Name: השתלת כימוגנטית מהונדס בקליפת המוח ושלתי לתוך המוחות המוקדמים של העכבר לנטאל (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 s
Description: חקור שיטה לשליטה בפעילות תאי עצב ביניים בקליפת המוח בעכברים ניאונטליים באמצעות כלים כימוגנטיים. הפרוטוקול מאפשר לחקור את השפעת הפעילות הפנימית על הבשלת תאי העצב ותפקוד המוח.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכת על ידי מענק המתחיל ERC (282047), פרס חוקר ברוך הבא (095589/Z/11/Z), מענק תשוקה FP7 EC, ו פרס ליסטר מכון ל JB. העבודה במעבדה של סגן הנשיא נתמכת על-ידי BBSRC (BB/L022974/1), מועצת המחקר הרפואי של בריטניה (MRC), ומכון פרנסיס קריק (אשר מקבל מימון מ-MRC, מחקר הסרטן בבריטניה, והאמון הברוכים). המחקר במעבדת ה-md התאפשר באמצעות המענק מקרן סטבarchos לB.S.R.C. "אלכסנדר פלמינג", כחלק מיוזמת הקרן לתמוך במחקר היווני.

בעלי חיים נולדו ושוכנו בהתאם לחוק בעלי חיים בבריטניה (הליכים מדעיים) (1986).
הערה: עבור הדור של pCAGGs-hM3D (ג ' י)-IRES-RFP לבנות, קטע של סאלי-StuI, המכיל את hM3D (הג) רצף, כבר מבודד פלממיד 50463 (Addgene), והוכנס לתוך הביטוי וקטור pCAGGs-RFP (מתנה של F. Guillemot) מתעכל עם קסהוי-אכרוב
1. הכנת העובר העכבר פרוסות קורטיקלית
<ol><li>לחטא ציוד מעבדה (למשל, מיקרוסקופים סטריאו) ומשטחים (למשל, ספסלים) עם הממס ניקוי המתאים ו 70% אתנול (אטוח) פתרון במים (H2O).</li>
	<li>השתמש בכלי הניתוח שהיו באוטוקלשים ולשמור אותם כל הזמן ב 100% אטוה.</li>
	<li>הכינו 3 20 mL של 4% הטמפ ' הנמוכה ביותר בטמפרטורת מאגר של 1 x פוספט (PBS), בצינורות של 50 mL, ושמרו אותם ב-55 ° c.</li>
	<li>להקריב עכברים בהריון על ידי נקע בצוואר הרחם ב 13.5 או 14.5 ימים של ההיריון (יום מעובי 13.5-E 23.4).</li>
	<li>עם זוג של מספריים לחיתוך, לפתוח את הבטן של עכברים בהריון, להסיר את קרני הרחם (עם העוברים) ולמקם אותם בתמיסת קרבס קר (שולחן 1), בצלחת פטרי 90 מ"מ.</li>
	<li>עם זוג של מלקחיים בסדר התלמיד ישר, לפתוח את שקי השפיר, להסיר את העוברים ולהעביר אותם בתמיסת קרבס טרי קר, בצלחת פטרי חדשה 90 מ"מ. לנתח את המוח העובר העכבר (המוח הקדמי, אמצע המוח, החוצה המוח) משאר הגוף העובר.</li>
	<li>החזקת המוח גזור מן המוח הפגר, להעביר אותם בתמיסת קרבס קר ב-90 מילימטר חדש צלחת פטרי, ולשמור אותם על קרח.</li>
	<li>עם עט עמיד למים, צייר קו ישר במשטח החיצוני, באמצע החלק התחתון של 6 35 מנות פטרי מילימטר.</li>
	<li>מקום אחד 4% נמוך-gelling עשר העשרה בשעה 37 ° c עבור 5 דקות. מיד לאחר מכן המסכן 10 mL ב 2 35 מ"מ מנות פטרי ולהטביע את המוח גזור. הערה: את הריח צריך לעמוד כלפי מטה (בתחתית צלחת פטרי). להטביע 3-4 מוחות לכל צלחת פטרי, ליישר אותם בקו ישר שצויר בעבר. השאר מרווח של 3 מילימטר. בין שני מוחות</li>
	<li>חזור על שלבים 1.8 ו-1.9 עד שכל המוחות המוגזור הוטבעו.</li>
	<li>מניחים את המוח המוטבע ב -4 ° c, כדי לחזק את הצמח, ולאחר מכן לגלף את שלושת המוחות לבלוק אחד של גודל ואוריינטציה מתאימים. הערה: השאירו כ 3 מ"מ מסביב לקצות דגימות המוח. שינוי הכיוון של המוח, עם הנורות ריח על גבי.</li>
	<li>הדבק את הבלוק על פני השטח של בסיס מיקרוטום ובאמצעות להב כירורגי לחתוך כל הדרך בתחתית הבלוק, בין שני המוחות, על מנת ליצור 3 בלוקים עצמאיים (כל מיני בלוק המכיל מוח אחד).</li>
	<li>מקטע את הבלוקים, בתמיסת קרבס קר כקרח, לתוך 250 יקרומטר פרוסות עבות, באמצעות להב רוטט מיקרוטומה.</li>
	<li>עם מיקרו-מרית שטוח בסופו של דבר לאסוף רק את הפרוסות המכילות את המדיליאלים או caulionic מקואל (MGE או CGE; איור 1) ובנפרד להעביר אותם על ממברנות מסנן (13 יקרומטר קוטר, 8.0 יקרומטר גודל הנקבוביות), צף על מדיום חיוני מינימלי (זיכרון, שולחן 1) ב פוליסטירן מרכז-מנות תרבות עוגב (60 מ"מ x 15 מ"מ).</li>
	<li>מניחים את הכלים בחממה לתרבות הרקמה של CO2 , ב-37 ° c, במשך 1, והיכונו לאלקטרופורציה המרכזית.</li>
</ol>2. אלקטרופורציה חדה במוח
<ol><li>לפני תחילת ההליך אלקטרופורציה, להכין 50 mL של 1% העלה ג'ל בצלחת פטרי 100 מ"מ. השאירו את הג ג'ל כדי לגבש בטמפרטורת החדר (RT) במשך כ 30 דקות.</li>
