Name: תרבית תאים חיידקיים ברמה תא בודד בתוך שלפוחיות ענק (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-30T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: למד שיטה לתרבית תאים חיידקיים ברמה של תא בודד בתוך שלפוחיות ענק. השיטה מאפשרת תצפית ישירה של צמיחת חיידקים ומציעה כלי חדש למחקר מיקרוביולוגי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכת על ידי יוזמה מובילה לחוקרים צעירים מצוינים (מנהיג, No. 16812285) ממשרד החינוך, התרבות, ספורט, מדע וטכנולוגיה (MEXT) של יפן, מענק סיוע למחקר מדען צעיר (No. 18K18157, 16K21034) מחברה יפן לקידום המדע (JSPS) ל M.M., ו גרנט-עזרה מ-MEXT ל-K.K. (No. 17H06417, 17H06417).

1. הכנת GVs המכיל תאים חיידקיים על ידי שיטת העברת Droplet
<ol><li>הכנת פתרונות מניות ליפיד של 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-לגליקו-3-פוספולולין (POPC, 10 מ"מ, 1 מ ל) ו-1, 2-distearoyl-sn-גליקו-3-פוספולאטאנאמין-N-[ביוטיקסיל (פוליאתילן)-2000] (biotin-יתד-DSPE, 0.1 מ"מ, 1 מ ל) בכלורופורם/ מתנול פתרון (2/1, v/v) ולאחסן את המניה ב-20 ° c.</li>
	<li>הכנת תמיסת שמן המכילה שומנים בדם
	<ol>
<li>יוצקים 20 μL של פתרון POPC ו 4 μL של הפתרון biotin-יתד-DSPE לתוך צינור זכוכית (איור 1b (i)).</li>
		<li>להתנדף את הממס האורגני על ידי זרימת האוויר כדי ליצור סרט השומנים ולמקם את הסרט desiccator עבור 1 h כדי לאדות לחלוטין את הממס אורגני (איור 1b (ii)). הערה: יש צורך לאדות את הממס האורגני בתוך מכסה המנוע.</li>
		<li>הוסף 200 μL של שמן מינרלי (0.84 g/mL, טבלת חומרים) לבקבוקון זכוכית (איור 1b (iii)).</li>
		<li>עטוף את החלק הפותח של בקבוקון זכוכית עם הסרט וsonicate אותו באמבטיה אולטרה סאונד (120 W) עבור לפחות 1 h (איור 1b (iii)). הריכוזים הסופיים של POPC ו biotin-יתד-DSPE הם 1 מ"מ ו 0.002 מ"מ, בהתאמה.</li>
	</ol></li>
	<li>טרום תרבות של תאים חיידקיים
	<ol>
<li>החיידק הקולי לתוך מדיום 1x ליברות (1 גרם שמרים לחלץ, 2 g bacto טריטונים, ו 2 גרם נתרן כלוריד ב 200 mL של מים מיוהים) מ לוחית LB ו דגירה ב 37 ° צ' עבור 12 – 14 h (לילה).</li>
		<li>לאחר הדגירה, לאסוף 20 μL של פתרון התרבות ולהעביר ל 1.98 mL של טריים 1x בינוני LB, ותרבות התאים שוב עבור 2 h.</li>
		<li>בדוק את הדחיסות האופטית ב600 nm (OD600) ערך של פתרון טרום תרבות (מוכן בשלב 1.3.2). יש להשתמש בפתרון טרום תרבות של OD600 = 1.0 – 1.5.</li>
	</ol></li>
	<li>הכנת פתרונות המים החיצוניים והפנימיים של GVs
	<ol>
<li>התמוססות גלוקוז ב-1x ליברות בינונית כדי להכין פתרון מימית החיצוני של GVs. הכן 20 מ ל של פתרון גלוקוז מניות (500 mM).</li>
		<li>לדלל את התמיסה הגלוקוז במניה עם מדיום 1x ליברות 200 מ"מ (שולחן 1).</li>
		<li>מתמוסס התמוססות ב 1x ליברות בינונית כדי להכין פתרון מימית פנימי של GVs. הכינו 20 מ ל של מניות הפתרון של סוכרוז (500 מ"מ).</li>
		<li>לערבב את הפתרון טרום תרבות (OD600 = 1.0 – 1.5), סוכרוז פתרון (500 mM), ו 1X LB בינונית (טבלה 1). ה-OD הסופי600 ערך של הפתרון התרבותי צריך להיות 0.01 – 0.015 והריכוז האחרון של סוכות צריך להיות 200 מ"מ. הערה: . תדאג להימנע מלחץ אוסמוטי יש צורך לאזן את הריכוז בין הפתרון הפנימי והחיצוני.</li>
	</ol></li>
	<li>הכנת המים בשמן (W/O) טיפות המכילות תאים חיידקיים
	<ol>
<li>הוסף 2 μL של הפתרון הפנימי מימית של GVs (מוכן בשלב 1.4.4) כדי 50 μL של פתרון שמן המכיל שומנים (שמן מינרלי עם POPC ו biotin-יתד-DSPE) בצינור פלסטיק 0.6 mL (איור 1b (iv)).</li>
		<li>אמולסיה של שני הרכיבים בצינור הפלסטיק על-ידי הקשה על הצינור באמצעות יד (איור 1b (v)).</li>
	</ol></li>
	<li>היווצרות של GVs המכיל תאים חיידקיים
	<ol>
<li>הוסף 50 μL של הפתרון החיצוני מימית של GVs (מוכן בשלב 1.4.2) בצינור פלסטיק של 1.5 mL (איור 1b (vi)) ושכבה בעדינות 150 μl של פתרון השמן המכיל שומנים (שמן מינרלי עם popc ו BIOTIN-יתד-dspe) על המשטח של מימית החיצונית (איור 1b (vii)). מיכל הדגימה בטמפרטורת החדר (RT, 25 ° c) במשך 10 – 15 דקות בדוק כדי לוודא כי הממשק של השמן ופתרונות מימית הוא שטוח.</li>
		<li>הוסף 50 μL של הפתרון של W/O droplet (מוכן בשלב 1.5.2) על הממשק של השמן ואת התמיסה מימית באמצעות פיפטה (איור 1b (viii)).</li>
		<li>צנטריפוגה את שפופרת הפלסטיק 1.5 mL (משלב 1.6.2) עבור 10 דקות ב 1,600 x g ב RT ב צנטריפוגה שולחן עבודה (איור 1b (ix)). לאחר צנטריפוגה, לאכול את השמן (השכבה העליונה) מצינור פלסטיק 1.5-mL בעקבות הצינורות, ולאסוף את GVs המכיל תאים חיידקיים (איור 1b (x)).</li>
	</ol></li>
</ol>2. הכנת מערכת תצפית GV (מערכת תרבות התא חיידקי)
<ol><li>
הכנת שלפוחיות קטנות (SVs) לקונסטרוקטי ng ממברנה בילייר נתמכת
	<ol>
<li>יוצקים 20 μL של פתרון POPC ו 4 μL של הפתרון biotin-יתד-DSPE לתוך צינור זכוכית (באמצעות הרכב השומנים זהה משמש הכנה GV בשלב 1.1).</li>
		<li>להתנדף את הממס האורגני על ידי זרימת האוויר כדי ליצור סרט השומנים ולמקם את המדגם הזה desiccator עבור 1 h כדי להתאדות לחלוטין את הממס האורגני.</li>
		<li>הוסף 200 μL של הגלוקוז 200 mM ב 1x בינונית LB (הפתרון החיצוני מימית של GVs) לבקבוקון זכוכית.</li>
		<li>עטוף את החלק הפותח של בקבוקון זכוכית עם הסרט וsonicate אותו באמבטיה אולטראסוניות (120 W) עבור לפחות 1 h.</li>
		<li>הכינו SVs על ידי שיטת ההבלטה21 באמצעות הבלטת ממד מיני קרום פוליקרבונט עם 100 בגודל נקבובית ננומטר.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
הכנת תא בעבודת יד
	<ol>
<li>מקדחה חור 7 מ"מ עם אגרוף חלול על אטם כפול פנים (10 מ"מ x 10 מ"מ x 1 מ"מ).</li>
		<li>הדבק את החותם כפול פנים עם החור על זכוכית כיסוי (30 מ"מ x 40 מ"מ, עובי 0.25 – 0.35 mm).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
הכנת קרום bilayer נתמך על הזכוכית המכסה בחור של התא
	<ol>
<li>הוסף 30 μL של פתרון SV לחור של התא (מוכן בסעיף 2.2) ו דגירה ב RT עבור 30 דקות.</li>
		<li>בעדינות לשטוף את החור פעמיים עם 20 μL של 1x בינוני LB המכיל 200 mM גלוקוז (הפתרון החיצוני מימית של GVs) על ידי ליטוף.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
השתק של GVs על ה הממברנה הנתמכת על הזכוכית המכסה בחור החדר
	<ol>
<li>הצג 10 μL של neutravidin עם הפתרון החיצוני מימית של GVs (1 מ"ג/mL) לתוך החור ו-דגירה ב RT עבור 15 דקות.</li>
