קוונפיקציה של מתרבים אנטיגן אנושי-ספציפי CD4⁺ T תאים באמצעות Carboxyפלואורומיתאת הדיקן אסתר

פרוטוקול זה מספק פלטפורמה לחקר תגובות לתאי CD4T שלעתים קרובות חלשות וקשות לזיהוי. טכניקה זו מאפשרת זיהוי, ספירת ובידוד של תאי CD4T ללא ידע מוקדם לגבי מצגת אנטיגן. היתרון העיקרי הוא ניתוח של תאי CD4T שהם לעתים קרובות אוכלוסיות נדירות הקשורות לתנאים אוטואימוניים כגון סוכרת מסוג אחד.

עם קבלת דגימת הדם ההיקפית מתורם בריא, לדלל את הדם PBS לפחות יחס אחד עד שניים לפני שכבות 35 מיליליטר של דם מעל 15 מיליליטר של מדיום שיפוע צפיפות בצינור 50 מיליליטר. להפריד את התאים על ידי צנטריפוגה הדרגתית צפיפות ולהסיר כ 20 מיליליטר של שכבת הפלזמה העליונה וכתוצאה מכך. ואז לאסוף את שכבת תאי הדם הלבנים דואגים כדי למנוע את גלולת תא הדם האדום ולשטוף את התאים שלוש פעמים PBS טרי.

לאחר הספירה, לדלל את התאים לאחת פעמים 10 לתא mononuclear הדם ההיקפי השישי או PBMC למיליליטר של ריכוז PBS. הוסף 300 מיקרוליטרים של תאים עבור כל פקד לתוך צינורות בודדים 10 מיליליטר. לאחר ציפוי כל צינור עם PBS, להכביד על התאים על ידי צנטריפוגה ו resuspend התאים באחת פעמים 10 לתאים השישי למיליליטר של ריכוז בינוני RP5.

ואז צלחת 100 microliters של תאים לכל שליטה לכל שלוש בארות של צלחת 96 באר המכיל 100 microliters של מדיום RP5 לגם. מניחים את הצלחת באינקובטור תרבות התא במשך שבעה ימים. לאחר מכן, להעביר את PBMCs הנותרים לתוך צינור חדש 50 מיליליטר ולהוסיף microliter אחד של פתרון מלאי עבודה CFSE לכל מיליליטר אחד של השעיית תא לצד של הצינור.

הפוך במהירות את הצינור מספר פעמים כדי לערבב ול למקם את התאים באינקובטור של תרבות התא במשך חמש דקות. בסוף הדגירה, לעצור את התגובה עם חמישה מיליליטר של מדיום RP5 ולאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה. תוסיפו את גלולה באחת פעמים 10 כדי PBMCs השישי למיליליטר של טרי RP5 בינוני ולהוסיף מיליליטר אחד של תאים אחד 10 צינור מיליליטר לכל אנטיגן להיבדק.

לאחר מכן להוסיף 100 microliters של תאים לכל אנטיגן לכל שלוש בארות של 96 צלחת גם המכיל 100 microliters של מדיום RP5 בתוספת אנטיגן מדולל של עניין לגם. מניחים את הצלחת באינקובטור תרבות התא במשך שבעה ימים. כדי להכתים את אוכלוסיות תאי CD4+T לניתוח ציטומטרי זרימה, בסוף התרבות להעביר את כל נפח התאים מכל באר לתוך פלואורסצנטיות בודדת מופעלת מיון תאים או צינורות FACS.

לשטוף כל מדגם עם מיליליטר אחד של PBS בתוספת 0.1% סרום עגל העובר או FCS. תן שימוש חוזר לכדורים בנוגדן CD4 אנטי-אנושי מתאים ב-100 מיקרוליטרים של PBS פלוס FCS לצינור. דגירה התאים בארבע מעלות צלזיוס במשך 20 דקות מוגן מפני אור.

בסוף הדגירה, לשטוף את הדגימות במיליליטר אחד של PBS טרי בתוספת FCS לצינור ו resuspend כדורי ב 100 microliters של PBS טרי בתוספת FCS. מיד לפני הניתוח, מוסיפים מיקרוליטר אחד של פרופידיום יודיד לכל צינור כדי לאפשר הדרה של תאים מתים. שער הלימפוציטים לפי אזורי פיזור הקדמיים והצד שלהם.

כדי לא לכלול את התאים apoptotic, שער אזור פיזור קדימה לעומת תאים שליליים propidium יודיד ולהשתמש בתאים שאינם נגועים כדי להגדיר בסיס מתח עבור תאים שאינם פלואורסצנטיים. הגדר את המתחים עבור פלואורופור נוגדן CD4 ואת אות CFSE כך אות פלואורסצנטי הוא מתחת 1000 עבור כל אחד. השתמש בדגימות CFSE ו- CD4 של בקרת צבע יחידה כדי לאשר אות פלואורסצנטי חיובי עבור כל צבע באמצעות ערכת המתחים עם התאים שאינם נגועים.

כמו CFSE ו propidium יודיד יש חפיפה ספקטרלית מסוימת, להתאים את הפיצוי כדי לחסר את פלואורסצנטיות יודיד פרופיד מן הפלואורסצנטיות CFSE עד מדגם CFSE בלבד אינו מניב אות בערוץ יודיד פרופידיום. כאשר כל הדגימות נותחו, לחשב את מדד חלוקת התאים על ידי חלוקת מספר תאים מחולקים על ידי 5000 תאים מחולקים מן הקבוצה אנטיגן מגורה על ידי המספר הממוצע של תאים מחולקים לכל 5000 תאים מחולקים מהתאים מתורבתים ללא אנטיגן. כמעט כל התורמים להפגין תגובה חזקה T-cell טוקסואיד טטנוס לאחר גירוי במבחנה כי התורמים חוסנו מה שהופך טוקסואיד טטנוס אנטיגן שליטה חיובית שימושית.

עם זאת, התפשטותם של תאי CD4+T ממחשבי PBMCs לא מאוכלסים היא מינימלית. לאחר שבעה ימים של גירוי עם C-פפטיד פרו אינסולין אנושי, תומכי אינסולין C-פפטיד ספציפי CD4 + T תאים ניתן לזהות בדם ההיקפי של אדם עם סוכרת מסוג אחד. PBMC מגורה עם שפעת חלבון מטריצת וירוס גם להפגין התפשטות.

יחד, נתונים אלה מראים כי ניתן לבצע את ההסטה באמצעות חלבונים באורך מלא, כמו גם פפטידים סינתטיים קצרים. רכיב FACS של שיטה זו יכול להתבצע באמצעות ציטומטר זרימת מיון תאים. באמצעות סדרן תאים, ניתן לבודד את תאי ה- T הספציפיים לאנטיגן ברמת התא הבודד לצורך ניתוח במורד הזרם.

שיטה זו אפשרה גילוי של תגובות לתאי CD4T אצל אנשים עם סוכרת מסוג אחד בשלב מוקדם. ניתוח אוכלוסיות נדירות אלה של תאי T תוך שימוש בשיטות אחרות מציב אתגרים טכניים שונים.