	<li>הכנת עמודות agarose זעיר (קוטר 1 מ"מ ו 10 מ"מ אורך), מנוקב עם פיפטה זכוכית (225 מ"מ אורך; 2 mL קיבולת) ולהעביר אותם פתרונות קרבס קר הקרח. הערה: הנורה טפטפת גומי מתאים 2 להפיפטות mL מחוברת לפיפטה, ועל ידי לחיצה עליו את העמודה ניתן לשחרר מן הצנרת זכוכית לפתרון Krebs.</li>
	<li>עם להב כירורגי, גזור גושי agarose קטנים של שני גדלים: אחד קטן שיתאים על פני השטח של האלקטרודה (ראה להלן) ואחד גדול, אשר ישמש כבסיס לביצוע זריקות ה-DNA המוקד לתוך פרוסות המוח. להעביר את אבני agarose בפתרון קרבס קר גם.</li>
	<li>הכן את הגדרת הזריקות המרכזית ואת האלקטרופורציה החריפה (איור 2). הערה: עבור הזריקות, הציוד הבא נדרש: 1) שדה בהיר לנתיחה סטריאו מיקרוסקופ, 2) מזרק פניאומטי משאבת, 3) מיקרומניפולציה, 4) עמדה מגנטית, ו 5) צלחת פלדה בסיס. עבור electroporation הפרוסה החדה, הציוד הבא נדרש: 1) אחד מרובע פלטינה 10 מ"מ צלחת פטרי אלקטרודה, 2) ריבוע אחד פלטינה 10 מ"מ לכסות אלקטרודה, 3) מיקרומניפולציה, ו 4) אלקטרופורטור.</li>
	<li>
הזרקת דנ א מוקד
	<ol>
<li>להכין תערובת DNA של ביטוי וקטורים: pCAGGs-IRES-GFP (שליטה וקטור) + pCAGGs-hM3D (ג ' קיו)-IRES-RFP, בריכוז של 1 μg/μL עבור כל וקטור ולהוסיף פתרון ירוק מהיר (מניות 25 מ"ג/mL) ב 1/10 דילול.</li>
		<li>למלא מיקרופיפטה זכוכית משכה (0.5 מ"מ קוטר פנימי 1 מ"מ קוטר חיצוני) עם 10 μL של תערובת ה-DNA ולהזריק כמויות קטנות (על הטווח 25-50 nL) לתוך האזור שנבחר (MGE/CGE) של הפרוסה (איור 1 ואיור 2).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
אלקטרופורציה חריפה הערה: האלקטרופורציה צריכה להתבצע מיד. לאחר הזרקת הדי. אנ. איי המרכזית<ol>
<li>מניחים את הבלוק agarose קטן על האלקטרודה צלחת פטרי ולצרף את העמודה agarose לתוך האלקטרודה לכסות ניידים בעזרת מיקרו-מרית הסתיימה שטוח.</li>
		<li>העבר את הפרוסה עם הממברנה התומכת שלו אל הבלוק של agarose והקצה את האלקטרודה העליונה עם העמודה agarose על גבי האזור שנבחר (MGE/CGE) של הפרוסה. הערה: טעינת המתח של 125 V (שני פולסים של 5 ms כל, מרווח 500 ms) תניב אלקטרופורציה מוצלחת (איור 3).</li>
	</ol>
</li>
	<li>לאחר האלקטרופורציה, מניחים את הפרוסה עם הקרום התומך שלה בתוך המנה ומעבירים את המנה בחממה לתרבות הרקמה של CO2 , ב-37 ° c.</li>
	<li>לאחר השעה 1, החלף את המדיום הראשי עבור מדיום בסיסי המתאים לתרבויות הנוירואליות הראשיות (תא עצב בינוני בסיסי; שולחן 1) ומודיית את הפרוסות לילה, תמורת כ 18-24 h.</li>
</ol>3. הכנת תא-שתלי
<ol><li>בדוק את יעילות האלקטרופורציה בכל הפרוסות. בחר רק את הפרוסות שבהן מספר מקובל של תאי פלורסנט נצפה (איור 3). הערה: אלקטרופורה כ-30 פרוסות/לכל ניסוי כדי להשיג את מספר התאים המתאים להשתלת (ראה להלן).</li>
	<li>לנתח את האזור שנבחר (MGE/CGE) מכל פרוסה וחותכים את הרקמה לתוך חתיכות קטנות בתמיסת קרבס קר בקרח, תחת ניתוח פלורסנט מיקרוסקופ-סטריאו.</li>
	<li>בינתיים, המקום שפופרת 1.5 mL עם 900 μL תא עצב בסיסי בינוני באמבט מים ב 37 ° c.</li>
	<li>העבר את חתיכות הרקמה עם P1000 מיקרופיפיאור לצינור 1.5 mL המכיל 500 μL של L15/DNase בינוני מוכן על ידי הוספת 100 μL של 1 מ"ג/mL DNase מלאי ב-d/F12 בינונית לתוך 900 μL של L15 medium. לשטוף את חתיכות הרקמה על ידי הקשה.</li>
	<li>הוסף 100 μL של DNase (מניות 1 מ"ג/mL ב dמדיום/F12 בינונית) לתוך מדיום בסיסית 900 μL.</li>
	<li>להיפטר L15/DNase בינונית ולהשעות מחדש את חתיכות הרקמה 200 μL תא עצב בסיסי/DNase בינוני מוכן בשלב 3.5.</li>
	<li>הגדרת P200 מיקרופיפיפיאור כדי 180 μL ומכנית הנתק את חתיכות הרקמה על ידי ליטוף למעלה ולמטה בעדינות, 20-30 פעמים, עד חלקה ו "קרם" השעיה מתקבל.</li>
	<li>הוסף 200 μL של תא עצב בסיסי/DNase בינונית (הנפח הכולל הסופי 400 μL) והשעיה מחדש.</li>
	<li>לקחת 4 μL ליטר של תאים, לדלל כראוי והר על המוגלובין.</li>
	<li>תחת מיקרוסקופ שדה בהיר, בדוק את יעילות הדיסוציאציה וספור את מספר התאים. הערה: אם הדיסוציאציה היא מוצלחת, בהיר (בחיים) תאים בודדים ולא אגרגטים תאים יהיה נצפתה.</li>