		<li>בעדינות לשטוף את החור פעמיים עם 20 μL של 1x בינוני LB המכיל 200 mM גלוקוז (הפתרון החיצוני מימית של GVs) על ידי ליטוף.</li>
		<li>הוסף את כל הפתרון המכיל GVs (מוכן בשלב 1.6.3) לתוך החור של התא וחותם עם זכוכית כיסוי (18 מ"מ x 18 מ"מ, עובי 0.13 – 0.17 מ"מ) (איור 2b).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
התבוננות מיקרוסקופית של צמיחת תאים חיידקיים בתוך GVs
	<ol>
<li>הגדר מערכת הבמה חימום מיקרוסקופיים עם מיקרוסקופ הפוך מצויד בצמצם 40x/0.6 מספרית (NA) העדשה האובייקטיבית עם מרחק עבודה ארוך (איור 2b).</li>
		<li>מניחים את התא על מערכת הבמה חימום מיקרוסקופיים (איור 2b). דגירה של GVs המכיל תאים חיידקיים בחדר במצב סטטי עבור 6 h ב 37 ° c.</li>
		<li>ללכוד ולהקליט תמונות מיקרוסקופ של צמיחת תאים חיידקיים בתוך GVs כל 30 דקות באמצעות מדעית מתכת משלימה תחמוצת מוליכים למחצה (sCMOS) מצלמה.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Ozbudak, E. M., Thattai, M., Kurtser, I., Grossman, A. D., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+noise+in+the+expression+of+a+single+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Regulation of noise in the expression of a single gene.</a> Nature Genetics. 31, 69-73 (2002).</li>
<li>Rosenfeld, N., Young, J. W., Alon, U., Swain, P. S., Elowitz, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+regulation+at+the+single-cell+level%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Gene regulation at the single-cell level.</a> Science. 307, 1962-1965 (2005).</li>
<li>Eldar, A., Elowitz, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+roles+for+noise+in+genetic+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional roles for noise in genetic circuits.</a> Nature. 467, 167-173 (2010).</li>
<li>Hashimoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noise-driven+growth+rate+gain+in+clonal+cellular+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Noise-driven growth rate gain in clonal cellular populations.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 3251-3256 (2016).</li>
<li>Boedicker, J. Q., Vincent, M. E., Ismagilov, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+confinement+of+single+cells+of+bacteria+in+small+volumes+initiates+high-density+behavior+of+quorum+sensing+and+growth+and+reveals+its+variability%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Microfluidic confinement of single cells of bacteria in small volumes initiates high-density behavior of quorum sensing and growth and reveals its variability.</a> Angewandte Chemie International Edition. 48, 5908-5911 (2009).</li>
<li>Christopher, M., Waters, B. L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quorum+sensing%3A+cell-to-cell+communication+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Quorum sensing: cell-to-cell communication in bacteria.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 21, 319-346 (2005).</li>
<li>Inoue, I., Wakamoto, Y., Moriguchi, H., Okano, K., Yasuda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On-chip+culture+system+for+observation+of+isolated+individual+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">On-chip culture system for observation of isolated individual cells.</a> Lab on a Chip. 1, 50-55 (2001).</li>
<li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+growth+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Robust growth of Escherichia coli.</a> Current Biology. 20, 1099-1103 (2010).</li>
<li>Reshes, G., Vanounou, S., Fishov, I., Feingold, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+shape+dynamics+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Cell shape dynamics in Escherichia coli.</a> Biophysical Journal. 94, 251-264 (2008).</li>
<li>Balaban, N. Q., Merrin, J., Chait, R., Kowalik, L., Leibler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+Persistence+as+a+Phenotypic+Switch%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bacterial Persistence as a Phenotypic Switch.</a> Science. 305, 1622-1625 (2004).</li>
<li>Brouzes, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+microfluidic+technology+for+single-cell+high-throughput+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Droplet microfluidic technology for single-cell high-throughput screening.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (34), 14195-14200 (2009).</li>
<li>Zengler, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultivating+the+uncultured%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cultivating the uncultured.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (24), 15681-15686 (2002).</li>
<li>Eun, Y., Utada, A. S., Copeland, M. F., Takeuchi, S., Weibel, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encapsulating+bacteria+in+agarose+microparticles+using+microfluidics+for+high-throughput+cell+analysis+and+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Encapsulating bacteria in agarose microparticles using microfluidics for high-throughput cell analysis and isolation.</a> ACS Chemical Biology. 6, 260-266 (2011).</li>
<li>Allen, T. M., Cullis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposomal+drug+delivery+systems%3A+From+concept+to+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Liposomal drug delivery systems: From concept to clinical applications.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 65, 36-48 (2013).</li>
<li>Szostak, J. W., Bartel, D. P., Luisi, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesizing+life%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Synthesizing life.</a> Nature. 409, 387-390 (2001).</li>
