צילום רנטגן של שריר השלד Murine שלמים ככלי לחקר בסיס מבניים של מחלת שרירים
18 ביולי 2019
אנו מציגים פרוטוקולים מפורטים לביצוע ניסויים קטנים בזווית רנטגן באמצעות שרירי השלד בעכבר ללא שינוי. בעזרת הזמינות הרחבה של דגמי העכבר הטרנסגניים למחלות אנושיות, פלטפורמה ניסיונית זו יכולה ליצור מיטת בדיקה שימושית להסבר בסיס מבני של מחלות שרירים גנטיות
שריר שלד עכבר שלם מבחינה פיזיולוגית יכול לייצר דפוסי דיפוזיה באיכות גבוהה של קרני רנטגן המכילים מידע מבני רב שיכול לספק תובנה לתהליכים פיזיולוגיים. דיפירציה של קרני רנטגן היא הטכניקה היחידה המאפשרת רכישת מידע מבני ברזולוציה גבוהה מרמת שריר חיה בתנאים פיזיולוגיים אמיתיים בזמן פיזיולוגי אמיתי. מחלות שרירים רבות עוברות בירושה.
עם זמינות מוגברת לשנות גנטית את רוב המודלים של מיופתיה, דיפירציה רנטגן יכול לספק תובנות מבניות במנגנוני מחלה ולהצביע על אסטרטגיות טיפוליות. רוב השרירים אוונגוס דיגיטיקום extensor ו soleus נוחים במיוחד למטרה זו. אבל שרירים רבים אחרים בבעלי חיים קטנים ניתן לנתח שלם ומטופל באופן דומה.
לפני תחילת ההליך, הפעל את מתמר הכוח המוטורי המשולב, את בקר מתמר הכוח המוטורי עם ממריצה זרם ביפאסיקי בה הספק גבוה, ואת מערכת בקרת נתונים בקרת מחשב. לאחר מכן, לרסס את העור על האיבר האחורי של העכבר עם הפתרון של רינג'ר קר ולהשתמש מספריים ניתוח עדין לחתוך את העור סביב הירך. באמצעות מטליות מספר חמש, למשוך במהירות את העור למטה כדי לחשוף את השרירים לקטוע את האיבר האחורי.
מניחים את האיבר בצלחת ניתוח מצופה אלסטומר המכילה את הפתרון של רינגר מחומצן וממקמים את המנה תחת מיקרוסקופ ניתוח משקפת. כדי לקצור את השריר soleus, להצמיד את האיבר האחורי עם שריר gastrocnemius פונה כלפי מעלה. השתמש מספריים עדין לחתוך את הגיד הדיסטלי של קבוצת השרירים gastrocnemius / soleus.
חותכים את fascia משני צדי שריר gastrocnemius כדי לאפשר את השרירים להיות הרים בעדינות ולאט לאט מן העצם. ואז לשחרר את הגיד הפרוקסימלי של שריר soleus. הצמד את קבוצת השרירים המכילה את שריר הגסטרוקנמיוס ואת הגיד הדיסטלי בצלחת.
הרם את שריר הסוליה בעדינות דרך הגיד הפרוקסימלי כדי להפריד אותו מהשריר gastrocnemius, משאיר כמה שיותר גיד דיסטלי הבלעדית שלם ככל האפשר. כדי לקצור את שריר הדיגיטאורום או EDL, הצמד את האיבר האחורי בצלחת עם השריר הקדמי tibialis פונה כלפי מעלה לחתוך את fascia לאורך השריר הקדמי tibialis. השתמש מטלפים כדי למשוך את fascia ברור לחתוך את הגיד הדיסטלי של השריר לפני השוקיים.
להרים את השריר לפני השוקיים לחתוך אותו בזהירות מבלי למשוך על שריר EDL, לחתוך לפתוח את הצד הצדדי של הברך כדי לחשוף את שני הגידים. חותכים את הגיד הפרוקסימלי, משאיר לנו הרבה הגיד ככל האפשר עדיין מחובר לשריר בעדינות למשוך על הגיד כדי להרים את שריר EDL. ואז לחתוך את הגיד דיסטלי ברגע שהוא נחשף.
