Name: צילום רנטגן של שריר השלד Murine שלמים ככלי לחקר בסיס מבניים של מחלת שרירים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-18T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: חקור מבנה שרירי שלד בעכברים באמצעות עקיפת קרני רנטגן בזווית קטנה. שיטה זו חושפת שינויים מבניים בסרקומרים ומסייעת להבנת מנגנוני מחלות שריר תורשתיות ופיתוח טיפולים חדשים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה משמש משאבים של מקור פוטון מתקדם, ארה ב. משרד האנרגיה (DOE) המשרד של מתקן משתמש המדע מופעל עבור המשרד DOE של המדע על ידי המעבדה הלאומית של ארגוננה תחת חוזה לא. דה-AC02-06CH11357. פרויקט זה היה נתמך על ידי גרנט P41 GM103622 מן המכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית של המכון הלאומי לבריאות. השימוש של מכונת הפילאטוס 3 1M גלאי סופק על ידי הענקת 1S10OD018090-01 מתוך כמיאמים. התוכן הוא רק באחריות המחברים ואינו משקף בהכרח את ההשקפות הרשמיות של המכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית או המוסדות הלאומיים לבריאות.

כל הפרוטוקולים ניסויים בעלי חיים אושרו על ידי מכון אילינוי לטיפול בעלי חיים מוסדיים ועדת השימוש (פרוטוקול 2015-001, תאריך אישור: 3 נובמבר 2015) ואחריו NIH "מדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה"9 .
1. הכנה לפני ניסויים
<ol><li>הכינו 500 mL של הפתרון של המצלצל (מכיל: 145 מ"מ הנאל, 2.5 מ"מ KCl, 1.0 mM MgSO4, 1.0 Mm cacl2, 10.0 mm hepes, 11 מ"מ גלוקוז, pH 7.4) טרי עבור כל יום של הניסוי.</li>
	<li>מילוי 200 mL של התמיסה של המצלצל בבקבוק ספריי וחנות במקרר 4 ° c. ממלאים צלחת פטרי (בקוטר 10 ס מ) עם התמיסה של הצלצול ומבשם עם 100% חמצן על ידי חיבור הצינור מצילינדר חמצן לאבן האוויר באקווריום. מנות פטרי ("לבתר צלחות") היו מצופות בעבר במתחם אלסטומר כדי לאפשר החדרת פינים במהלך הניתוח.</li>
	<li>הכינו ווים הרכבה מתכת. חותכים שתי חתיכות של חוט נירוסטה, 0.5 מ"מ קוטר, לאורך המתאים ולכופף את החוט בשני הקצוות לטופס קרסים. לסדר את כל הכלים הבתר, מספריים, תפרים קשירת מלקחיים, מיקרו מספריים שימושי לשימוש. הערה: חלק הקרס אמור להיות. בערך 3 מ"מ החוט הארוך (המסתיים בקרס) צריך להיות כ -5 ס מ, והחוט הקצר יותר (המסתיים גם בקרס) צריך להיות בערך 1 ס מ בכדי להתאים את התאים המותאמים אישית המשמשים ב BioCAT ולאפשר מגוון מספיק של תנועה לזרוע מתמר.</li>
	<li>
התחבר והפעל את כל הציוד. זה כולל מנוע משולב/כוח מתמר, מנוע/כוח מתמר בקר הכוח גבוהה bi-phasic מגירוי הנוכחי, ואת מערכת מבוקרת נתונים לרכישה/בקרה של המחשב.
	<ol>
<li>הפעל את מערכת רכישת הנתונים וכיול אותה לפני תחילת הניסוי10. בקצרה, כיול הכוח על ידי הוספת קבוצה של משקולות ידועות, כיסוי עד 50% מהכוח המקסימלי הנמדד על ידי מתמר הכוח בהתקדמות ליניארית, על מתמר הכוח להקליט את שינויי מתח הפלט. כיול את האורך על-ידי החלת מערכת של מתח פלט ידוע על זרוע המנוף ולמדוד את שינוי האורך של הזרוע.</li>
		<li>חבר את הזרנוקים מהבלוק התרמי על מחזיק הדגימה לאמבט מחזורי בקירור והגדר את הטמפרטורה כדי לשמור על הטמפרטורה הרצויה בחדר בין 10 ° c ו-40 ° c. לקבוע את התקופה הזאת לפני הזמן על ידי הגדרת אמבט המחזור למגוון טמפרטורות ומדידת הטמפרטורה בחדר עם זוג תרמותרמי.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. הכנה לשריר
<ol><li>
המתת חסד של העכבר
	<ol>
<li>המתת החסד של העכבר על ידי שאיפת פחמן דו חמצני ואחריו פריקה צוואר הרחם.</li>
		<li>רסס את העור על הגפיים האחוריות עם הפתרון של הצלצול הקרה כדי למנוע מהשיער לנשוף לתוך התכשיר. להסיר את העור על ידי חיתוך אותו סביב הירך באמצעות מספריים חיתוך משובח במהירות למשוך את העור למטה באמצעות מלקחיים5 כדי לחשוף את השרירים.</li>
		<li>לקטוע את הגפיים האחוריות ולהעביר אותו למנה מחולקת שהיתה מלאה בתמיסה של מתחזה, ולאחר מכן מניחים מתחת למיקרוסקופ מבתר.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
הכנת שריר הסוליה
	<ol>
<li>הצמד את הגפיים האחוריות למטה בצלוחית הבתר כאשר השריר הגקצ'מיוס פונה כלפי מעלה. חותכים את הגיד המרוחק של קבוצת השריר הגסולמיאוס/סוליה ומרימים את השרירים בעדינות ובאיטיות על ידי חיתוך הfascia משני צדי השריר הגקטמיאוס באמצעות מספריים עדינים. בודד את קבוצת השריר הגקטמיוס/סוליה מהגפיים לאחר שחרור הגיד האבובי של שריר הסוליה.</li>
		<li>הצמד את קבוצת השרירים המכילה את השריר הגקטנמיוס ואת הגיד המרוחק למטה בצלחת הבתר. הרימו את שריר הסוליה בעדינות דרך הגיד האבובי והפרידו אותו מן השריר הגקטמיאוס, והשאירו כמה שיותר מגיד הסוליה המרוחק.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
הכנת שריר פושט השריר (אדי)
	<ol>
<li>הצמד את הגפיים האחוריות למטה בתוך הצלחת הבתר עם השריר הקדמי החישורי הפונה כלפי מעלה. חותכים את הfascia לאורך השריר הקדמי הפיזי (TA) ולמשוך אותו ברור באמצעות מלקחיים. לזהות ולחתוך את הגיד המרוחק של שריר ת א. הרם את שריר ה-TA וחתוך אותו בזהירות מבלי למשוך בשריר אדי.</li>
		<li>חותכים את הצד הצדדי של הברך וחושפים את שתי הגידים. חותכים את הגיד הגדול ביותר, לעזוב את הגיד ככל האפשר עדיין מחובר שריר, ולהרים את השריר אדי (שריר המדיאלי) על ידי משיכת בעדינות את הגיד. תחתוך את הגיד המרוחק. ברגע שהוא ייחשף</li>