<li>Noireaux, V., Libchaber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+vesicle+bioreactor+as+a+step+toward+an+artificial+cell+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A vesicle bioreactor as a step toward an artificial cell assembly.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (51), 17669-17674 (2004).</li>
<li>Tan, Y. C., Hettiarachchi, K., Siu, M., Pan, Y. R., Lee, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+microfluidic+encapsulation+of+cells%2C+proteins%2C+and+microbeads+in+lipid+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Controlled microfluidic encapsulation of cells, proteins, and microbeads in lipid vesicles.</a> Journal of the American Chemical Society. 128 (17), 5656-5658 (2006).</li>
<li>Chowdhuri, S., Cole, C. M., Devaraj, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encapsulation+of+Living+Cells+within+Giant+Phospholipid+Liposomes+Formed+by+the+Inverse-Emulsion+Technique%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Encapsulation of Living Cells within Giant Phospholipid Liposomes Formed by the Inverse-Emulsion Technique.</a> ChemBioChem. 17, 886-889 (2016).</li>
<li>Morita, M., Katoh, K., Noda, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+of+bacterial+growth+in+giant+unilamellar+vesicles%3A+a+novel+tool+for+bacterial+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22ChemistryOpen%22%5BJournal%5D)">Direct observation of bacterial growth in giant unilamellar vesicles: a novel tool for bacterial cultures.</a> ChemistryOpen. 7, 845-849 (2018).</li>
<li>Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+Unilamellar+Vesicles+Using+an+Inverted+Emulsion%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Production of Unilamellar Vesicles Using an Inverted Emulsion.</a> Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).</li>
<li>Hope, M. J., Bally, M. B., Webb, G., Cullis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+large+unilamellar+vesicles+by+a+rapid+extrusion+procedure.+Characterization+of+size+distribution%2C+trapped+volume+and+ability+to+maintain+a+membrane+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Production of large unilamellar vesicles by a rapid extrusion procedure. Characterization of size distribution, trapped volume and ability to maintain a membrane potential.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 812, 55-65 (1985).</li>
<li>Tsumoto, K., Matsuo, H., Tomita, M., Yoshimura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+formation+of+giant+liposomes+through+the+gentle+hydration+of+phosphatidylcholine+films+doped+with+sugar%5BTitle%5D)+AND+%22Colloids+and+Surfaces+B%3A+Biointerfaces%22%5BJournal%5D)">Efficient formation of giant liposomes through the gentle hydration of phosphatidylcholine films doped with sugar.</a> Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 68, 98-105 (2009).</li>
<li>Li, A., Pazzi, J., Xu, M., Subramaniam, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellulose+abetted+assembly+and+temporally+decoupled+loading+of+cargo+into+vesicles+synthesized+from+functionally+diverse+lamellar+phase+forming+amphiphiles%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Cellulose abetted assembly and temporally decoupled loading of cargo into vesicles synthesized from functionally diverse lamellar phase forming amphiphiles.</a> Biomacromolecules. 19, 849-859 (2018).</li>
<li>Weinberger, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gel-assisted+formation+of+giant+unilamellar+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Gel-assisted formation of giant unilamellar vesicles.</a> Biophysical Journal. 105, 154-164 (2013).</li>
<li>Kurokawa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+cytoskeleton+for+stabilizing+artificial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">DNA cytoskeleton for stabilizing artificial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (28), 7228-7233 (2017).</li>
<li>Nourian, Z., Roelofsen, W., Danelon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triggered+gene+expression+in+fed-vesicle+microreactors+with+a+multifunctional+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Triggered gene expression in fed-vesicle microreactors with a multifunctional membrane.</a> Angewandte Chemie International Edition. 51, 3114-3118 (2012).</li>
<li>Dezi, M., Di Cicco, A., Bassereau, P., Levy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detergent-mediated+incorporation+of+transmembrane+proteins+in+giant+unilamellar+vesicles+with+controlled+physiological+contents%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Detergent-mediated incorporation of transmembrane proteins in giant unilamellar vesicles with controlled physiological contents.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (18), 7276-7281 (2013).</li>
<li>Trantidou, T., Dekker, L., Polizzi, K., Ces, O., Elani, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionalizing+cell-mimetic+giant+vesicles+with+encapsulated+bacterial+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Interface+Focus%22%5BJournal%5D)">Functionalizing cell-mimetic giant vesicles with encapsulated bacterial biosensors.</a> Interface Focus. 8, 20180024(2018).</li>
<li>Elani, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constructing+vesicle-based+artificial+cells+with+embedded+living+cells+as+organelle-like+modules%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Constructing vesicle-based artificial cells with embedded living cells as organelle-like modules.</a> Scientific Reports. 8, 4564(2018).</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