כדי לעלות על השריר שנקטף, להצמיד את השריר דרך הגידים לקצץ כמה שיותר שומן נוסף, fascia וגיד ככל האפשר. הכנס גיד אחד לתוך קשר קשור מראש ולהשתמש מדפים קשירת תפר לקשור את התפר בחוזקה. לקשור את הקשר השני על סביב וו מתכת ולחזור על ההליך בצד השני של הגיד.
לאחר מכן חבר את הוו הקצר לתחתית תא הניסוי, ואת הוו הארוך למנוע מתמר הכוח הדו-מצבי. בועה הפתרון בתא הניסוי עם 100% חמצן. כדי לייעל את פרוטוקול הגירוי ואת אורך השריר להתאים את מניפולטורים מיקרו המחוברים למנוע המתמר כדי ליצור מתח בסיסי בין 15 ל 20 מילניטון כדי למצוא את הפרמטרים הגירוי הטוב ביותר למתוח את השריר.
הגדר את מתח הגירוי ל-40 וולט. זרם הגירוי יוגדל באופן שיטתי עד שלא תהיה עלייה נוספת בכוח עוויתות. כדי למצוא את האורך האופטימלי, להגדיל את אורך השריר ולהפעיל את השריר עם עווית אחת עד הכוח הפעיל מפסיק להגדיל.
בצע התכווצות טטנית שנייה אחת כדי לבדוק את ההרכבה ולמתח את השריר בחזרה לכוח הבסיסי האופטימלי לפי הצורך. ואז להקליט את אורך השריר במילימטרים עם caliper דיגיטלי. כדי לקבוע את מיקום הקרן, השתמש בפיסת נייר רגיש לרנטגן המייצרת נקודה כהה בתגובה לקרני רנטגן ומחולל צלב וידאו כדי ליצור צלב מיושר עם סימן הצריבה על הנייר.
באמצעות ממשק המשתמש הגרפי שסופק על ידי BioCAT למיקום המדגם, מרכז את השריר על מיקום הקרן והזז את שלב הדגימה כדי להניף את תא הדגימה ב 10 עד 20 מילימטרים לשנייה כדי להפיץ מינון רנטגן בכל רחבי השריר במהלך החשיפה. שימו לב לדגימה תוך כדי נסיעה כדי להימנע מאזורים גדולים של פאשיה המכילים קולגן ולהבטיח שהוא יישאר מואר לאורך כל נתיב נסיעתו. לחמש את הגלאי ולחכות ההדק ממערכת איסוף הנתונים.
לאחר מכן הפעל את הנתונים המכניים ורנטגן באותו הזמן כדי לסנכרן אותם. דפוסי הרנטגן ייאספו באופן רציף לאורך כל הפרוטוקול עם זמן חשיפה של 10 אלפיות השנייה ותזרועת חשיפה של 50 אלפיות השנייה. בהתכווצות טטנית איזומטרית מייצגת זו הוחזק שריר ה-EDL במנוחה למשך 0.5 שניות לפני שהופעל לשנייה אחת, ולאחר מכן רגיעה של 1.5 שניות.
תבנית דיפרציה של קרני רנטגן בשרירים יכולה לספק מידע מבני ברזולוציית ננומטר ממבנים בתוך הסרקומר. קווי שכבה מבוססי מיוסין המכילים סיביים עבים הם חזקים וחדים בדפוסים של שריר מנוחה, בעוד קווי שכבה מבוססי actin המכילים סיבי דק בולטים יותר בדפוסים של שריר מתכווץ. דפוסי הבדל המתקבלים על ידי חיסור דפוס המנוחה מתבנית ההתכווצות יכולים לשפוך אור על שינויים מבניים במהלך התפתחות כוח בשרירים בריאים וחלים.
על ידי ביצוע שינויים מבניים אלה בציר הזמן אלפית השניה של האירועים המולקולריים במהלך התכווצות שרירים והרפיה, דפוסי דיפוזיה רנטגן יכול לחשוף מידע מבני משמעותי. בניתוח זה של השתקפויות קו המשווה הייצוגיות באמצעות שגרת קו המשווה בחבילת MuscleX בקוד פתוח, יחס העוצמה המשוונית מציין את קרבתו של מיוסין לפעול בשריר המנוחה ומתואם באופן הדוק למספר הצלבות המצורפות בהתכווצות שריר השלד של מורין. המרחק בין השניים 1, 0 השתקפות קשורה הפוך מרווח interfilament.