	</ol>
</li>
	<li>
הרכבת השריר
	<ol>
<li>הצמד את השריר דרך הגידים, וקצץ את כל השומן, הfascia והגיד הנוספים במרחק רב ככל האפשר. הכנס גיד אחד לקשר מראש קשור ולקשור תפר הדוק עם מלקחיים קשירת תפרים. תקשור את הקשר השני. סביב קרס המתכת</li>
		<li>חזור על אותו ההליך עם קרס ארוך בקצה השני של הגיד. ודא שאין קשר בין גוף השריר לבין התפרים. . זה יפגע בהכנה</li>
		<li>חברו את הקרס הקצר לחלק התחתון של החדר הנסיוני ואת הקרס הארוך למצב כפול כוח מתמר/מנוע. בועת הפתרון בחדר ניסיוני עם 100% חמצן.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
אופטימיזציה של פרוטוקולי גירוי ואורך שרירים
	<ol>
<li>למתוח את השריר על ידי התאמת המיקרומניפולציה המצורפת מתמר/מנוע כדי ליצור מתח בסיסי בין 15 עד 20 mN לפני מציאת הפרמטרים הגירוי הטוב ביותר. הגדר את מתח הגירוי ל-40 V. זרם הגירוי מוגבר באופן שיטתי עד שאין עלייה נוספת בכוח העווית. הזרם הגבוה ביותר שנמצא הוא גדל על ידי כ 50% כדי להבטיח הפעלה מקסימלית.</li>
		<li>מצא את האורך האופטימלי, L0, מוגדר כאורך השריר הנותן כוח עווית מקסימלית, על ידי הגדלת אורך השריר והפעלת השריר עם עווית אחת עד הכוח הפעיל (כוח שיא פחות כוח בסיסית) מפסיק להגדיל.</li>
		<li>בצע התכווצות הטטאית קצרה (1 s הפעלה) כדי לבדוק את ההרכבה ולמתוח את השריר חזרה כוח בסיסי אופטימלי במידת הצורך. הקלט את אורך השריר ב-mm עם caliper דיגיטלי.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. עקיפה של קרני רנטגן
הערה: התיאור הבא הוא עבור ניסויים עקיפה רנטגן שנעשו באמצעות המכשיר הקטן לעקיפה רנטגן על BioCAT בבית ב-18 ID במקור פוטון מתקדם, ארגוננה המעבדה הלאומית אבל שיטות דומות יכול להיות מועסק על beamline אחרים כגון ID 02 ב-ESRF (צרפת) ו-BL40XU at SPring8 (יפן). Beamline 18 ID מופעל באנרגיה של קרן רנטגן קבועה של 12 קוו (0.1033 ננומטר גל) עם שטף האירוע של ~ 1013 פוטונים לשנייה בקרן מלא.
<ol><li>לבחור דגימה למרחק גלאי (אורך המצלמה). השתמש אורך מצלמה 1.8 m עבור ניסויים בוחן את 2.7 ננומטר אקטין וסדר גבוה רירן השתקפויות כגון 2.8 ננומטר meridional השתקפויות. השתמש 4-6 m מצלמה עבור ניסויים אחרים, שם אחד מתעניין בעיקר פרטים עדינים על מרידיאן ושכבות שורות</li>
	<li>
אופטימיזציה של מיקום המדגם בקורה
	<ol>
<li>קבעו את תנוחת הקרן בעזרת פיסת נייר רגישה לצילום רנטגן המפיקה נקודה אפלה בתגובה לצילומי רנטגן ("צריבה"). לאחר מכן השתמש במחולל וידאו צלב שיער כדי ליצור צלב שיער מיושר עם סימן הכוויה על הנייר או פשוט לסמן על מסך הווידאו עם עט סמן.</li>
		<li>השתמש BioCAT סיפק ממשק משתמש גרפי לעמדת המדגם כדי להזיז את השריר כדי להיות ממורכז על מיקום הקרן. נדנוד בחדר המדגם ב ~ 10-20 מ"מ/s על ידי הזזת שלב המדגם כדי להפיץ את המינון רנטגן על השריר במהלך החשיפה. צפו במדגם כפי שהוא נע כדי להימנע אזורים גדולים של fascia (מכיל קולגן אשר לזהם את דפוסי עקיפה) ולוודא שהוא נשאר מואר במהלך כל הדרך של הנסיעה שלה. הערה: הצעדים המדויקים הדרושים בסעיפים 3.3 ו 3.4 כדי להפוך את ההגדרות והפעולות הנדרשות באמצעות ממשק המשתמש הגרפי שסופקו על-ידי הממשק יהיה מוגדר בתור וגלאי. בקשו מאנשי הצוות לבצע פעולות אלה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
הגדרת CCD (החיוב מצמידים המכשיר) גלאי עבור דפוסים ברזולוציה גבוהה מן השריר במצבים סטטיים מוגדרים (נח, או במהלך התכווצות איזומטרי)
	<ol>
<li>הגדר את זמן החשיפה ואת תקופת החשיפה בממשק המשתמש הגרפי לתוכנת הבקרה. קח תמונת רקע כהה לפני נטילת החשיפה ולחזור על הליך זה כל 2 שעות או לאחר שינוי של זמן חשיפה כדי לתקן את כל הסחף בתוך גלאי האלקטרוניקה הבדיקה.</li>
		<li>מחליש את קרן הרנטגן לערך הרצוי לחשיפה. . אז צלם תמונה לא ניתן לקחת רצפים של תמונות עם גלאי זה. גלאי CCD צריך גם כמה שניות כדי לקרוא תמונה בודדת.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
הגדרת גלאי מערך הפיקסלים עבור ניסוי שנפתר בזמן
	<ol>
<li>הגדר את מספר התמונות, זמן החשיפה, תקופת החשיפה בממשק המשתמש הגרפי. גלאי מערך הפיקסל המשמש כאן צריך לפחות 1 ms כדי הבדיקה. תדר המסגרת המרבי לגלאי הפוטון הוא 500 Hz. השתמש באות הפוטון של מכונת ספירת הפוטונים כדי לשלוט בתריס X-ray.</li>
		<li>מחליש את הקורה לעוצמה הרצויה. חמש את הגלאי והמתן להדק. ממערכת רכישת הנתונים סנכרן את נתוני הרנטגן המכני על-ידי הפעלה בו. דפוסי רנטגן נאספים ברציפות ברחבי הפרוטוקול a עם 1 ms זמן חשיפה 2 ms תקופת חשיפה. הערה: את זמן החשיפה המדויק ואת תקופת החשיפה יש לקבוע על מקרה על ידי בסיס מקרה של המידע הרצוי ואת החיים הנצפים של המדגם בקרן. מחליש את הקרן כדי לא להשתמש יותר קרן רנטגן מאשר נדרש כדי לספק נתונים analyzable בתקופת החשיפה שנבחרה.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. לאחר הניסוי טיפול שרירים
<ol><li>להתאושש ולשקול את השריר אחרי כל ניסוי רנטגן מכני. לחשב את האזור חתך החתך של השריר באמצעות אורך השריר נמדד ואת מסת השריר11 בהנחה צפיפות שריר של 1.06 g/mL12.</li>
	<li>למתוח את השריר לאורך ניסיוני ולתקן את השריר ב 10% פורמלין עבור 10 דקות. הפרד את השריר קבוע לסדרה של צרורות סיבים שנבחרו ממיקומים ברחבי כל חתך השריר כולו3.</li>
	<li>למדוד את אורך סרקומר באמצעות וידאו סרקומר אורך מערכת מדידה.</li>
</ol>