	<li>תא צנטריפוגה השעיה משלב 3.8, ב 1,000 rpm, ב RT, עבור 5 דקות, ולאחר מכן, להסיר את supernatant מן הצינור ולהוסיף את המדיום L15/DNase המתאים (בדרך כלל 5-7 μL) כך הריכוז הסופי של תאים יהיה 8 x 105-1.2 x 106 תאים/μL. הערה: במהלך ההשעיה, חשוב מאוד להימנע בועות אוויר.</li>
	<li>מניחים את התא סדרת מחלקים על הקרח ויש להם עוד L15/dnase בינונית עבור זריקות.</li>
</ol>4. זריקות תוך-גולגולתי
הערה: ההליכים הבאים מתקיימים בחדר הליכים בתוך מתקן בית החיות. מאז התאים ייזריקו ישירות למוח של גורים היילוד מבלי לחשוף את המוח, מצבים אספטי נשמרים על ידי חיטוי מרחב העבודה עם 70% הפתרון אטוח ושימוש במחטים זכוכית אוטוקלבה. הציוד הבא נדרש עבור זריקות תוך גולגולתי: 1) שדה בהיר לנתיחה סטריאו מיקרוסקופ, 2) מיקרו מזרק, ו 3) משטח חימום להתאוששות העכבר.
<ol><li>הכינו מחט זכוכית על ידי משיכת מחטים בהתאם להמלצות של היצרן. מחטי זכוכית עם קוטר החיצוני 80 יקרומטר, 40 יקרומטר קוטר פנימי, ו-30 ° משופע משמשות בפרוטוקול זה. הערה: כפי שהוזכר לעיל, יש להשתמש במחטים לפני השימוש.</li>
	<li>Backfill באופן ידני את המחט עם שמן אדיש ביולוגית באמצעות 30 G, 2 המחט אינטש מזרק.</li>
	<li>להרכיב ולהכניס את המחט ליחידת מזרק על פי הוראות היצרן.</li>
	<li>קבע את הגדרות ההזרקה באמצעי האחסון המרבי (69 nL) וקצב איטי יחסי (23 nL/s).</li>
	<li>רוקן את המחט עד שהבוכנה מורחבת לגמרי.</li>
	<li>
. תמלא את המחט
	<ol>
<li>חותכים חתיכה קטנה מקלטת השתלה ומניחים אותו תחת לחיתוך שדה בהיר-מיקרוסקופ סטריאו. עם P10 מיקרופיפטה, להעביר 5 μL מן המדגם (תא aliquot) אל הקלטת, כך ירידה כדורית נוצרת.</li>
		<li>מניחים את קצה המחט לתוך המדגם וממלאים את המחט (הבוכנה מופרע הזה בו ומציירת את המדגם עם זה). הערה: מאז המדגם צריך להיות צמיגי למדי, למלא את המחט בשלבים קטנים כך את המדגם יהיה שיווי משקל, ובקצב איטי המונע בועות מיצירת. המדגם צריך להיות חלק והומוגנית בתוך המחט. אם המדגם הוא צמיגי מדי ולא ניתן למלא את המחט, להוסיף L15/DNase בינונית כפי שהוא נדרש כדי לקבל את צמיגות הנכון. אף על פי כן, זה ישנה את ריכוז המדגם, ובאופן אידיאלי יש להימנע.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הרדים גורים חדשים שנולדו (יום לפני הלידה 0-2 [P0-P2]) על קרח עבור 2-5 דקות. הערה: . תוודא שכלבלב לא זז</li>
	<li>מניחים את הגור רדימים תחת השדה בהיר לנתיחה סטריאו מיקרוסקופ.</li>
	<li>לבצע 3-4 זריקות של 69 nL כל אחד בחצי הכדור. הערה: אתרי ההזרקה ממוקמים כ 1 מ"מ לרוחב לקו האמצע, ו בין 1 מ"מ caudal לברגמה ו 1 מ"מ rostral לקו הפנימי. קצה המחט צריך להיות ממוקם בערך 1 מ"מ עמוק משטח pial. לאחר כל הזרקה, המחט נשאר במקום בערך 30 s ונסוג בתקופות.</li>
	<li>מיד לאחר הזריקות, מניחים את הגור על משטח חימום עם חימום בסביבה הנמוכה ביותר (37 ° c). כאשר הגור מתאושש להעביר אותו לכלוב עם אמו. הערה: לעולם אל תעזוב את האמא. בלי כלבלבים בכלוב ההליך כולו (מהסרת הגור מן החברים האחרים שלו, עד שהוא מוחזר) צריך להימשך פחות מ 10 דקות.</li>
</ol>5. clozapine-N-תחמוצת הזריקות
<ol><li>הכן את ליגד ligand, CNO פתרון מניות על ידי דילול 1 מ"ג של CNO ב 50 μL של diמתיל סולפוקסיד (DMSO) עד הפתרון הוא שקוף. Top-עד 10 mL עם מלוחים כך הריכוז הסופי של CNO הוא 0.1 mg/mL. הערה: . DMSO רעיל הימנע משימוש בו לריכוז גבוה יותר מ 0.1%. השתמש כפקד פתרון מלוחים המכיל את אותו ריכוז DMSO כמו הפתרון המכיל CNO.</li>
	<li>מיום הלידה 14 ו 3 ימים באופן מחודש (P14-P16), בכל עכבר לבצע שני הפנימי (כגון) זריקות של CNO (ריכוז CNO: 1 מ"ג/ק"ג) או 0.05% DMSO ב תמיסת מלח, ליום, 12 h בנפרד.</li>
	<li>ביום האחרון (P17), לבצע הזרקה בודדת ולהקריב עכברים על ידי פריקה צוואר הרחם בתוך חלון זמן של 30 דקות-1 h.</li>
</ol>

<ol><li>Marin, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interneuron+dysfunction+in+psychiatric+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Interneuron dysfunction in psychiatric disorders.</a> Nature Review Neuroscience. 13 (2), 107-120 (2012).</li>
