBDs העכבר למבוגרים. המודל הוא חסכוניים, מסוגל בקלות להיות מנותח, ויש לו מספר יישומים במורד הזרם. באופן ספציפי, אנו מתארים את המתודולוגיה של העכבר EHBD בידוד, דיסוציאציה תא בודד, חניכה תרבות תא צורב, הפצת, ואת תחזוקה לטווח הארוך ואחסון. כתב יד זה מתאר גם EHBDO עיבוד אימונוהיסטוכימיה, מיקרוסקופ פלואורסצנטי של mRNA שפע כימות על ידי תגובת שרשרת של פולימראז בזמן אמת שעתוק במהופך כמותית (לרביעיית-PCR). פרוטוקול זה יש יתרונות משמעותיים בנוסף לייצור organoids EHBD ספציפיים. השימוש במדיום ממוזגים מתאי L-WRN מפחית באופן משמעותי את העלות של מודל זה. השימוש העכבר EHBDs מספק רקמות כמעט בלתי מוגבל לדור תרבות, בניגוד רקמה אנושית. העכבר שנוצר EHBDOs להכיל אוכלוסיה טהור של תאים אפיתל עם סמנים של קדמון endodermal והוא הבדיל תאים בכיס המרה. Organoids בתרבית לשמור על מורפולוגיה הומוגנית דרך מעברים מרובים, ניתן לשחזר לאחר אחסון לטווח ארוך של חנקן נוזלי. המודל מאפשר לחקר התפשטות תאים קדמון בכיס המרה, ניתן לטפל בנושא פרמקולוגית, וכן עלול להיווצר מתוך עכברים מהונדסים גנטית. מחקרים עתידיים נחוצים כדי למטב את תרבות תנאים על מנת להגביר את היעילות יופיצ, להעריך תא פונקציונלי בגרות ולאחר ישירה תאית התמיינות. פיתוח מודלים של תרבות משותפת, מטריצה חוץ-תאית נייטרלי יותר ביולוגית הם גם רצוי.

פרוטוקול שלנו מתאר את הדור של העכבר EHBD organoids רקמות ספציפיות, מבוגר נגזר תאי גזע. לאחר organoids מתורבתים, ניתן לצפות מוקדם ככל 1 יום לאחר הבידוד EHBD צורה מבנה פיברוזיס. זיהום עם fibroblasts לא נצפית בדרך כלל בעת יצירת תרבות. EHBDO יופיצ יעילות הוא כ 2% כאשר מבודד neonatal או למבוגרים (שגילם חודשיים) עכברים (איור 2B). ציפוי היעילות של EHBD organoids נגזר עכברים בוגרים גדל ל- 11% מעבר 2, נשאר יציב (איור 2B). הרוב המכריע של o...

פרוטוקול זה מתאר את הייצור של מערכת תלת-ממדי תא צורב של צינור המרה extrahepatic העכבר. אלה organoids בכיס המרה יכול להישמר בתרבות ללמוד ביולוגיה cholangiocyte. Organoids בכיס המרה אקספרס סמנים של קדמון והן תאים בכיס המרה, המורכבת של תאי אפיתל מקוטב.

דור של Organoids של צינורות המרה Extrahepatic העכבר

Cholangiopathies, which affect extrahepatic bile ducts (EHBDs), include biliary atresia, primary sclerosing cholangitis, and cholangiocarcinoma. They have ...

מערכת אורגנואידית צינור מרה חוץ-פתולוגית זו יכולה לטפל בגישה המוגבלת למודלים של כולנגיופתיות פרה-קליניות ולמגבלות של תאי גזע פלוריפוטנטיים ומודלים אורגנואידים של צ'ולנגיוציטה שמקורם בכבד. המודל שלנו הוא ספציפי לרקמות למבוגרים, רדוקציוניסטי, ניתן לשחזור, ותזמן וחסכוני. זה יהיה לתועלת מיוחדת למעבדות כי אין גישה לרקמות אנושיות.הטכניקה שלנו מאפשרת culturing של מספר כמעט בלתי מוגבל של cholangiocytes צינור המרה extrahepatic ללמוד התחדשות רקמות אינטראקציות תא לתא. הפגנת ההליך תהיה ג'וניה שיוטה, פוסט-דוקטורט מהמעבדה שלי. לבידוד צינור המרה ההפוכות, מניחים את העכבר הבוגר בתווית על-חושית ופתיחת חלל הבטן לאורך קו האמצע.יש לחזור בכבד כדי לנוח על הסרעפת ולהשתמש בהמוסטט כדי למשוך בעדינות את התריסום הפרוקסימלי כדי לחשוף את צינור המרה הנפוץ מיד מתחת לעצם הכבד. השתמש אזמל כדי להפריד את צינור המרה extrahepatic מן הרקמות שמסביב. מחזיק את הקצה הפרוקסימלי של צינור המרה המשותף עם מלקחיים, לנתח את הצינור distally ממש מעל הצומת שלה עם התריסיון לפני לנתח את הקצה הפרוקסימלי של הצינור מהכבד.מיד מניחים את צינור המרה החוץ-עורי המבודד לתוך צלחת זכוכית המכילה חיץ כביסה קר על קרח, ולאחר מכן לנקות את צינור המרה מן הרקמה שמסביב טחון לתוך 0.5 מילימטר חלקים. כאשר כל הרקמה כבר טחון, להעביר את החלקים לתוך צינור המכיל 50

generation-of-organoids-from-mouse-extrahepatic-bile-ducts

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

טכניקה לבודד cholangiocytes מצינורות המרה extrahepatic של עכברים בילוד מתוארת. הצינורות בקפדנות הם גזורים, ולאחר מכן תאים מבודדים על ידי תולדה בג'ל קולגן העבה. שיטה זו מספקת כלים שימושיים ללימוד פיתוח extrahepatic מרה צינור ופתולוגיה.