<ol><li>Ma, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thick-Filament+Extensibility+in+Intact+Skeletal+Muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Thick-Filament Extensibility in Intact Skeletal Muscle.</a> Biophysical Journal. 115 (8), 1580-1588 (2018).</li>
<li>Ma, W., Gong, H., Irving, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+Head+Configurations+in+Resting+and+Contracting+Murine+Skeletal+Muscle%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Myosin Head Configurations in Resting and Contracting Murine Skeletal Muscle.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (9), (2018).</li>
<li>Kiss, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nebulin+stiffens+the+thin+filament+and+augments+cross-bridge+interaction+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Nebulin stiffens the thin filament and augments cross-bridge interaction in skeletal muscle.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (41), 10369-10374 (2018).</li>
<li>Ochala, J., Gokhin, D. S., Iwamoto, H., Fowler, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pointed-end+capping+by+tropomodulin+modulates+actomyosin+crossbridge+formation+in+skeletal+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Federation+of+American+Societies+for+Experimental+Biology+Journal%22%5BJournal%5D)">Pointed-end capping by tropomodulin modulates actomyosin crossbridge formation in skeletal muscle fibers.</a> Federation of American Societies for Experimental Biology Journal. 28 (1), 408-415 (2014).</li>
<li>Lindqvist, J., Iwamoto, H., Blanco, G., Ochala, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fraction+of+strongly+bound+cross-bridges+is+increased+in+mice+that+carry+the+myopathy-linked+myosin+heavy+chain+mutation+MYH4%28L342Q%29%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">The fraction of strongly bound cross-bridges is increased in mice that carry the myopathy-linked myosin heavy chain mutation MYH4(L342Q).</a> Disease Models & Mechanisms. 6 (3), 834-840 (2013).</li>
<li>Huxley, H. E., Stewart, A., Sosa, H., Irving, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-ray+diffraction+measurements+of+the+extensibility+of+actin+and+myosin+filaments+in+contracting+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">X-ray diffraction measurements of the extensibility of actin and myosin filaments in contracting muscle.</a> Biophysical Journal. 67 (6), 2411-2421 (1994).</li>
<li>Wakabayashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-ray+diffraction+evidence+for+the+extensibility+of+actin+and+myosin+filaments+during+muscle+contraction%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">X-ray diffraction evidence for the extensibility of actin and myosin filaments during muscle contraction.</a> Biophysical Journal. 67 (6), 2422-2435 (1994).</li>
<li>Anderson, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mavacamten+stabilizes+a+folded-back+sequestered+super-relaxed+state+of+%CE%B2-cardiac+myosin%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Mavacamten stabilizes a folded-back sequestered super-relaxed state of β-cardiac myosin.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2018).</li>
<li>National Research Council. Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Guide for the care and use of laboratory animals. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Institute+for+Laboratory+Animal+Research+%28U.S.%29+%26+National+Academies+Press+%28U.S.%29%22">Institute for Laboratory Animal Research (U.S.) & National Academies Press (U.S.)</a>. , National Academies Press. (2011).</li>
<li>Rand, C. How to Calibrate Your Dual-Mode Lever System Using DMC. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://aurorascientific.com/how-to-calibrate-your-dual-mode-lever-system-using-dmc/">https://aurorascientific.com/how-to-calibrate-your-dual-mode-lever-system-using-dmc/</a> (2017).</li>
<li>Alexander, R. M. V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dimensions+of+knee+and+ankle+muscles+and+the+forces+they+exert%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Human+Movement+Studies%22%5BJournal%5D)">The dimensions of knee and ankle muscles and the forces they exert.</a> Journal of Human Movement Studies. 1, 115-123 (1975).</li>
<li>Burkholder, T. J., Fingado, B., Baron, S., Lieber, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+between+Muscle-Fiber+Types+and+Sizes+and+Muscle+Architectural+Properties+in+the+Mouse+Hindlimb%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Morphology%22%5BJournal%5D)">Relationship between Muscle-Fiber Types and Sizes and Muscle Architectural Properties in the Mouse Hindlimb.</a> Journal of Morphology. 221 (2), 177-190 (1994).</li>
<li>Jiratrakanvong, J., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJiratrakanvong%2C+J+%22MuscleX%3A+software+suite+for+diffraction+X-ray+imaging+V1.13.1%22">MuscleX: software suite for diffraction X-ray imaging V1.13.1</a>. , (2018).</li>
<li>Reconditi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+filament+activation+in+the+heart+is+tuned+to+the+mechanical+task%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Myosin filament activation in the heart is tuned to the mechanical task.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (12), 3240-3245 (2017).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