<li>Glausier, J. R., Lewis, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABA+and+schizophrenia%3A+Where+we+stand+and+where+we+need+to+go%5BTitle%5D)+AND+%22Schizophrenia+Research%22%5BJournal%5D)">GABA and schizophrenia: Where we stand and where we need to go.</a> Schizophrenia Research. 181, 2-3 (2017).</li>
<li>Fishell, G., Rudy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+inhibition+within+the+telencephalon%3A+%22where+the+wild+things+are%22%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of inhibition within the telencephalon: "where the wild things are".</a> Annual Review Neuroscience. 34, 535-567 (2011).</li>
<li>Wamsley, B., Fishell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+activity-dependent+mechanisms+underlying+interneuron+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Genetic and activity-dependent mechanisms underlying interneuron diversity.</a> Nature Review Neuroscience. 18 (5), 299-309 (2017).</li>
<li>Xu, Q., Cobos, I., De La Cruz, E., Rubenstein, J. L., Anderson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origins+of+cortical+interneuron+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Origins of cortical interneuron subtypes.</a> Journal of Neuroscience. 24 (11), 2612-2622 (2004).</li>
<li>Denaxa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maturation-promoting+activity+of+SATB1+in+MGE-derived+cortical+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Maturation-promoting activity of SATB1 in MGE-derived cortical interneurons.</a> Cell Reports. 2 (5), 1351-1362 (2012).</li>
<li>Wichterle, H., Garcia-Verdugo, J. M., Herrera, D. G., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Young+neurons+from+medial+ganglionic+eminence+disperse+in+adult+and+embryonic+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Young neurons from medial ganglionic eminence disperse in adult and embryonic brain.</a> Nature Neuroscience. 2 (5), 461-466 (1999).</li>
<li>Alvarez-Dolado, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+inhibition+modified+by+embryonic+neural+precursors+grafted+into+the+postnatal+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Cortical inhibition modified by embryonic neural precursors grafted into the postnatal brain.</a> Journal of Neuroscience. 26 (28), 7380-7389 (2006).</li>
<li>Baraban, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduction+of+seizures+by+transplantation+of+cortical+GABAergic+interneuron+precursors+into+Kv1.1+mutant+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proccedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Reduction of seizures by transplantation of cortical GABAergic interneuron precursors into Kv1.1 mutant mice.</a> Proccedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (36), 15472-15477 (2009).</li>
<li>Southwell, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interneurons+from+embryonic+development+to+cell-based+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Interneurons from embryonic development to cell-based therapy.</a> Science. 344 (6180), 1240622(2014).</li>
<li>Vogt, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral-mediated+Labeling+and+Transplantation+of+Medial+Ganglionic+Eminence+%28MGE%29+Cells+for+In+Vivo+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Viral-mediated Labeling and Transplantation of Medial Ganglionic Eminence (MGE) Cells for In Vivo Studies.</a> Journal of Visualized Experiments. (98), e52740(2015).</li>