ניתוח נקי הוא המפתח לניסוי רנטגן שרירים מוצלח שלם, אז נסו למנוע נזק מכני במהלך הכנת השרירים. כל פרוטוקול פיזיולוגי סטנדרטי עם שרירים שלמים יכול להיות מיושם בניסויים אלה והוא יכול לשמש לחקר הפעלת שרירים, הרפיה והתנהגות חוצה גשר במהלך ארעיות מכנית מהירה. מניפולציה גנטית של עכברים הופכת למתוחכמת יותר ויותר.
מודלים חדשים של עכברים מהו מהודרים יאפשרו לתכנן ניסויים ספציפיים ותובנה יותר כדי להצביע על כיוונים טיפוליים חדשים עבור מיופתיות אנושיות.
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקולים לביצוע ניסויי עקיפת קרני רנטגן בזוויות קטנות (small-angle X-ray diffraction) על שרירי שלד שלםים של עכברים. השיטה מספקת תובנות לגבי הבסיס המבני של מחלות שרירים גנטיות, תוך ניצול הזמינות של מודלים של עכברים טרנסגניים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביופיזיקה
- פיזיולוגיה של השרירים
רקע
- דיפרקציה של קרני X מספקת מידע מבני ברזולוציה גבוהה מרקמת שריר חיה.
- הבנת מחלות שרירים יכולה להפיק תועלת מתובנות שנקשרו באמצעות ניתוח מבני.
- מודלים של עכברים טרנסגניים זמינים יותר ויותר לחקר מיופתיות.
- שרירים ספציפיים, כגון ה-extensor digitorum longus וה-soleus, מתאימים לניסויים אלו.
מטרת המחקר
- להבהיר את השינויים המבניים בשריר במהלך כיווץ והרפיה.
- לספק פלטפורמה לחקר המנגנונים של מחלות שרירים תורשתיות.
- להצביע על אסטרטגיות טיפוליות פוטנציאליות המבוססות על תובנות מבניות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- בידוד שרירי שלד שלמים מעכברים.
- הקמת ניסויי עקיפת קרני X (X-ray diffraction) בתנאים פיזיולוגיים.
- שימוש במתמר כוח בעל מצב כפול (dual-mode force transducer) לגירוי השריר.
- איסוף תבניות קרני X לניתוח שינויים מבניים בקנה מידה ננומטרי.
תוצאות עיקריות
- תבניות עקיפה של קרני X חושפות מידע מבני על סרקומרים.
- הבדלים בתבניות בין שרירים במצב מנוחה לשרירים במצב התכווצות מספקים תובנות על התפתחות הכוח.
- ניתן לעקוב אחר שינויים מבניים בלוח זמנים של מילי-שניות במהלך פעילות שרירית.
- הממצאים תורמים להבנת תפקוד השריר ומנגנוני מחלות.
מסקנות
- המחקר מדגים את התועלת של עקיפת קרני X (X-ray diffraction) במחקר שרירים.
- התובנות שהתקבלו עשויות להנחות גישות טיפוליות למחלות שרירים.
- שיטה זו משפרת את הבנתנו את הפיזיולוגיה והפתולוגיה של השריר.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
עקיפת קרני X (X-ray diffraction) של שריר שלד עכברי שלם מאפשרת ניתוח מבני בקנה מידה ננומטרי תחת תנאים פיזיולוגיים, ומספקת קשר ישיר בין הגנוטיפ לפנוטיפ התפקודי במודלים של מחלות שרירים. גישה זו תומכת בתיקוף מטרות על ידי חשיפת שינויים מבניים בסרקומרים במהלך הפעלת כוח, ובכך מנטרלת סיכונים מכניסטיים עבור אסטרטגיות טיפוליות במיופתיות תורשתיות. השיטה מגבירה את הביטחון החזוי במודלים פרה-קליניים על ידי כימות המרווחים הבין-סיבי ודינמיקת הגשרים המצולבים בפרקי זמן של מילי-שניות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח ביו-פרמצבטי
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן היפותזות טיפוליות על ידי קישור שינויים גנטיים לשינויים מבניים בסרקומרים בשריר שלם.