פרסומים אחרונים מהקבוצה שלנו הראו כי X-ray דפוסי משריר השלד העכבר ניתן להשתמש כדי לשפוך אור על מידע מבניים sarcomeric משריר בריאות ומחלה1,2,3 במיוחד עם הזמינות מוגברת של מודלים העכבר גנטית שונה עבור myopathies שונים. מחקרים מכניים ברזולוציה גבוהה על סיבים בודדים או צרורות קטנים בשילוב עם עקיפה רנטגן הטוב ביותר נעשה על ידי מומחים. אם, עם זאת, מידע מכני צנוע יותר יספיק למטרותיך, הכנת השריר כולו מאפשר אוסף של דפוסי רנטגן מפורטים מתוך הכנה פשוטה.
ניתוח נקי הוא המפתח לניסוי. מכני ורנטגן מוצלח חשוב מאוד לא למשוך את השריר היעד, כמו גם שרירים אחרים הקשורים שרירי הסוליה או אדי במהלך הניתוח מאז זה יכול לקרוע חלקים של השריר ולהוביל כוח מופחת. זה יכול גם להוביל מבנה פנימי פגום כי לבזות את דפוסי רנטגן. מאז הכל יהיה לפזר את קרן רנטגן, חשוב לנקות כל שומן נוסף, את הקולגן ב fascia, כמו גם שערות או פיסות רופף של רקמות תוך כדי לעשות את הפרוטוקול הבא. כדי להקטין את התאימות הנוספת בהכנת השריר, חשוב גם לקשור את הגידים בצורה מאובטחת ווים, קרוב ככל האפשר לגוף השריר מבלי להזיק לו.
זמני חשיפה שונים של קרני רנטגן יכולים לספק סוגים שונים של מידע מאותו שריר. באמצעות קרן מלא על 18 ID, דפוס המשוונית analyzable ניתן לקבל בחשיפה 1 ms (ראה איור 2ד). עבור analyzable first רירן שכבת השתקפות קו, 10 ms זמן חשיפה כוללת נדרש בדרך כלל. כדי לאסוף הרהורים meridional הסדר גבוה כגון M15 (2.8 nm רירן meridional השתקפות) ו 2.7 ננומטר אקטין meridional השתקפות, בדרך כלל לפחות 1 s החשיפה הכוללת נדרשת אבל יותר 2 החשיפה הכוללת מומלצת לדיוק גבוה דידות.
הבחירה של גלאי הרנטגן האופטימלי לניסוי היא חשובה. עבור תבניות רנטגן המפורט ביותר מזהה CCD מותאם אישית, כגון אחד ב biocat עם ca. 40 יקרומטר פיקסלים ו ~ 65 יקרומטר נקודת התפשטות הפונקציות זרחן, יכול לספק דפוסים עם טווח דינמי גבוה ורזולוציה מרחבית טובה אבל יכול לקחת רק מסגרת אחת בכל פעם. עבור ניסויים בזמן שנפתרו, הפוטון סופר מערך פיקסל גלאי ב BioCAT יכול לאסוף תבניות רנטגן ב 500 Hz. הגודל 172 יקרומטר פיקסל עם גלאי זה, עם זאת, אינו מספק רזולוציה מרחבית מספיק עבור מחקרים מפורטים של החלק הפנימי של מרידיאן אבל הוא הולם למטרות אחרות ביותר. Biocat רכשה גלאי הפוטון ברזולוציה גבוהה המספקת 75 יקרומטר ברזולוציה אמיתית בקצב הפריימים המקסימלי של 9,000 Hz. גלאים דומים מסוג זה צפויים לעבור הגלאים הנוכחי עבור לימודי שרירים במהלך השנים הקרובות.
עם פלקסים גבוהים מאוד של קרני רנטגן בsynchrotrons דור שלישי, נזק הקרינה היא דאגה רצינית. זו תמיד בחירה טובה כדי להחליש את הקרן כדי לספק לא יותר קרן מאשר צריך להתבונן בתכונות עקיפה הרצוי. החשיפה הכוללת של קרני רנטגן יכולה להיות מושגת על ידי הארכת זמן החשיפה מקורה מחליש. יתרון של פוטון ספירת מערך פיקסל גלאי הוא כי מסגרות בודדות ניתן לסכם יחד עם עונש לא רעש. גם אז, נזק לקרינה אפשרי. סימנים של נזק הקרינה כולל ירידה של כוח מירבי של התכווצות, מריחת שכבה קו השתקפויות, אפילו שינוי של צבע שריר.
אחת המגבלות של הכנה שריר השלד שרירי העכבר הוא הקושי בהשגת אורך סרקומר מן השריר שלמים במהלך הניסויים. השרירים עבים מדי עבור מיקרוסקופ וידאו ועקיפה לייזר. בעוד עם התפתחויות עתידיות זה יכול להיות אפשרי להעריך את אורך סרקומר ישירות מדפוסי עקיפה14, בטווח הקרוב האפשרות היחידה היא למדוד את זה אחרי הניסוי כפי שמתואר כאן.