<li>De Marco Garcia, N. V., Karayannis, T., Fishell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+activity+is+required+for+the+development+of+specific+cortical+interneuron+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neuronal activity is required for the development of specific cortical interneuron subtypes.</a> Nature. 472 (7343), 351-355 (2011).</li>
<li>Urban, D. J., Roth, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DREADDs+%28designer+receptors+exclusively+activated+by+designer+drugs%29%3A+chemogenetic+tools+with+therapeutic+utility%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Pharmacology+and+Toxicology%22%5BJournal%5D)">DREADDs (designer receptors exclusively activated by designer drugs): chemogenetic tools with therapeutic utility.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 55, 399-417 (2015).</li>
<li>Denaxa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+Apoptosis+Controls+Inhibitory+Interneuron+Number+in+the+Cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Modulation of Apoptosis Controls Inhibitory Interneuron Number in the Cortex.</a> Cell Reports. 22 (7), 1710-1721 (2018).</li>
<li>Quatrocolo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homochronic+Transplatation+of+Interneuron+Precursors+into+Early+Postnatal+Mouse+Brains%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Homochronic Transplatation of Interneuron Precursors into Early Postnatal Mouse Brains.</a> Journal of Visualized Experiments. (136), e57723(2018).</li>
<li>Southwell, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsically+determined+cell+death+of+developning+cortical+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Intrinsically determined cell death of developning cortical interneurons.</a> Nature. 491 (7422), 103-113 (2012).</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

כאן אנו מתארים מתודולוגיה נגישה נרחב כדי לשנות גנטית את הפעילות של הקדם-סמנים CI ללמוד את ההשפעה של פעילות פנימית על התבגרות CI, ו/או את ההשפעה של הפעילות מודנן על ההרכבה/פונקציה של קליפת הבית המשולבת עגלים.
בעבר, מספר מעבדות, כולל שלנו, ביצעו ניסויים אלקטרופורציה ברחם כדי לשנות גנטית הקרנה נוירונים6. עם זאת, בתוך הרחם באמצעות אלקטרולייוני הושלתי הכוללים CI מאוד קשה, בשל בעיות ההולכה החשמלית הנתיב. כדי לפתור בעיה זו, מספר קטן של מעבדות מבצעים הזרקת אולטרסאונד זריקות מונחה ואחריו אלקטרופורציה, שהיא טכניקה תובענית הדורשת ציוד יקר. פרוטוקול זה מספק חלופה למתודולוגיות אלה, הנגישה לרוב הקהילה המדעית.
אחד ההיבט המאתגר ביותר של פרוטוקול זה הוא למקסם את מספר התאים השורדים בקליפת המארח לשלבים בוגרים, כאשר ניתוח פנוטימית מבוצע בדרך כלל (תלוי מאוד בעיצוב הניסוי, אך בדרך כלל מבוגר מ P17). ישנם שלושה צעדי מפתח שהחוקר צריך לשים לב אליהם: (1) יעילות האלקטרופורציה. זה יכול להיות מוגדל על ידי הבטחת טוהר של הפלמידים DNA. יש להשתמש רק באיכות גבוהה של ה-DNA (A A260/a280 יחס של 1.9-2.0) עבור הליך זה. אנו משיגים כזה באיכות גבוהה DNA ההכנות על ידי שימוש בטיהור ה-DNA צסיום כלוריד. גורם מכריע נוסף הוא היזם המניע את הביטוי של גן העניין. מצאנו כי וקטור pcaggs, אשר מורכב מיזם העוף b-actin, הוא חזק מאוד יכול להגדיל באופן דרמטי את יעילות אלקטרופורציה. (2) מספר עוברי התורם המתחילים. חשוב לוודא כי מספר גדול (12-16) של עוברים באותו שלב הם אלקטרופורמות. מספר זה יכול להיות מוגבר, אם ניסויים נוספים מבצעים ניתוח העובר והעברתם יחד, כמו שחשוב כי הפרוסות הקורטיקלית העובריים מתקבלים, אלקטרופורמות והועברו לחממה בהקדם האפשרי. (3) חשוב לוודא כי מספר גדול של תאים מוזרק כל גור כדי להבטיח סיכוי גבוה של הישרדות התא המושתלים עד שלבים בוגרים. בנוסף, זה יהיה באופן דרמטי לשפר את הסבירות של השתלות מוצלח מאז צפיפות נמוכה ההכנות התאים תגרום ערבוב אחיד של התאים עם המדיום, אשר יפיק שינויים משמעותיים במוח מושתלים15 .