כאן, אנו מתארים שיטה עבור תאים חיידקיים culturing ברמה תא אחד בתוך GVs. שיטה פשוטה זו כרוכה ביצירת GVs המכיל תאים חיידקיים ברמה תא יחיד באמצעות שיטת ה-droplet העברה. לעומת גישות אחרות להשגת GVs המכיל תאים חיידקיים, שיטה זו יש שני יתרונות: (אני) זה קל לפתח, ו (ii) נפח קטן (2 μL) של פתרון לדוגמה נדרש כדי להכין את GVs. שיטת ה-droplet העברת20 להכנת gvs המכילים תאים חיידקיים היא פשוטה יותר מאשר לחות קלאסית22 ו מיקרופלואידיקה שיטות מיקרופלואידיקה17. לדוגמה...

התרבות של תאים חיידקיים ברמה תא אחד קיבל את תשומת הלב הגוברת. התאים חיידקי בקטריאלי ברמת תא בודד בתוך שטח מוגבל יכול להבהיר פונקציות חיידקיים כגון השונות פנוטימית1,2,3,4, התנהגות התא5, מיכל בן 6 , מיכל סבן , בן שמונה , 9, ו עמידות לאנטיביוטיקה10,11. בגלל ההתקדמות האחרונה בטכניקות התרבות, ניתן להשיג את התרבות של חיידקים בודדים בתוך מקום מוגבל, כגון שבב היטב4,7,8, ג'ל droplet12,13 , והמים בשמן (W/O) droplet5,11. כדי לקדם הבנה או ניצול של תאים חיידקיים בודדים, יש צורך בהתפתחויות טכניות נוספות של טכניקות טיפוח.
שלפוחיות המחקים את קרום התא הביולוגי הן תאים כדוריים המורכב ממולקולות אמפיפיליות ויכולות להכיל חומרים שונים. שלפוחיות מסווגים לפי גודל וכוללות שלפוחיות קטנות (SVs, קוטר < 100 ננומטר), שלפוחיות גדולות (LVs, < 1 μm), ושלפוחיות ענק (GVs, > 1 μm). SVs או LVs משמשים בדרך כלל כנשאים לתרופות בשל הזיקה לקרום התא הביולוגי14. GVs יש גם שימש כמערכת הכור עבור הבנייה של פרוטותאים15 או מלאכותי תאים16. כימוס של תאים ביולוגיים לתוך gvs דווח17,18, ולכן gvs להראות פוטנציאל כמערכת תרבות התא כאשר בשילוב עם מערכת הכור.
כאן, יחד עם וידאו של הליכים ניסיוניים, אנו מתארים כיצד GVs יכול לשמש ככלי תרבות התא הרומן19. GVs המכילים חיידקים נעשו על ידי שיטת ה-droplet העברת20 והיו מקיבוע על קרום נתמך על זכוכית כיסוי. השתמשנו במערכת זו כדי להתבונן בגידול חיידקי ברמה של תא בודד בתוך GVs בזמן אמת.