סינכרוטרון קטן זווית X-ray עקיפה היא שיטת הבחירה עבור לימוד מבנה ננומטר בקנה מידה של הכנות באופן פעיל ההכנות שרירים בתנאים פיסיולוגיים. חשוב מכך, מידע מבני מהחיים או ההכנות לשרירי העור ניתן להשיג בסנכרון עם נתונים פיזיולוגיים, כגון כוח השריר ושינויי אורך. יש כבר עניין גובר על יישום טכניקה זו כדי ללמוד את הבסיס המבני של מחלות שרירים תורשתית כי יש בסיס שלהם מוטציות נקודה בחלבונים sarcomeric. הקהילה ביופיזיקה שרירים היתה פעילה מאוד ביצירת מודלים העכבר הטרנסגניים עבור מצבים אלה המחלה האנושית שיכול לספק מיטות בדיקה אידיאלית למחקרים מבניים. הפרסומים האחרונים של הקבוצה שלנו1,2,3 ואחרים4,5 הראו כי דפוסי רנטגן של העכבר פושט השרירים הארוך (אדי) ושרירי הסוליה יכולים לספק את כל ה מידע עקיפה זמין אורגניזמים מסורתיים יותר מודל כגון צפרדע וארנבת psoas שריר השלד. יתרון של הכנה השלד שריר העכבר הוא הקלות של הניתוח וביצוע ממברנה בסיסית-שלמים, ניסויים פיזיולוגיים שרירים שלמים. הממדים של השריר גזור יש מספיק מסה כדי להניב דפוסי שריר מפורטים מאוד בזמני חשיפה קצרים מאוד רנטגן (~ אלפית שניה לכל מסגרת) על הדור השלישי רנטגן beamlines.
דפוסי עקיפה של רנטגן שרירים מורכבים של הרהורים המשוונית, השתקפויות meridional, כמו גם את השתקפות קו השכבה. יחס האינטנסיביות המשוונית (יחס של האינטנסיביות של 1, 1 ו-1, 0 הרהורים המשוונית, אני11/i10), הוא מתואם באופן צמוד למספר הגשרים המצורפים, אשר פרופורציונאלית לכוח שנוצר בשריר השלד העכבר 2. הרהורים meridional המדווחים על פרידיערים בתוך חוטים עבים ודקים יכולים לשמש להערכת הרחבה פילמנט1,3,6,7. תכונות עקיפה לא על המרידיאן ואת קו המשווה נקראים קווי שכבה, אשר נובעים רירן ראשים המסודרת בקירוב על פני השטח של חוט השדרה עבה, כמו גם חוטים דקים בקירוב המסודרת. העוצמה של קווי רירן שכבה קשורה קשר הדוק לדרגת ההזמנה של ראשי רירן בתנאים שונים2,8. כל מידע זה ניתן להשתמש במחקר התנהגויות של חלבונים sarcomeric באתרו בריאות ומחלות.
סינכרוטרון X-ray עקיפה של השריר כבר נעשה היסטורית על ידי צוותי מומחים מאוד מיוחדים אך התקדמות בטכנולוגיה וזמינות של כלי הפחתת נתונים חדשים מצביעים על כך לא צריך תמיד להיות במקרה. BioCAT Beamline 18 ID במקור פוטון מתקדם, המעבדה הלאומית ארגוננה הקדיש צוות ותמיכה מתקנים לביצוע ניסויים שרירים לעקיפה רנטגן שיכולים לעזור למצטרפים חדשים לשדה להתחיל באמצעות טכניקות אלה. משתמשים רבים בוחרים לשתף פעולה באופן רשמי עם צוות BioCAT, אבל מספר גדל והולך של משתמשים למצוא שהם יכולים לעשות את הניסויים וניתוח עצמם להפחית את הנטל על צוות beamline. המטרה העיקרית של הנייר הזה היא לספק הכשרה המספקת ניסויים פוטנציאליים עם המידע שהם צריכים לתכנן ולבצע ניסיונות על מערכת שריר השלד של העכבר או ב biocat beamline או ב השטף הגבוה אחרים beamline ברחבי ה עולם שבו. הניסויים האלה יהיו אפשריים

<table><tbody><tr><td>#5 מלקחיים</td><td>WPI</td><td>500342</td><td></td></tr><tr><td>4/0 תפר כירורגי</td><td>Braintree Sci</td><td>SUT-S 108</td><td></td></tr><tr><td>אקווריום אבן</td> אוויר <td>uxcell</td><td></td><td>אבן אוויר רגילה מחנות לחיות מחמד תהיה בסדר</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5670</td><td></td></tr><tr><td>גלאי CCD</td><td>Rayonix Inc</td><td>MAR 165 נתוני CCD</td><td></td></tr><tr><td> מערכת רכישה</td><td>Aurora Scientific Inc</td><td>610A</td><td></td></tr><tr><td>תרכובת אלסטומר</td><td>Dow Corning</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>גלוקוז</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>גלאי ספירת פוטונים ברזולוציה גבוהה</td><td>Dectris Inc</td><td>EIGER X 500K</td><td></td></tr><tr><td>ממריץ זרם דו-פאזי בעל הספק גבוה</td><td>Aurora Scientific Inc</td><td>701</td><td></td></tr><tr><td>מספריים לקשתית</td><td>WPI</td><td>501263-G</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>מיקרו מספריים</td><td>WPI</td><td>503365</td><td></td></tr><tr><td>מתמר מנוע/כוח</td><td>Aurora Scientific Inc</td><td>300C-LR</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>צלחת פטרי</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430167</td><td></td></tr><tr><td>גלאי ספירת פוטונים</td><td>Dectris Inc</td><td>Pilatus 3 1M</td><td></td></tr><tr><td>חוט נירוסטה</td><td>McMaster-carr</td><td>8908K21</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים לקשירת תפרים</td><td>WPI</td><td>504498</td><td></td></tr><tr><td>מערכת מדידת אורך סרקומר וידאו</td><td>Aurora Scientific Inc</td><td>900 מיליארד</td><td></td></tr></tbody></table>

צילום רנטגן של שריר השלד murine שלמים ככלי לחקר בסיס מבניים של מחלת שרירים

X-ray Diffraction of Intact Murine Skeletal Muscle as a Tool for Studying the Structural Basis of Muscle Disease

מודלים העכבר הטרנסגניים היו כלים חשובים ללימוד הקשר של גנוטיפ כדי פניטיפים עבור מחלות האדם כולל אלה של שריר השלד. שריר השלד העכבר הוכח לייצר באיכות גבוהה X-ray עקיפה דפוסי על הדור השלישי סינכרוטרון beamlines מתן הזדמנות לקשר שינויים ברמה של גנוטיפ לפנוטיפים פונקציונליים בבריאות ומחלה על ידי קביעת ההשלכות המבבניות של שינויים גנטיים. אנו מציגים פרוטוקולים מפורטים להכנת דגימות, איסוף דפוסי רנטגן ומיצוי פרמטרים רלוונטיים מבניים מדפוסי רנטגן שעשויים לסייע להנחות ניסויים לבצע ניסויים כאלה לעצמם.