הפרוטוקול המתואר כאן הותאם לחקירת תפקידה של הפעילות בוויסות הישרדות CI באופן אוטונומי התא. חלון הזמן P14-P17 לביצוע זריקות CNO נבחר במיוחד על פי נתונים שפורסמו, אשר מראים כי השיא של מוות מושתל ושלתי ' התאים מתרחש בתקופה זו16. לכן, מסגרת הזמן או התדירות של זריקות CNO עשויה שלא להיות נכונה עבור סוגי תאים אחרים או אזורי מוח אחרים, והחוקר צריך להתאים את הפרמטרים הללו לפי המטרות הנסיוניות הספציפיות. בסופו של דבר, המתודולוגיה המתוארת כאן עבור זריקות בתוך הגולגולתית של CIs הוא אפשרי רק עבור P0-P5 גורים (תלוי גם על הרקע קו העכבר). בעיקרון, כל הזריקות מעל P5 ידרוש דילול או הסרת הגולגולת15.
אחד היתרונות המרכזיים של פרוטוקול זה הוא היכולת להשתמש בכלים חדשים מקודדים גנטית כדי להמחיש או לטפל בפעילות של חבר העמים במהלך שלבים שונים של בידול כפי שהם להשתלב ברשת מתפתחת. עם קצב של גילוי של מתח חדש מקודד גנטית וחיישנים סידן, כמו גם כימוכלים חדשים ואלקטרואופטיקה, פרוטוקול זה מאפשר לחוקרים להשתמש בהם בתוך שבועות של שחרור לתוך מאגרים פלביניים, כגון Addgene.

הפונקציה של הרשתות העצבי מסתמך על קיומה של השלמה מאוזנת של נוירונים הקרנה מרגש ומעכבות אינטרנוירונים. למרות האינטרנוירונים הקורטיקליים (CIs) רק מייצגים 20% של כל הנוירונים במרכיבי היונקים, החסרונות במספר או בפונקציה שלהם נחשבים לנגן חלק מפתח בפתוגנזה של הפרעות נוירולוגיה1,2. המחקר של התפתחות CI הוא מאתגר כי חבר העמים מופקים מבנים עובריים ארעי כי הם קשים גישה, והם עוקבים אחר הגירה ממושכת לפני שהם מגיעים לפליום ולפתח אנטומית ופיסיולוגיים בוגרים שלהם נכסים3. שני מנגנונים גנטיים וסביבתיים ידועים כי להסדיר את הפיתוח של CI4, אבל זה הוכיח קשה ללמוד את התרומה היחסית של גורמים מרובים.
תובנות רבות בפיתוח CI הושגו באמצעות מערכות תרבות מבחנה לאחר בידוד של ושלתי מ-ganglionic מוקדי5,6. אחד היתרונות הגדולים של שיטות אלה הוא הפוטנציאל תווית ולשנות גנטית ושלתי מבודדים ולעקוב אחר הבידול שלהם בפירוט, כדי לזהות שינויים האוטונומית התא. עם זאת, שיטות אלה אינן מאפשרות להציע מידע בנוגע לאינטראקציות בין פיתוח אינטרנוירונים ורשת פעילה. התאמתי את הפרוטוקולים האלה, על ידי השתלת הסמנים האחרונים שהשתנו לתוך קליפת לאחר לידה מוקדמת. בושלתי הבינתא מבודדים מהפרואודים עובריים מסוגלים לשרוד, להתפזר ולהשתלב ברשת המארחת עם השתלת לתוך קליפת המוח7,8. שיטה זו שימש כדי להפחית את חומרת התקפים אפילפטי במודלים של העכבר הגנטי, והוצע כטיפול חדש אפשרי עבור הפרעות נוירותפתחותיות שונות9,10. פרוטוקול קודם מתאר הליך המתאר את הסמנים הבאים עם וקטורים ויראליים לפני הזריעה11. הפרוטוקול שאנו מתארים כאן מאפשר גם את השינוי הגנטי של האינטרנוירונים, אך אינו דורש יצירת וקטור ויראלי, המחייב רק DNA פלמיד, אשר מגביר מאוד את הגמישות שלה. מחקרים מסוימים דיווחו על הצלחה בשימוש באלקטרופורציה הרחם כדי לשנות גנטית ושלתי הבין בתוך גנגלייוני ganglionic (CGE)12, אבל שיטה זו הוכיחה קשה מאוד להתרבות.
