משלוח הפתוגן מדויק מערכת השחזור של מודלים Murine של דלקת ריאות משנית בקטריאלי

המטרה הכוללת של הליך זה היא לשפר מחקרים משניים דלקת ריאות חיידקית על ידי מתן מסלול פשוט ולא פולשני של חיסון חיידקי לתוך דרכי הנשימה התחתונות ואחריו התאוששות חיידקים וטיהור של RNA לניתוח תמליל. זה יושג על ידי הראשון עמוק הרדמה עכבר החדרת מחט כפופה קהה טעון מראש לתוך קנה הנשימה של עכבר כי כבר מושעה אנכית מן החותכים maxillary. שנית, בעקבות זיהום מוצלח, יחידות יוצרות מושבה חיידקית משוחזרות על ידי כריתה והומוגניזציה של הריאות.

הומוגונט הריאות שנוצר הוא מדולל באופן סדרתי מצופה אגר מים מזינים כדי למנות יחידות יוצרות מושבה. לבסוף, רנ"א מטוהר מההומוגניאט של הריאה. היתרונות של הליך זה הוא שהוא מאפשר משלוח מבוקר ישירות לתוך דרכי הנשימה התחתונות.

זה מאפשר לנו להסתכל הן על התרומות הקומבינטוריות והן על התרומות האישיות של הפתוגן לקראת תוצאות המחלה. ההתקדמות האחרונה בתחום זה הוכיחה כי ויסות גנים חיידקיים עשוי להיות תפקיד גדול בקביעת התוצאה של זיהום. טכניקה זו נהנית מהיכולת לשחזר הן CFUs חיידקי ולאחר מכן RNA.

לאחר RNA מבודד, אז אנחנו יכולים להעריך את התרומות של גנים ארסיים ספציפיים כלפי הזיהום. בנוסף, טכניקה זו נהנית מלהיות לא כירורגית. זה מאפשר לחץ מינימלי להיות ממוקם על כל בעלי חיים המשמשים בהליך זה ומאפשר להם החלמה מיידית.

הליך זה נהנה משימוש בציוד מעבדה משותף ללא שימוש בכל סוג של cannulas, חוטי מדריך או כבלי סיבים אופטיים. אנשים חדשים בטכניקה זו עשויים להיאבק בהתחלה עם ההתקנה בפועל דרך קנה הנשימה. לאחר טכניקה זו מושגת, זה הופך להיות הליך פשוט ויעיל לחקור דלקת ריאות חיידקית משנית בתוך מארח מורין.

לפני תחילת ההליך, הכן את סביבת העבודה עם האספקה הבאה: פלטפורמת צנרור, מזרק mL אחד סטרילי, מדפים סטריליים עם קצה קהה, מחט סטרילית עם קצה קהה של 21 מד ושני צינורות חרוט לאחסון המזרק והמדפים. התחל את ההליך על ידי הכנת אינוקולומים פתוגן, כך הריכוז הסופי הרצוי מתקבל בנפח 50 microliter. לאחר מכן, באמצעות כפפות סטריליות להכין מחט אחת עד 1.5 אינץ' 21-מד קהה קצה על ידי כיפוף אותו לזווית משוערת 35 מעלות.

לאחר תיקון המחט למזרק, לצייר כרית אוויר 100 microliter, ואחריו 50 microliters של הסוכן זיהומיות. כרית האוויר של 100 מיקרוליטר מבטיחה אספקה מלאה של עומס הפתוגן ברגע שהמזרק מדוכא. מניחים את המחט והמזרק הטעונים במיקום הנגיש בקלות על ידי היד הדומיננטית.

הסר והרדים את העכבר מתא ההרדמה והשהה את העכבר על פלטפורמת האינטובציה מהחתכים. בעזרת המדפים עם קצה קהה, תפסו בעדינות והאריכו את הלשון. מעבירים את הלשון מהמדפים לאגודל ולאצבע המורה של היד הלא-דומיננטית.

השאר מחזיק את הלשון ביד הלא דומיננטית להרים את המזרק טעון מראש. כוון את הקצה הכפוף של המחט הרחק מהגוף. הכנס את המחט לחלל הפה.

בבסיס הלשון בעדינות זווית פרק כף היד כדי לגרום דחיפה קלה של המחט הרחק מהגוף. פעולה זו מבטיחה את המחט יהיה מוכנס לתוך קנה הנשימה ולא הוושט. מדריך לאט את המחט לתוך קנה הנשימה.

לעתים קרובות קרצייה קלה מורגשת כאשר המחט עוברת דרך קפל הקול. מעבירים את המחט דרך קנה הנשימה עד שהתנגדות קלה מורגשת כאשר המחט נתקלת בקרינה. הרם מעט את המחט בכיוון כלפי מעלה כדי להשעות את המחט מעל הקרינה.

זה מאפשר משלוח לתוך הסמפונות העיקריות. יש לדכא לחלוטין את בוכנה המזרק כדי לספק את העומס הזיהומי. הסר את המחט מן קנה הנשימה ולהשליך.