<table><tbody><tr><td>Bactotryptone</td><td>BD Biosciences</td><td>211705</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Wako Pure Chemicals</td><td>032-21921</td><td></td></tr><tr><td>כיסוי זכוכית (18 ופעמים; 18 מ"מ)</td> <td>Matsunami Glass Ind.</td><td>עובי C018181</td><td>0.13&ndash; זכוכית כיסוי 0.17 מ"מ</td></tr><tr><td>(30 פעמים; 40 מ"מ)</td><td>Matsunami Glass Ind.</td>עובי <td>הזמנה מותאמת אישית</td><td>0.25&ndash; 0.35 מ"מ</td></tr><tr><td>צנטריפוגה שולחנית</td><td>היי-טק ושות'</td><td>ATT101</td><td>סוג רוטור נדנדה</td></tr><tr><td>אטם דו-פרצופי (10 פעמים; 10 ופעמים; 1 מ"מ)</td> <td>Nitoms</td><td>T4613</td><td></td></tr><tr><td>בקבוקון זכוכית</td><td>AS ONE</td><td>6-306-01</td><td>צינור תסיסה של דורהאם</td></tr><tr><td>גלוקוז</td><td>Wako Pure Chemicals</td><td>049-31165</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ הפוך</td><td>אולימפוס</td><td>IX-73</td><td></td></tr><tr><td>מתנול</td><td>Wako Pure Chemicals</td><td>133-16771</td><td></td></tr><tr><td>מערכת חימום מיקרוסקופית stage</td><td>מערכת TOKAI HIT</td><td>TP-110R-100</td><td></td></tr><tr><td>שמן מינרלי</td><td>Nacalai Tesque</td><td>23334-85</td><td></td></tr><tr><td>מיני מכבש</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>610000</td><td></td></tr><tr><td>Neutravidin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31000</td><td></td></tr><tr><td>עדשת אובייקטיבית</td><td>Olympus</td><td>LUCPLFLN 40&/0.6 NA</td><td></td></tr><tr><td>ממברנות פוליקרבונט</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>610005</td><td>גודל נקבוביות 100 ננומטר</td></tr><tr><td>מצלמת sCMOS</td><td>Andor</td><td>Zyla 4.2 בתוספת</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>Wako Pure Chemicals</td><td>191-01665</td><td></td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>Wako Pure Chemicals</td><td>196-00015</td><td></td></tr><tr><td>אמבט אולטרסאונד</td><td>כאחד</td> תמצית שמרים <td>ASU-3D</td><td></td></tr><tr><td>BD</td><td>Biosciences</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>0.6 מ"ל צינור פלסטיק מכוסה</td><td>ווטסון</td><td>130-806C</td><td></td></tr><tr><td>1.5 מ"ל צינור פלסטיק מכוסה</td><td>Sumitomo Bakelite Co.</td><td>MS4265-M</td><td></td></tr><tr><td>1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocoline</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850457P</td><td>POPC</td></tr><tr><td>1,2-distearoyl-snglycero-3-phosphoethanolamine-N-[biotinyl(polyethyleneglycol)-2000]</td> <td>Avanti Polar Lipids</td><td>880129P</td><td>ביוטין-PEG-DSPE</td></tr></tbody></table>

תרבית תאים חיידקיים ברמה תא בודד בתוך שלפוחיות ענק

Bacterial Cell Culture at the Single-cell Level Inside Giant Vesicles

פיתחנו שיטה עבור תאים חיידקיים culturing ברמה תא בודד בתוך שלפוחיות ענק (GVs). התרבות התא חיידקי חשוב להבנת הפונקציה של תאים חיידקיים בסביבה הטבעית. בגלל ההתקדמות הטכנולוגית, ניתן לגלות פונקציות שונות של תאים חיידקיים במפלס התא היחיד בתוך מרחב סגור. GVs הם תאים מיקרו בגודל כדורי מורכב מולקולות השומנים האמפיפילי והוא יכול להכיל חומרים שונים, כולל תאים. במחקר זה, תא חיידקי בודד הועבר 10 – 30 יקרומטר gvs על ידי שיטת העברת droplet ו-gvs המכיל תאים חיידקיים היו מקיבוע על קרום נתמך על מצע הזכוכית. השיטה שלנו היא שימושית להתבוננות בצמיחה בזמן אמת של חיידקים בודדים בתוך GVs. אנו מתורבתים Es, האנתכיה קולי (E. coli) תאים כמודל בתוך gvs, אבל שיטה זו ניתן להתאים לסוגי תאים אחרים. ניתן להשתמש בשיטה שלנו בתחומי המדע והתעשייה של מיקרוביולוגיה, ביולוגיה, ביוטכנולוגיה וביולוגיה סינתטית.