. התכווצות טטמית איזומטרי כל סוג של ניסוי מכני קלאסי השריר, כגון התכווצויות איזומטרי או איזוטוניקה, ניתן לבצע עם רכישת סימולטני של דפוסי רנטגן. איור 1 מראה את הכיוונון הניסיוני לניסויים מכניים ורנטגן. לדוגמה, מעקב אחר כוח להתכווצות הטטמית האיזומטרית מוצג באיור 1B. השריר הוחזק במנוחה עבור 0.5 s לפני הפעלת עבור 1 s. ההקלטה המכנית עוצרת 1 לאחר הגירוי. דפוסי רנטגן נאספו ברציפות במהלך הפרוטוקול 1 ms זמן חשיפה ב 500 Hz.
דפוסי עקיפה של קרני רנטגן. תבנית עקיפה של קרני רנטגן שרירים יכול לתת מידע מבנה הרזולוציה ננומטר ממבנים בתוך sarcomere. דפוסי עקיפה רנטגן של שרירים מורכבים ארבעה רביעים שווי מחולק על ידי קו המשווה ואת המרידיאן. התבנית המשוונית מתעוררת מהקומופינט אריזה בתוך סרקומר בניצב לציר סיבים, בעוד דפוסי meridional לדווח על מידע מבני מהמיופינט לאורך ציר השריר. ההשתקפויות שנותרו לא על קו המשווה או המרידיאן נקראות קווי שכבה. שורות שכבה (לדוגמה, תכונות המסומנות ב-MLL4 ו-ALL6 באיור 2א) נובעים מהסדר ההאלאני של תת-היחידות המולקולריות בתוך הרירן המכילים חוטים עבים והוא מכיל חוטים דקים. קווי השכבה המבוססת על רירן חזקים וחדים בדפוסים של שריר מנוחה (איור 2א), ואילו קווי שכבה מבוססי actin בולטים יותר בתבניות משריר מכווץ (איור 2ב). דפוסי ההפרש המתקבלים על ידי הפחתת תבנית המנוחה מהתבנית הקבלנית (איור 2ג) ניתן לשפוך אור על שינויים מבניים במהלך פיתוח כוח בשריר בריא וחולה. על-ידי ביצוע שינויים מבניים אלה בסרגל הזמן האלפית של האירועים המולקולריים במהלך התכווצות שרירים, דפוסי עקיפה של קרני רנטגן יכולים לחשוף מידע מבני משמעותי (איור 2ד).
ניתוח נתונים באמצעות מוסקס. הנה דוגמה של ניתוח הרהורים המשוונית באמצעות "המשווה" שגרת החבילה מוסלקס (איור 3). מוסקקס היא חבילת תוכנות לניתוח קוד פתוח שפותחה ב-BioCAT13. יחס האינטנסיביות המשוונית (אני1, 1/1, 0) הוא מחוון של הקרבה של רירן כדי אקטין בשריר מנוחה (איור 3א), בעוד הוא מתואם היטב את מספר הגשרים המצורפים בקבלנות ( איור 3ב) שריר השלד מוריין2. יחס האינטנסיביות, אני1, 1/1, 0, הוא על 0.47 השריר במנוחה ועל 1.2 בשריר מכווץ. המרחק בין השיקוף של 2 1, 0 (2 * S1, 0) הופך להיות קשור בהיפוך לריווח הבין-פילמנט. מתיעוד מפורטים ומדריכים עבור מוסלקס זמינים באינטרנט13.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59559/59559fig1.jpg"> איור 1 : ניסוי מכני ורנטגן התקנה ופרוטוקול. (א) השריר מותקן על קצה אחד לקרס בתוך החדר הנסיוני ואת הקצה השני מנוע במצב כפול/מתמר כוח. הוא מוחזק בין שני חלונות הסרט Kapton כדי לאפשר את צילומי רנטגן כדי לעבור. החדר מלא בתמיסה של המצלצל עם 100% חמצן במהלך הניסוי. (ב) הפרוטוקול המכני לניסויים בקרני רנטגן על שריר במהלך התכווצות הטטמית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59559/59559fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59559/59559fig2.jpg"> איור 2 : דפוסי עקיפה של אדי-רנטגן. דפוס השרירים של אדי שריר רנטגן ממנוחה (A) וקבלנות (ב) שריר. (ג) דפוס ההפרש בין תבנית המנוחה לבין הקבלנות. האזור הכחול מעיד על עוצמה גבוהה בתבנית מנוחה, בעוד שהאזור הצהוב מייצג עוצמה גבוהה בתבנית מתקשרת. (ד) דיפרקציה של קרני רנטגן מחשיפה של 1 אלפיות באמצעות שריר אדי. MLL1 = הסדר הראשון רירן קו השכבה; MLL4 = הסדר הרביעי רירן קו שכבה; ALL1 = הסדר הראשון קו שכבה אקטין ALL6 = קו שכבת אקטין השישי; ALL7 = קו שכבת הסדר השביעי של אקטין; Tm = משתקף השתקפות (מסומן על ידי קופסה לבנה); M3 = meridional הסדר השלישי השתקפות; M6 = הסדר השישי meridional השתקפות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59559/59559fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59559/59559fig3.jpg"> איור 3 : ניתוח נתונים של דפוסי המשוונית באמצעות מוסקקס. הרקע מופחתים על יחס עוצמה המשוונית פרופיל (בעוד שטח) וחמש הזמנות הראשון (קווים ירוקים) היו מתאימים לחשב את העוצמה של כל שיא. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59559/59559fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>

אנו מציגים פרוטוקולים מפורטים לביצוע ניסויים קטנים בזווית רנטגן באמצעות שרירי השלד בעכבר ללא שינוי. בעזרת הזמינות הרחבה של דגמי העכבר הטרנסגניים למחלות אנושיות, פלטפורמה ניסיונית זו יכולה ליצור מיטת בדיקה שימושית להסבר בסיס מבני של מחלות שרירים גנטיות

צילום רנטגן של שריר השלד Murine שלמים ככלי לחקר בסיס מבניים של מחלת שרירים

Transgenic mouse models have been important tools for studying the relationship of genotype to phenotype for human diseases including those of skeletal ...