בידוד של ילודים extrahepatic Cholangiocytes

שיטת התרבות תלת ממדים שתוארה בפרוטוקול זה משחזרת פיתוח לבלב מאבות מפוזרים עוברי לבלב של עכבר, כולל הרחבתן משמעותית, בידול והמורפוגנזה לתוך איבר מסועף. שיטה זו ניתנת להדמיה, התערבות ומניפולציה תפקודיות של הנישה.

במבחנה הלבלב Organogenesis ממפוזר אבות עכבר עובריים

אנו מציגים שיטה פשוטה למדי ורגיש לקוונפיקציה מדויקת של צפיפות צינור המרה בכבד העכבר. שיטה זו יכולה לסייע בקביעת ההשפעות של מכפילי גנטי וסביבתי ואת האפקטיביות של טיפולים פוטנציאליים מודלים העכבר של מחלות המרה.

קביעת צפיפות צינור המרה בכבד העכבר

אנו מראים שיטה של נקרופסי וניתוח של מודלים של סרטן הערמונית העכבר, התמקדות בניתוח גידול בערמונית. פרוטוקול צעד אחר צעד עבור דור של גידול בבלוטת הערמונית העכבר מוצג גם.

הדור של אורגנואידים גידול מ מהונדסים גנטית עכבר מודלים של סרטן הערמונית

מערכות תאיות תלת מימדיות (תלת-ממדיות) הן מודלים רלוונטיים לחקירת אורגנוגנזה. שיטה מבוססת הידרוג'ל לייצור ציסטות מרה ואפיון שלהם מוצע. פרוטוקול זה חושף את המחסומים של אפיון תלת-מימד, עם שיטה פשוטה ואמינה להערכת יעילות היווצרות ציסטה, גדלים, ולבדוק את הפונקציונליות שלהם.

ייצור ואפיון כמותי של ציסטות אפיתל מרה פונקציונליות ומקוטבות

מערכת תרבות אורגנויד חוץ גופית חוץ גופית ארוכת טווח הוקמה מהפטוציטים של עכברים. אורגנוידים אלה ניתן לעבור מניפולציה גנטית על ידי זיהום lentivirus של בנייה shRNA / חוץ רחמי, transfection siRNA והנדסת CRISPR-Cas9.

מניפולציה ממסדית וגנטית של אורגנוידים של מורין הפטוציט

לתצפית על הפרעות בצינור המרה של מורין, נדרש צינור מרה שלם והכנה יעילה. לכן, גישה חדשה לבידוד כל מערכת צינורות המרה החוץ-כבדיים ביילודים מורין פותחה בהצלחה תוך שמירה על שלמות צינור המרה.

דיסקציה של צינור המרה החוץ-כבדי וכיס המרה בניודים של עכברים בני תשעה ימים

פרוטוקול זה מתאר את היצירה של אורגנואידים אנדודרמליים בכבד (eHEPOs) מהירים וניתנים לשחזור. בעזרת פרוטוקול זה, ניתן לייצר eHEPOs תוך שבועיים ולהתרחב לטווח ארוך (יותר משנה) מבלי לאבד את הבידול והפונקציונליות שלהם.

יצירת אורגנואידים פונקציונאליים בכבד אנדודרמלי

אורגנואידים הנוצרים מגידולי חולים מוזרקים אורתוטופית לכבד העכבר. כריתה של רקמת כבד לא גידולית מובילה לסביבה רגנרטיבית ברקמת הכבד בה נמצא הגידול.

מודל קסנוגרפט אורגנואיד שמקורו בחולי סרטן הכבד כדי לחקור את ההשפעה של התחדשות הכבד על צמיחת הגידול

פרוטוקול זה מציג טכניקת זילוח כבד אופטימלית של collagenase בשני שלבים במודל חולדה ומראה את השימוש בהפטוציטים מבודדים עבור תרבית ארוכת טווח במבחנה של אורגנואידים תלת-ממדיים.

זילוח כבד חולדה ובידוד הפטוציטים ראשוני: הליך ישן חיוני לתרבית אורגנואידים תלת-ממדית חדשנית

למדו לייצר אורגנואידים תלת-ממדיים מצינורות המרה extrahepatic בעכבר לחקר ביולוגיית כולנגיוציטים. שיטה זו מאפשרת גידול תאים אפיתליים מקוטבים לחקר התחדשות רקמות ואינטראקציות בין תאיות.

דור של Organoids של צינורות המרה Extrahepatic העכבר

גלה סרטונים נוספים