אנו מציגים שיטה פשוטה ליצירת GVs המכיל תאים חיידקיים בודדים באמצעות שיטת ה-droplet העברה (איור 1). איור 1a מראה תמונה סכמטית של המשקעים של gvs המכילים חיידקים. W/O טיפות המכילים חיידקים מועברים על פני מי השמן (מונאולד מונואולייר) ממשק ידי צנטריפוגה כדי ליצור GVs. ההבדל בין הצפיפות בין התמיסה הפנימית והגלוקוז (פתרון המים החיצוני) מסייע גם לחציית ממשק מי השמן של טיפות W/O. יש צורך לפקח על הלחץ אוסמוטי בפתרון מימית פנימי וחיצוני, כי...

אנו מדגימים תרבות תא יחיד של חיידקים בתוך שלפוחיות ענק (GVs). GVs המכיל תאים חיידקיים הוכנו על ידי שיטת העברת droplet היו מקיבוע על קרום נתמך על מצע זכוכית להתבוננות ישירה של גידול חיידקי. גישה זו עשויה להיות גם הסתגלות לתאים אחרים.

We developed a method for culturing bacterial cells at the single-cell level inside giant vesicles (GVs). Bacterial cell culture is important for ...

פרוטוקול זה מספק אמצעי לפולחן תאים חיידקיים ברמת התא הבודד בתוך וריים ענקיים. קל לפתח את הויקטים הענקיים, ורק נפח קטן מאוד של פתרון מדגם נדרש כדי להכין את הווסיקים. הדגמת ההליך תהיה יורי אוטה, מועמד לדוקטורט מהמעבדה שלנו.התחל על ידי הוספת 20 microliters של פתרון POPC מוכן טרי וארבעה microliters של פתרון ביוטין-PEG-DSPE מוכן טרי לבקבוקון זכוכית. להתאדות את הממס האורגני על ידי זרימת אוויר עד סרט השומנים נוצר. מניחים את הסרט ב desiccator במשך שעה אחת כדי להתאדות לחלוטין את הממס האורגני.לאחר מכן מוסיפים 200 מיקרוליטרים של שמן מינרלי לבקבוקון. מכסים את פתיחת הבקבוקון עם סרט פרפין פלסטיק, ו sonicate את תכולת הבקבוקון באמבטיה קולית ב 120 וואט לפחות שעה אחת. להכנת קבוצה קטנה, ליצור סרט השומנים, כפי שהוכח רק, ולהוסיף 200 microliters של 200 מילימטר גלוקוז במדיום LB לסרט.לאחר מכן sonicate הסרט ב 120 וואט לפחות שעה, ואחריו הבלטה של שלפוחיות ענק וכתוצאה מכך לתוך שלפוחיות קטנות באמצעות extruder מיני קרום פוליקרבונט עם גודל נקבובית 100 ננומטר. עבור תא חיידקי טרום תרבות, לחסן E.coli מצלחת LB למיליליטרים של מדיום LB לתרבות לילה ב 37 מעלות צלזיוס. למחרת בבוקר, להעביר 20 microliters של העל-טבעי של התרבות ל 1.98 מיליליטר של מדיום LB טרי עבור שעתיים נוספות של תרבות.בסוף הדגירה, בדוק את הצפיפות האופטית ב 600 ננומטר, או OD 600 ערך, של פתרון טרום תרבות על ספקטרופוטומטר. יש להשתמש בפתרון טרום-תרבותי עם OD 600 של אחד עד 1.5. לאחר מכן מערבבים את הפתרון טרום תרבות עם פתרון סוכרוז מוכן טרי בינוני LB טרי, על פי שולחן אחד.להיווצרות וריסקים ענקיים, הוסיפו 50 מיקרוליטרים של פתרון מימי טרי של וריסקים ענקיים לצינור פלסטיק מרופד 1.5 מיליליטר. בעדינות שכבה 150 microliters של תותבת שמן המכיל שומנים מעל הפתרון הממימי החיצוני של יידים ענקיים. הדגירה את הפתרון וכתוצאה מכך במשך 10 עד 15 דקות בטמפרטורת החדר, לפני הבדיקה כדי להבטיח כי הממשק של השמן ופתרונות מים הוא שטוח.לתא חיידקי מים ושמן המכיל היווצרות טיפות, הוסיפו שני מיקרוליטרים של פתרון מימי פנימי שהוכן טרי של ורידים ענקיים ל-50 מיקרוליטרים של תותבת השמן המכילה שומנים מחוסנים בצינור פלסטיק שטוף 0.6 מיליליטר. לאחר מכן, הקש על הצינור כדי לחקות את שני הרכיבים. לאחר מכן, השתמשו בפיפטה כדי להוסיף 50 מיקרוליטרים של תותב טיפות מים ושמן לממשק של השמן והתסיסה המים, ולמשחות את ורידים ענקיים המכילים תאים חיידקיים על ידי צנטריפוגה.לאחר מכן שאפו את שכבת השמן העליונה ואספו את הווסיקים הענקיים. כדי להכין תא בעבודת יד, לקדוח חור שבעה מילימטר עם אגרוף חלול על 10 על ידי 10 על ידי חותם כפול פנים מילימטר אחד, ולאחר מכן להדביק את החותם דו פנים על 30 על ידי 40 מילימטר כיסוי זכוכית. להכנת קרום דו שכבתי נתמך, הוסיפו 30 מיקרוליטרים של תותב הווסקל הקטן לחור של התא בעבודת יד.הדגירה את הווסיקים בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות. בסוף הדגירה, בעדינות לשטוף את החור פעמיים עם 20 microliters של בינוני LB, בתוספת 200 מילימילר גלוקוז. כדי לשתק ורידים ענקיים על קרום דו שכבתי תומך, להציג 10 microliters של neutravidin בתווית ורידים ענקית מים החיצוני לחור עבור דגירה 15 דקות בטמפרטורת החדר.בסוף הדגירה, לשטוף בעדינות את החור פעמיים עם 20 microliters של בינוני LB, בתוספת 200 מילימילר גלוקוז, ולהוסיף את כל נפח של פתרון וריסק ענק לחור בתא. ואז לאטום את החור עם 18 על 18 מילימטר כיסוי זכוכית. כדי לנטר את צמיחת החיידקים בתוך וקסיקים ענקיים, בחר את המטרה 40X על מיקרוסקופ הפוך, והצב את התא על מערכת שלב חימום מיקרוסקופ.לאחר מכן הדגירה את ורי ענק המכיל תא חיידקי בתא בתנאים סטטיים במשך שש שעות ב 37 מעלות צלזיוס, לכידת והקלטה תמונות של צמיחת תא חיידקי כל 30 דקות, עם המצלמה המדעית משלימה תחמוצת מתכת מוליכים למחצה. וריסקים ענקיים המכילים תאים חיידקיים נעים בדרך כלל בין 10 ל -30 מיקרומטר. עבור שני הגדלים של גירויים ענקיים, תאי ה- E.coli עוברים תהליכי התארכות וחלוקה, כאשר כמה תאי E.coli גדלים למספר גדול מאוד של תאים במהלך תקופת התצפית של שש שעות.התדירות היחסית של זרעי ענק המכילים רמת תא יחיד היא כ-10% מהוווסתים הענקיים המתקבלים, והווסיקלס הענקיים המובלים ברמת התא הבודד הם כ-50% מהוויים הענקיים המכילים תאי חיידקים. היציבות של ממשק מי השמן חשובה להשגת ערכות ענק המכילות תאי חיידקים. יש לדאוג שאפו את השמן בזהירות לפני תיקון וריד ענק.לאחר צפייה בסרטון זה, אתה צריך הבנה טובה של איך לתרבת תאים חיידקיים ברמת התא הבודד בתוך וריים ענקיים בודדים. שיטת התרבות החיידקית שלנו היא כלי חדש במיקרוביולוגיה לגידול חיידקים סביבתיים לא ידועים כדי להשיג או לנתח את המוצרים המטבוליים שלהם.