שריר שלד עכבר שלם מבחינה פיזיולוגית יכול לייצר דפוסי דיפוזיה באיכות גבוהה של קרני רנטגן המכילים מידע מבני רב שיכול לספק תובנה לתהליכים פיזיולוגיים. דיפירציה של קרני רנטגן היא הטכניקה היחידה המאפשרת רכישת מידע מבני ברזולוציה גבוהה מרמת שריר חיה בתנאים פיזיולוגיים אמיתיים בזמן פיזיולוגי אמיתי. מחלות שרירים רבות עוברות בירושה.עם זמינות מוגברת לשנות גנטית את רוב המודלים של מיופתיה, דיפירציה רנטגן יכול לספק תובנות מבניות במנגנוני מחלה ולהצביע על אסטרטגיות טיפוליות. רוב השרירים אוונגוס דיגיטיקום extensor ו soleus נוחים במיוחד למטרה זו. אבל שרירים רבים אחרים בבעלי חיים קטנים ניתן לנתח שלם ומטופל באופן דומה.לפני תחילת ההליך, הפעל את מתמר הכוח המוטורי המשולב, את בקר מתמר הכוח המוטורי עם ממריצה זרם ביפאסיקי בה הספק גבוה, ואת מערכת בקרת נתונים בקרת מחשב. לאחר מכן, לרסס את העור על האיבר האחורי של העכבר עם הפתרון של רינג'ר קר ולהשתמש מספריים ניתוח עדין לחתוך את העור סביב הירך. באמצעות מטליות מספר חמש, למשוך במהירות את העור למטה כדי לחשוף את השרירים לקטוע את האיבר האחורי.מניחים את האיבר בצלחת ניתוח מצופה אלסטומר המכילה את הפתרון של רינגר מחומצן וממקמים את המנה תחת מיקרוסקופ ניתוח משקפת. כדי לקצור את השריר soleus, להצמיד את האיבר האחורי עם שריר gastrocnemius פונה כלפי מעלה. השתמש מספריים עדין לחתוך את הגיד הדיסטלי של קבוצת השרירים gastrocnemius / soleus.חותכים את fascia משני צדי שריר gastrocnemius כדי לאפשר את השרירים להיות הרים בעדינות ולאט לאט מן העצם. ואז לשחרר את הגיד הפרוקסימלי של שריר soleus. הצמד את קבוצת השרירים המכילה את שריר הגסטרוקנמיוס ואת הגיד הדיסטלי בצלחת.הרם את שריר הסוליה בעדינות דרך הגיד הפרוקסימלי כדי להפריד אותו מהשריר gastrocnemius, משאיר כמה שיותר גיד דיסטלי הבלעדית שלם ככל האפשר. כדי לקצור את שריר הדיגיטאורום או EDL, הצמד את האיבר האחורי בצלחת עם השריר הקדמי tibialis פונה כלפי מעלה לחתוך את fascia לאורך השריר הקדמי tibialis. השתמש מטלפים כדי למשוך את fascia ברור לחתוך את הגיד הדיסטלי של השריר לפני השוקיים.להרים את השריר לפני השוקיים לחתוך אותו בזהירות מבלי למשוך על שריר EDL, לחתוך לפתוח את הצד הצדדי של הברך כדי לחשוף את שני הגידים. חותכים את הגיד הפרוקסימלי, משאיר לנו הרבה הגיד ככל האפשר עדיין מחובר לשריר בעדינות למשוך על הגיד כדי להרים את שריר EDL. ואז לחתוך את הגיד דיסטלי ברגע שהוא נחשף.כדי לעלות על השריר שנקטף, להצמיד את השריר דרך הגידים לקצץ כמה שיותר שומן נוסף, fascia וגיד ככל האפשר. הכנס גיד אחד לתוך קשר קשור מראש ולהשתמש מדפים קשירת תפר לקשור את התפר בחוזקה. לקשור את הקשר השני על סביב וו מתכת ולחזור על ההליך בצד השני של הגיד.לאחר מכן חבר את הוו הקצר לתחתית תא הניסוי, ואת הוו הארוך למנוע מתמר הכוח הדו-מצבי. בועה הפתרון בתא הניסוי עם 100% חמצן. כדי לייעל את פרוטוקול הגירוי ואת אורך השריר להתאים את מניפולטורים מיקרו המחוברים למנוע המתמר כדי ליצור מתח בסיסי בין 15 ל 20 מילניטון כדי למצוא את הפרמטרים הגירוי הטוב ביותר למתוח את השריר.הגדר את מתח הגירוי ל-40 וולט. זרם הגירוי יוגדל באופן שיטתי עד שלא תהיה עלייה נוספת בכוח עוויתות. כדי למצוא את האורך האופטימלי, להגדיל את אורך השריר ולהפעיל את השריר עם עווית אחת עד הכוח הפעיל מפסיק להגדיל.בצע התכווצות טטנית שנייה אחת כדי לבדוק את ההרכבה ולמתח את השריר בחזרה לכוח הבסיסי האופטימלי לפי הצורך. ואז להקליט את אורך השריר במילימטרים עם caliper דיגיטלי. כדי לקבוע את מיקום הקרן, השתמש בפיסת נייר רגיש לרנטגן המייצרת נקודה כהה בתגובה לקרני רנטגן ומחולל צלב וידאו כדי ליצור צלב מיושר עם סימן הצריבה על הנייר.באמצעות ממשק המשתמש הגרפי שסופק על ידי BioCAT למיקום המדגם, מרכז את השריר על מיקום הקרן והזז את שלב הדגימה כדי להניף את תא הדגימה ב 10 עד 20 מילימטרים לשנייה כדי להפיץ מינון רנטגן בכל רחבי השריר במהלך החשיפה. שימו לב לדגימה תוך כדי נסיעה כדי להימנע מאזורים גדולים של פאשיה המכילים קולגן ולהבטיח שהוא יישאר מואר לאורך כל נתיב נסיעתו. לחמש את הגלאי ולחכות ההדק ממערכת איסוף הנתונים.לאחר מכן הפעל את הנתונים המכניים ורנטגן באותו הזמן כדי לסנכרן אותם. דפוסי הרנטגן ייאספו באופן רציף לאורך כל הפרוטוקול עם זמן חשיפה של 10 אלפיות השנייה ותזרועת חשיפה של 50 אלפיות השנייה. בהתכווצות טטנית איזומטרית מייצגת זו הוחזק שריר ה-EDL במנוחה למשך 0.5 שניות לפני שהופעל לשנייה אחת, ולאחר מכן רגיעה של 1.5 שניות.תבנית דיפרציה של קרני רנטגן בשרירים יכולה לספק מידע מבני ברזולוציית ננומטר ממבנים בתוך הסרקומר. קווי שכבה מבוססי מיוסין המכילים סיביים עבים הם חזקים וחדים בדפוסים של שריר מנוחה, בעוד קווי שכבה מבוססי actin המכילים סיבי דק בולטים יותר בדפוסים של שריר מתכווץ. דפוסי הבדל המתקבלים על ידי חיסור דפוס המנוחה מתבנית ההתכווצות יכולים לשפוך אור על שינויים מבניים במהלך התפתחות כוח בשרירים בריאים וחלים.על ידי ביצוע שינויים מבניים אלה בציר הזמן אלפית השניה של האירועים המולקולריים במהלך התכווצות שרירים והרפיה, דפוסי דיפוזיה רנטגן יכול לחשוף מידע מבני משמעותי. בניתוח זה של השתקפויות קו המשווה הייצוגיות באמצעות שגרת קו המשווה בחבילת MuscleX בקוד פתוח, יחס העוצמה המשוונית מציין את קרבתו של מיוסין לפעול בשריר המנוחה ומתואם באופן הדוק למספר הצלבות המצורפות בהתכווצות שריר השלד של מורין. המרחק בין השניים 1, 0 השתקפות קשורה הפוך מרווח interfilament.ניתוח נקי הוא המפתח לניסוי רנטגן שרירים מוצלח שלם, אז נסו למנוע נזק מכני במהלך הכנת השרירים. כל פרוטוקול פיזיולוגי סטנדרטי עם שרירים שלמים יכול להיות מיושם בניסויים אלה והוא יכול לשמש לחקר הפעלת שרירים, הרפיה והתנהגות חוצה גשר במהלך ארעיות מכנית מהירה. מניפולציה גנטית של עכברים הופכת למתוחכמת יותר ויותר.מודלים חדשים של עכברים מהו מהודרים יאפשרו לתכנן ניסויים ספציפיים ותובנה יותר כדי להצביע על כיוונים טיפוליים חדשים עבור מיופתיות אנושיות.