בסעיף תוצאות נציג, אנו ממחישים את השימוש בשיטה זו כדי לבטא קולטני מעצבים המופעל באופן בלעדי על ידי תרופות מעצבים (הראסטות13) ב-CIs המושתלים, שיטה בה השתמשנו בפרסום האחרון14. אנו הביע hM3D (הקיו), קולטן מהונדסים המבוססת על CHRM3 cholinergic האדם הקולטן, אשר אינו משפיע על הפונקציה העצבית אלא אם כן הוא מאגד ליגנד clozapine-N-תחמוצת המסוים שלו (cno). ניהול CNO באופן סלקטיבי מפעיל הפעלה של hM3D (קיו) המבטא תאים. השתמשנו בשיטה זו כדי להראות כי התא האוטונומי ואת depolarization ארעית מספיק כדי למנוע אפופטוזיס של CIs במהלך פיתוח14. בשילוב עם כלים שונים מקודד גנטית, פרוטוקול זה יש פוטנציאל למעלה או למטה-להסדיר את הביטוי הגנטי, ולהמחיש או לתמרן פעילות התא בשלבים שונים של הבחנה בין תאי העצב.

<table><tbody><tr><td><חזק>בינוני/תוספי מזון</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>B-27</td><td>GIBCO (ThermoFisher Scientific)</td><td>175040-044</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12&nbsp;</td><td>GIBCO (ThermoFisher Scientific)</td><td>21331-020</td><td></td></tr><tr><td>DNAse</td><td>SIGMA</td><td>DN15-100MG</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>GIBCO (ThermoFisher Scientific)</td><td>10270-098</td><td></td></tr><tr><td>100x גלוטמין</td><td>GIBCO (ThermoFisher Scientific)</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>L15</td><td>GIBCO (ThermoFisher Scientific)</td><td>11415-049</td><td></td></tr><tr><td>MEM אלפא, GlutaMAX</td><td>GIBCO ( ThermoFisher Scientific)</td><td>32561-029</td><td></td></tr><tr><td>מדיום נוירו-בזאלי</td><td>GIBCO (ThermoFisher Scientific)</td><td>21103-049</td><td>נוירון בסיסי</td></tr><tr><td>בינוני 100x P/S</td><td>GIBCO (ThermoFisher Scientific)</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td><חזק>ציוד</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>אלקטרופורטור</td><td>BTX</td><td>ECM 830 מזרק גנרטור</td><td></td></tr><tr><td>לאקוטי אלקטרופורציה של פרוסות&nbsp;</td>מזרק <td>מיקרו-מזרק</td><td></td> <td>Eppendorf</td> FemtoJet</tr><tr><td>להשתלת תאים (I)</td> מזרק <td>מערכת מזרק Vevo</td> <td>Visual Sonics</td> להשתלת <td></td></tr><tr><td>תאים (II)</td><td></td> מעמד מגנטי <td>WPI</td> NANOLITER2010 <td></td></tr><tr><td>מעמד מגנטי</td><td>WPI</td><td>M10L</td> עפיפון מעמד <td></td></tr><tr><td>מגנטי ידני מיקרומניפולטור</td><td>WPI</td><td>KITE-M3-R</td><td></td></tr><tr><td>פלטינה Elecrode (ט)</td><td>פרוטק אינטרנשיונל בע"מ</td><td>CUY-700-1</td><td></td></tr><tr><td>Platinum Elecrode (II)</td> <td>Protech International Inc.</td><td>CUY-700-2</td><td></td></tr><tr><td>לוחית בסיס פלדה</td><td>WPI</td><td>5479</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>VT1200S</td><td></td></tr> <tr><td>חומר <חזק>חומר אחר</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>נימי זכוכית לאלקטרופורציה</td><td>VWR</td><td>1B100-4</td><td></td></tr><tr><td>נימי זכוכית להשתלת תאים</td><td>Visual Sonics</td><td>מסופקים על ידי&nbsp; Visual Sonics</td><td></td></tr><tr><td>Nuclepore 8 ומיקרו; m whatman membrane</td><td>SLS</td><td>110414</td><td></td></tr><tr><td>מנות תרבית רקמות איברים</td><td>BD Biosciences (Falcon)</td><td>353037</td><td></td></tr></tbody></table>

השתלת כימוגנטית מהונדס בקליפת המוח ושלתי לתוך המוחות המוקדמים של העכבר לנטאל

Transplantation of Chemogenetically Engineered Cortical Interneuron Progenitors into Early Postnatal Mouse Brains

פיתוח עצבי מוסדר על ידי שילוב מורכב של גורמים סביבתיים וגנטיים. הערכת התרומה היחסית של כל אחד מהרכיבים היא משימה מסובכת, שקשה במיוחד לגבי התפתחות החומצה הγ-בוטירית הקורטיבית (חבר העמים). CIs הם הנוירונים המעמילים העיקריים בקליפת המוח, והם משחקים תפקידי מפתח ברשתות נוירואליות, על ידי ויסות הן הפעילות של נוירונים בודדים בעלי מידות, כמו גם התנהגות מנדנוד של הרכבים עצביים. הם מופקים במבנים עובריים ארעי (המדיטציה וקאדלי-MGE ו-CGE) כי הם קשים מאוד ליעד ביעילות באמצעות הרחם בגישות. הושלתי להעביר מרחקים ארוכים במהלך התפתחות מעובריים נורמלית, לפני שהם משתלבים במעגל הקורטיקלית. היכולת המדהימה הזאת להתפזר ולהשתלב ברשת המתפתחת יכולה להיות נחטפה על-ידי שתילת מקדם-נוירונים עובריים מתחת לפני לידה מוקדם לאחר הלידה. כאן, אנו מציגים פרוטוקול המאפשר שינוי גנטי של ושלתי הבינניותא עובריים באמצעות מוקד לשעבר vivo electroporation. מקדם הנדסה אלה מראש מהונדסים לאחר מכן מושתלים לאחר לידה מחשב מארח לאחר לידה, שם הם בוגרים לזיהוי CIs בקלות. פרוטוקול זה מאפשר את השימוש של מספר כלים מקודדים גנטית, או את היכולת לווסת את הביטוי של גנים ספציפיים בושלתי הבינתא, כדי לחקור את ההשפעה של משתנים גנטיים או סביבתיים על ההבשלה ו אינטגרציה של CIs.