bacterial-cell-culture-at-the-single-cell-level-inside-giant-vesicles

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

מקור: ווטסון, די.סי., et.al. בידוד וטיהור ניתנים להרחבה של שלפוחיות חוץ-תאיות מ-Escherichia coli וחיידקים אחרים. J. Vis. Exp. (2021)סרטון זה מדגים את הבידוד והריכוז של שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) שמקורן בקרום החיצוני של חיידקים מהונדסים גנטית. התהליך כולל גידול החיידקים לשחרור EVs, ואחריו צנטריפוגה עוקבת ושלבי סינון להסרת תאים ופסולת. לבסוף, אולטרה-סינון משמש לריכוז הרכבים החשמליים לניתוח במורד הזרם.

בידוד והעשרה של שלפוחיות חוץ-תאיות שמקורן בקרום החיצוני מחיידקים

מקור: Morita, M., et al. תרבית תאי חיידקים ברמת התא הבודד בתוך שלפוחיות ענק. J. Vis. Exp. (2019).סרטון זה מדגים שיטה לתרבית והתבוננות בתאי חיידקים בודדים עטופים בתוך שלפוחיות ענק המעוגנות לשכבת שומנים דו-שכבתית. המערכת מאפשרת הדמיה יציבה וארוכת טווח של דינמיקת גדילה של תא בודד במיקרו-סביבה מוגבלת ורלוונטית מבחינה פיזיולוגית.

תרבית תא בודד של חיידקים בתוך שלפוחיות ענק

מקור: קאבין, מ. ט. ואחרים. ניתוח מיקרופלואידי חד-תאי של Bacillus subtilis. J. Vis. Exp. (2018)הסרטון מדגים את השימוש במכשיר מיקרופלואידי לצפייה בצמיחת חיידקים ברמת התא היחיד. הוא מראה כיצד תאי חיידקים לא ניידים, הכלואים בתעלות בקנה מידה מיקרו, מוזנים ומתוחזקים באופן רציף תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. ההגדרה מאפשרת ויזואליזציה בזמן אמת של חלוקת תאים ומעקב אחר שושלת לאורך דורות שונים.