הסר את העכבר מפלטפורמת צנרור על ידי מדכא את הגומייה, אבל לשמור על החזקת העכבר במצב זקוף. לחסום את דרכי הנשימה באף על ידי הנחת אצבע ישירות מעל nares. החזק עמדה זו במשך כדקה אחת או עד מספר נשימות עמוקות נצפו.

שלב אחרון זה מבטיח את נפח אינוקולום הכולל מועבר לתוך דרכי הנשימה התחתונות. החזירו את החיה לכלוב שלה וודאו שיש התאוששות מהירה מההרדמה. בנקודות זמן נבחרות לאחר ההידבקות הריאות הנגועים ניתן לכמת ולהעריך את התרומות החיידקיות לתחלואה מוגברת הקשורה לדלקת ריאות חיידקית משנית.

הכן סביבת עבודה עם הפריטים הבאים:סירה במשקל סולם וסטרילי, פלטפורמת ניתוח, ערכת ניתוח המכילה מספריים ומדפים, גזה סטרילית. לצורך הדגמה זו כריתת הריאות תבוצע על ספסל עליון. עם זאת, על מנת לשמור על סטריליות לאורך הליך זה מומלץ כי כריתת הריאות תבוצע בתוך מכסה המנוע לזרימה למינארית.

המתת חסד עכבר נגוע עם CO2 או שיטה מאושרת IACUC דומה של המתת חסד. מקם ואבטח את העכבר הנגוע בפלטפורמת הניתוח. לרסס את העכבר עם אתנול כדי לשמור על סטריליות על משטחי העבודה.

החל מהטבור, השתמש בזוג מדפים כדי להרים את העור ולעשות חתך לכיוון הגרון. אוחזים בעור משני צדי החתך הראשוני, מושכים את העור מהגוף וחותכים דרך חיבורי הרקמה. זה יכול להיות מועיל לעשות חתכים לרוחב על פני העור כדי לחשוף יותר של אזור בית החזה.

החל בבסיס תהליך xiphoid, לעשות חתך קטן מתוך כוונה לנקב את הסרעפת. התוצאה היא עלייה בלחץ בחלל בית החזה גורם לריאות לסגת. עם הריאות נסוגות, להמשיך את החתך כדי לשחרר את הסרעפת.

הסר את הצלעות על ידי ביצוע חתך משני הצדדים. זה יחשוף את חלל בית החזה והריאות. כדי למלמל את הריאות לתפוס את בסיס הלב עם המלקחים ולהרים כלפי מעלה.

מניחים את המספריים מאחורי הריאות ומתחילים לבצע חתכים קטנים דרך חיבורי הרקמה תוך המשך הרמת הלב כלפי מעלה. לאחר שהריאות כבר כריתה, למקם אותם על גזה סטרילית ולהסיר את הלב על ידי הרמת אותו מן הריאות וחיתוך הקשרים הנותרים רקמה. מעבירים את הריאות לסירת השקילה הטרום-מוכתמת ותקליטו את המסה.

לאחר שהריאות נשקלה, מעבירים את הריאות לתמיסת מלח סטרילית עם חיץ פוספט ומאחסנים אותן באופן זמני על קרח. כעת, לאחר שהריאות הוצאו ונשקלו, ניתן לשחזר את החיידקים כדי לקבוע את תפקידם כלפי פתוגנזה. כהכנה להתאוששות חיידקים, האספקה הבאה יהיה צורך:מטחנת רקמות, PBS סטרילי RNase חינם, חיץ RLT בתוספת בטא-mercaptoethanol, ו 1.5 מ"ל RNase ללא צינורות microcentrifuge.

התחל על ידי הוספת תחילה mL אחד של PBS סטרילי RNase חינם למטחנת הרקמות. לאחר מילוי, לאחסן את מטחנת הרקמות על קרח. לאחר מכן, הכינו סדרה של צינורות דילול סדרתיים סטריליים נטולי RNase כדי לכמת את העומס החיידקי שהתאושש מהריאות הנגועים.

מעבירים את הריאות לתוך מטחנה רקמות מוכן ביסודיות הומוגניזציה של הרקמה על ידי לחיצה על הדוכן תוך סיבוב. פתח את מטחנת הרקמות ואת aliquot 100 microliters של המדגם הומוגני לתוך הראשון של צינורות דילול סדרתי מוכן. לדלל באופן סדרתי את הדגימות ואת הצלחת על אגר מים מזינים כדי למנות את יחידות יוצרי המושבה.

CFUs ניתן לתעד CFUs לכל mL או CFUs לכל mL, לכל מיליגרם של רקמת ריאה. לאחר הסרת 100 המיקרוליטרים, החליפו את הדוכן השוחט וצנטריפוגה במדגם ב-4,000 סל"ד למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. כאשר הצנטריפוגה הושלמה, להסיר את supernatant מן המדגם גלולה.

את העל-טבעי ניתן להציל ולאחסן במינוס 80 מעלות צלזיוס לניתוח נוסף במועד מאוחר יותר. להשעות מחדש את גלולת רקמה הומוגנית ב 700 microliters של RLT בטא-mercaptoethanol ולהעביר את המדגם לצינור סטרילי RNase ללא 1.5 מ"ל צנטריפוגה. בשלב זה ניתן לאחסן את המדגם במינוס 80 מעלות.