- ערך תפעולי: מאפשר תיקוף של מטרות תפקודיות באמצעות קריאות מבניות בזמן אמת של אינטראקציות בין מיוזין לאקטין במהלך התכווצות.
- ערך מדעי: תומך בביטחון חיזוי על ידי כימות של מתאמים מבניים של היספחות גשרי הקישור והמרחקים בין הפילמנטים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מכין מערכות ביולוגיות מתוּקפות לתהליכי עבודה המשכיים על ידי שימור הארכיטקטורה והפיזיולוגיה הטבעיות של השריר.
- ערך תפעולי: נותן מענה לסטנדרטיזציה והשחזוריות של הבדיקה באמצעות פרוטוקולי גירוי מבוקרים ואיסוף מסונכרן של נתוני X-ray.
- ערך מדעי: מדגיש את המוכנות לסריקה באמצעות פלטים מבניים כמותיים, כגון יחסי עוצמה קוואטוריאליים (equatorial intensity ratios) וניתוחי קווי שכבה (layer line analyses).
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: דן ברלוונטיות למחלה על ידי קישור שינויים מבניים במודלים טרנסגניים למנגנונים של מיופתיה אנושית.
- ערך תפעולי: מתאר רצף מהשלב של הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני על ידי מתן אפשרות לניטור מבני לאורך זמן.
- ערך מדעי: נותן מענה להחלטות קידום מותאמות סיכון באמצעות זיהוי של ביומארקרים מבניים של התקדמות המחלה.
שילוב תהליכי עבודה ו-Pipeline
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף המטרה ועד לתיקוף פרה-קליני, על ידי אספקת פנוטיפ מבני של תפקוד השריר בתנאים פיזיולוגיים.
- ביולוגיה של גילוי: מסביר כיצד השיטה תומכת בבדיקת השערות, הבהרת מסלולים ביולוגיים והפחתת סיכונים ביולוגיים באמצעות ניתוח מבני של דינמיקת הסרקומרים.
- סקר (Screening): מתאר את מוכנות הבדיקה, השחזוריות ותפליטים כמותיים באמצעות רכישת נתונים מכנית ורנטגן מסונכרנת.
- אנליטיקה: מדגישה מדידות, קריאות או תפליטים סטטיסטיים המסייעים לצומיקה להשוות בין תנאים, כולל יחסי עצימות קוואטוריאליים ומרווחי השתקפות.
- מחקר תרגומי: מקשר את השיטה לרצף פרה-קליני או להתאמה של סמנים ביולוגיים על ידי מעקב אחר שינויים מבניים במודלים של מחלות.
- שימוש חוזר ארגוני: מציג את השיטה כבסיס ליכולת הניתנת לשימוש חוזר ולא כטכניקה לשימוש חד-פעמי, וזאת באמצעות פרוטוקולי עיגון וגירוי סטנדרטיים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: ביטחון ניבוי, תיקוף מטרה, הפחתת עמימות מכניסטית.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה, הדירות ויכולת הרחבה.
- ערך אסטרטגי: קבלת החלטותיעה יותר לגבי המשך התהליך (go/no-go), יעילות הון והפחתת סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים.
- השפעה על תיק הפיתוח: תעדוף והחלטות קידום מותאמות לסיכון.
שיקולי יישום
- מומחיות מדעית נדרשת בפיזיולוגיה של השריר, עקיradians של קרני רנטגן (X-ray diffraction), וטיפול במודלים טרנסגניים.
- צרכים של תשתית מכשור ואנליזה, הכוללים קווי קרן של סינכרוטרון, חיישני כוח במצב כפול (dual-mode force transducers), ומערכות רכישת נתונים מסונכרנות.
- דרישות לסטנדרטיזציה בין צוותים עבור פרוטוקולים של דיסקציה, קיבוע וגירוי של שרירים במעבדות שונות.
- שיקולי התאמה בין מערכות מודלים, ובמיוחד עבור שרירי עכבר שונים ומודלים של מחלות.
- מגבלות מעשיות הנתמכות על ידי חומרי המקור, כולל הצורך בדיסקציה נקייה למניעת זיהום מפסית (fascia) ושמירה על שלמות הדגימה במהלך החשיפה.