מעקב אחר צמיחת חיידקים ברזולוציית תא יחיד במערכת מיקרופלואידית

בפרוטוקול זה מוצג הייצור, ההתקנה והתפעול הבסיסי של ביו-ריאקטור פיקוליטר מיקרופלואידי (PLBR) לניתוח תאים בודדים של מיקרואורגניזמים פרוקריוטיים. מיקרואורגניזמים רלוונטיים מבחינה תעשייתית נותחו כהוכחה עקרונית המאפשרת תובנות לגבי קצב גדילה, מורפולוגיה והטרוגניות פנוטיפית על פני תקופות זמן מסוימות, בקושי אפשרי בשיטות קונבנציונליות.

ביו-ריאקטור מיקרו-נוזלי פיקוליטר לניתוח מיקרוביאלי של תאים בודדים: ייצור, הגדרת מערכת ותפעול

שלפוחיות ענקיות המכילות רכיבים בגודל מיקרומטר ארוזים מאוד הן מודלים שימושיים של תאים. שיטת הצנטריפוגה של תחליב מים בשמן היא כלי פשוט ורב עוצמה להכנת שלפוחיות ענק עם חומרים עטופים.

הכנת ענק שלפוחית ​​encapsulating מיקרוסכמות על ידי צנטריפוגה של אמולסיה מים ב-שמן

אנו מציגים שיטה לניתוח microfluidic של שושלות בודדים תא החיידק Bacillus subtilis כדוגמא. השיטה מתגבר על החסרונות של שיטות אנליטיות מסורתי במיקרוביולוגיה בכך שהוא מאפשר התבוננות של מאות דורות תא תחת תנאי הגידול בחוזקה לשליטה ואחידה.

ניתוח Microfluidic תא בודד של Bacillus subtilis

כאן, אנו מתארים שיטת מיקרו-השאיפה תא אחד להפרדה של אמבות נגוע. על מנת להפריד אוכלוסיות משנה ויראלי ב Vermamoeba vermiformis נגוע על ידי פאוסטווירוסים ווירוסים ענקיים לא ידוע, פיתחנו את הפרוטוקול מפורט להלן והפגינו את יכולתה להפריד בין שני שפע ווירוסים ענק הרומן.

תא בודד מיקרו-שאיפה כאסטרטגיה חלופית מיון תאים פלואורסצנטית מופעל עבור הפרדה וירוס ענק תערובת

חיידקים מפרישים שלפוחיות חוץ-תאיות בגודל ננומטר (EVs) הנושאות מולקולות ביולוגיות ביו-אקטיביות. מחקר EV מתמקד בהבנת הביוגנזה שלהם, תפקידם באינטראקציות ובמחלות בין מיקרובים למיקרובים ולמיקרובים מארחים, כמו גם ביישומים הטיפוליים הפוטנציאליים שלהם. זרימת עבודה לבידוד מדרגי של כלי רכב חשמליים מחיידקים שונים מוצגת כדי להקל על סטנדרטיזציה של מחקר EV.

בידוד וטיהור מדרגיים של שלפוחיות חוץ-תאיות מ-Escherichia coli וחיידקים אחרים

הפרוטוקול הנוכחי מספק תיאורים מדוקדקים לבידוד, ריכוז ואפיון של שלפוחיות חוץ-תאיות מתרביות ציאנובקטריאליות. כמו כן נדונו גישות לטיהור בועיות מתרבויות בקני מידה שונים, פשרות בין מתודולוגיות ושיקולים לעבודה עם דוגמאות שטח.

בידוד ואפיון של שלפוחיות חוץ-תאיות ציאנובקטריאליות

פרוטוקול זה מתאר את שיטת התחליב ההפוך המשמשת לתמצת מערכת ביטוי ללא תאים (CFE) בתוך שלפוחית חד-למלרית ענקית (GUV) לחקר הסינתזה והשילוב של חלבון קרום מודל בדו-שכבתי השומנים.

הרכבה מחדש של תעלת קולטן הגלוטמט החיידקי על ידי אנקפסולציה של מערכת ביטוי ללא תאים

מאמר זה מציג שיטה להכנת שלפוחיות ענק חד-תכליתיות (cGUVs) בעלות מבנה שלפוחית בתוך שלפוחית, עם מוליכות חשמלית מותאמת אישית באזורים פנימיים, טבעתיים וחיצוניים. אלקטרופורמציה מסנתזת GUVs פשוטים, שהופכים לסטומטוציטים ו-cGUVs באמצעות הלם אוסמוטי, ומספקים מודל רב ערך לחקר הביופיזיקה של תאים גרעיניים.

סינתזה של שלפוחיות חד-כיווניות ענקיות: מודל ביומימטי של תאים גרעיניים

למד שיטה לתרבית תאים חיידקיים ברמה של תא בודד בתוך שלפוחיות ענק. השיטה מאפשרת תצפית ישירה של צמיחת חיידקים ומציעה כלי חדש למחקר מיקרוביולוגי.

תרבית תאים חיידקיים ברמה תא בודד בתוך שלפוחיות ענק

גלה סרטונים נוספים