RNA ניתן לטהר מן תרחיף הומוגנית ריאות RLT על ידי טעינת המדגם לתוך צינור microcentrifuge שני mL המכיל 1 מילימטר חבילות סיליקה מעובד באמצעות מקצף חרוזים במשך 20 שניות בשישה מטרים לשנייה. RNA הוא מטוהר באופן מיידי באמצעות התאמה של שיטת RNeasy כפי שדווח ב Voyich, ואח '. שיטות בביולוגיה מולקולרית"2008, ומתואר בכתב היד המלווה את הסרטון.

לאחר הטיהור, ניתן לכמת את תפוקת הרנ"א באמצעות ספקטרופוטומטר. לאחר כימת, זה מועיל לדלל את RNA וכתוצאה מכך לתוך כמה aliquots של 50 ננוגרם למיקרוליטר. פעולה זו מאפשרת להשתמש ב- RNA מהדגימה לניתוחים מרובים מבלי להיות כפוף למחזורי הפשרת הקפאה מרובים.

השימוש בטכניקה זו מאפשר התקנה של עומס פתוגן מבוקר ישירות לתוך מערכת הנשימה התחתונה. ניתן להדגים את היעילות של מערכת מסירה זו באמצעות התקנה של פתרון כחול מבריק של 1%Coomassie. השורה העליונה מציגה זוג ריאות לא מדביקות שישמשו כפקד, בעוד שהשורה התחתונה מציגה זוג ריאות שקיבלו 50 מיקרוליטרים של הצבע הכחול המבריק של 1%Coomassie באמצעות התקנה תוך-רחפת.

השימוש בצבע זה מדגים כיצד ההתקנה התוך-שרשרתית מספקת חלוקה שווה של עומס הפתוגן לתוך ולאורך כל הריאות השמאלית והימין. לאחר הנגוע, עומס הפתוגן ניתן לשחזר ולנתח בנקודות זמן שונות לאחר ההתקנה האינטראצ'ית על ידי כריתה הומוגניזציה של רקמת הריאה. כדי להדגים את היעילות של טכניקת התאוששות זו שתי קבוצות המכילות שלושה עכברים כל נדבקו במינון נמוך וגוה של סטפילוקוקוס אוראוס.

קלט החיידקים היה מצופה אגר ממזון כדי למנות CFUs. שעה לאחר ההתקנה האינטראצ'ית, העכברים היו מרופדים, ריאות הוצאו והומוגניות במטחנת רקמות. הרקמה ההומוגנית הייתה מדוללת באופן סדרתי ו מצופה אגר ממזון כדי למנות CFUs.

RNA מבודד רקמת הריאה הומוגנית ניתן לבחון על ידי תעתיק הפוך PCR ו משמש לכמת את שפע התמליל היחסי של גנים היעד. כדי להבטיח זיהום DNA רקע מינימלי מומלץ כי תגובת PCR, ללא תוספת של תעתיק הפוך, יופעל לצד כל תגובות qRT-PCR. בנוסף לעומסים חיידקיים, ניתן להאריך טכניקה זו להתקנה ובידוד של עומסים ויראליים.

לאחר הומוגניזציה של רקמת הריאה, RNA ויראלי יכול להיות מבודד ושמש כדי למדוד את שפע התמליל של גנים ויראליים או לבנות עקומה סטנדרטית לכמות ויראלי. השימוש במערכת זו מספק מערכת יעילה מאוד לשחזור ללמוד דלקת ריאות חיידקית משנית. לאחר השליטה, ניתן להשתמש בהליך זה בניסויים בקנה מידה גדול.

עובד בקבוצות כדי המתת לחץ עכברים, ההתקנה התוך-cheal יכול להתרחש בתוך 30 שניות לכל עכבר. לאחר השלמת זה, עובר כריתה של הריאות, זה יכול להסתיים בערך שתיים עד שלוש דקות לכל עכבר. בעוד השיטות שנדונו כאן היו בהקשר של זיהום חיידקי משני, הם יכולים להיות מורחבים לקראת כל הליך שבו משלוח מבוקר והתאוששות של אינוקולום יש צורך.

בנוסף לשיטות המתוארות כאן, הליך זה יכול להיות מתווסף על ידי תוספת של lavage bronchoalveolar לפני כריתת הריאות. בעוד שלעתים קרובות התוצאה היא התאוששות מופחתת של עומס הפתוגן, היא נהנית מהשגת נתונים, כגון ניתוח ציטוקיני, פעילות לקטט דהידרוגנאז וזיהוי אוכלוסיות תאיות שונות. כדי להשיג הבנה מלאה יותר של מחלת פתוגנזה חשוב לחקור הן תרומות מארח פתוגן למחלות.

מטרת הסרטון הייתה לספק שיטה פשוטה ויעילה לחקר דלקת ריאות חיידקית משנית בתוך מארח מורין.