x-ray-diffraction-intact-murine-skeletal-muscle-as-tool-for-studying

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

מדידות תפקוד שרירים תורמות להערכה של השרירים רפויים פוטנציאלי לפתולוגיה, כמו גם לקביעת מנגנונים בבסיס פיזיולוגיה של רקמה זו. נדגים הכנת longus extensor digitorum שרירי סרעפת ובדיקה פונקציונלית. יוצגו פרוטוקולים להתכווצויות איזומטרי ואקסצנטריות, כמו גם הבדלים בתוצאות בין שרירי dystrophic, המייצגים מצב פתולוגי, ושרירי wildtype.

הערכת דור חיל איזומטרי והאקסצנטרית של שרירי שלד מבודד ממודלים עכבריים של ניוון שרירים

שינויים בנכסים והתכווצות שרירי גפיים מכאניים פסיביים הם סמנים חשובים למחל שרירים. כתב יד זה מתאר מבחנים פיסיולוגיים למדידת נכסים אלה בlongus העכברי extensor digitorum ושרירים קדמיים tibialis.

הערכה של תפקוד שרירים של שריר extensor digitorum Longus<em&gt; גופיים</em&gt; ושריר קדמי tibialis<em&gt; באתר</em&gt; בעכברים

מחלות Neuromuscular לעתים קרובות מפגינה שונה ובזמן, פתולוגיה הטרוגנית, ורב-פן מרחבית. מטרת פרוטוקול זה היא לאפיין הפתולוגיה הזאת בשיטות הדמיה בתהודה מגנטית לא פולשנית.

דימות תהודה מגנטית כמותי של מחלת שריר שלד

מוצגת כאן שיטה להמחשת מבנה אולטרה-מבנה של מטריצה חוץ-תאית ברקמות לב נטולות תאים.

מיקרוסקופ אלקטרוני סורק של רקמות macerated לדמיין את תאי מטריקס

מדידה של הפונקציה כויץ מכרסמים שרירי השלד הוא כלי שימושי, יכול לשמש כדי לעקוב אחר התקדמות המחלה, כמו גם היעילות של התערבות טיפולית. נתאר כאן את פולשני, אין ויוו ההערכה של השרירים dorsiflexor שיכול לחזור לאורך זמן העכבר באותו.

הערכה בלתי פולשני של תפקוד השרירים Dorsiflexor בעכברים

כאן, אנו מציעים שיטה ביעילות להשיג סיבי שריר בודד בשלב מוקדם לאחר לידה התפתחותית מ homozygous מוטציה Lamin δ 8-11 מודל העכבר, מודל חמור מאוד עבור השרירים נייל-דרייפוס ניוון שרירים (edmd).

בידוד ותרבות בודדים מודל מורנה של קבצי נייל-דרייפוס ניוון שרירים בתחילת לאחר לידה פיתוח

אנו מתארים פרוטוקול לקבלת סיבים מנותקים אנזימטית באורכים וסוגים שונים משישה שרירים של עכברים בוגרים: שלושה מהם כבר תוארו (flexor digitorum brevis, extensor digitorum longus, soleus) ושלושה מהם נותקו בהצלחה בפעם הראשונה (extensor hallucis longus, peroneus longus, peroneus digiti quarti).

סיבי שריר שלד שלמים קצרים, בינוניים וארוכים המתקבלים על ידי דיסוציאציה אנזימטית של שישה שרירי גפיים אחוריות של עכברים: Beyond Flexor Digitorum Brevis

פרוטוקול זה משתמש בטומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת כדי לאפשר כימות חסכוני של מסה רזה, כולל שרירי השלד ורקמת הקרביים, רקמת השומן ורקמת השלד בבעלי חיים קטנים. הוא מבחין בין רקמה רזה לרקמת שומן, מה שמציע יתרונות משמעותיים למחקר ביו-רפואי, במיוחד במחקר תרגומי בבעלי חיים קטנים.

כימות שרירי שלד לא פולשני בבעלי חיים קטנים באמצעות טומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת

סיבי עמילואיד נוצרים על ידי חלבונים רבים, והסיבים המתקבלים חולקים מבנה "β-יריעה". כאן אנו מתארים כיצד ניתן להכין דגימות סיבים אמילואידיים לדיפרקציה של סיבי רנטגן וכיצד ניתן לנתח את הדפוסים.

אמילואיד והארכיטקטורה החוצה-בטא

הזרקות מקומיות של תווית צבע מיטוכונדריאלי סופית של מיטוכונדריה תא שוואן ב-vivo למיקרוסקופיה קונפוקלית. שיטה זו משתמשת בהוכחת היתכנות שהודגמה ברקמת שריר שלד של עכברים עם שריר בריא או חולה, כדי לספק הדמיה מיטוכונדרית ברזולוציה גבוהה.

שיטות לכימות במקום של מורפולוגיית מיטוכונדריה בתאי שריר וסופיים של עכברים

חקור מבנה שרירי שלד בעכברים באמצעות עקיפת קרני רנטגן בזווית קטנה. שיטה זו חושפת שינויים מבניים בסרקומרים ומסייעת להבנת מנגנוני מחלות שריר תורשתיות ופיתוח טיפולים חדשים.

צילום רנטגן של שריר השלד Murine שלמים ככלי לחקר בסיס מבניים של מחלת שרירים

גלה סרטונים נוספים