באמצעות ההליך המוצג כאן, בדקנו אם ההישרדות של האינטרנוירונים בקליפת הסביבה במהלך השלבים המוקדמים לאחר הלידה מוסדר על ידי פעילות באופן אוטונומי התא. בוצעו 3 המוח הניסוי אלקטרופורציה ניסויים (12-16 עוברים [e 14.5 עוברים] לניסוי) עם pcaggs-ires-gfp (בקרה) ו pcaggs-hM3D (ג'י אי)-ires-rfp ביטוי וקטורים, בריכוז של 1 μg/μl עבור כל מבנה. בניסויי האלקטרופורציה שלנו, רק חלקיק (כ-50%; איור 3) של GFP+ נוירונים שיתוף מבוטא hM3D (הקיו) (rfp+) ולכן gfp+rfp- האוכלוסייה שימש שליטה פנימית להשפעה של הדרד ליגנדס. האינטרנוירונים מתחלקים בקליפת המוח היו הושעה מכנית וכתוצאה מכך השעיה התא (8 x 105 תאים/μl) הושתל בקליפת P0-P1 פראי עכברים סוג. . ביצעו 6 זריקות לכל מוח בכל ניסוי, הזריקו לפחות 6 גורים. חדשים שנולדו המינהל של CNO סלקטיבי הגביר את הפעילות של RFP מזוהמים+ תאים, כפי שמתואר על ידי ביטוי של חלבון תלוי הפעילות cno (איור 4). טיפול CNO בהתאם לפרוטוקול המתואר (ניהול פעמיים ביום P14-P17) הביא עלייה בפרופורציה של GFP+rfp+ ביחס gfp+rfp- תאים, בהשוואה לרכב (0.5% dmso ב מלוחים) (איור 5).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59568/59568fig1.jpg"> איור 1: telencephalic הנציגים המשמשים לניסויים באלקטרופורציה חריפה. (א-ג) Telencephalic פרוסות שהתקבלו בשלוש רמות רציפות סדרתית של הרוסטרו-caudal, ויטראז ' 4 ′, 6-diamidino-2-פניינילידול (DAPI). LGE: כבודך הגנגליתית לרוחב; מ. ג. כהוד מעלתך; . כבוד האלים קנה מידה של סרגלים = 200 μm. הכוכביות הצהובות מציינות את אתר האלקטרופורציה בכל פרוסה. הקו הלבן מסמן את הקצה. של כבודך הגנגלייוני <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59568/59568fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59568/59568fig2.jpg"> איור 2: ייצוג סכמטי של זרימת העבודה הניסיונית. (א) פרוסות מוח של העכבר הן electroporated עם המבנים המתאימים, ו (ב) לאחר 12 h שונה האינטרקותא (CI) מבודדים ו (ג) המושתלים ב הפליום של גורי העכבר היילוד (P0-P2). על מנת לשנות את הפעילות של CIs בלתי-מפותחים, כלבלבים P14 שקיבלו שתילת תאים הזריקו להם CNO או רכב במשך ארבעה ימים בהתאם לפרוטוקול המוצג. (א) תצלום של המוח האקוטי של מערכת החשמל הגדר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59568/59568fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59568/59568fig3.jpg"> איור 3: נציג ניסוי אלקטרופורציה חדה מוצלחת של פרוסה. (A) הנציג בחלק השני של המוח העובר של י. י. ו. ב. מעורב ב-cge עם שניהם pCAGGs-IRES-GFP (gfp) ו Pcaggs-HM3D (מג)-IRES-RFP (rfp) פלמידים ומתורבתים עבור 12 h. הסעיף כבר מוכתם ב-GFP (A, B, C) ו-RFP (A, B, D). האזור הארוז בלוח A מוגדל כדי להציג את הביטוי של שני כתבים פלורסנט (ב), gfp (C) ו rfp בלבד (D). הקו הלבן מסמן את הקצה. של כבודך הגנגלייוני B-D: תמונה זהה, ערוצים שונים או שילוב של שני ערוצים שונים. סרגל ברים = 200 יקרומטר (A), 100 יקרומטר (B-D). דמות זו שונתה מ-Denaxa ואח '14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59568/59568fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59568/59568fig4.jpg"> איור 4: הגידול האוטונומי של התא בפעילות של M3D (ג'י קיו)-הבעת הושתלים CIs על הממשל CNO. (A-D) הנציג מיקוד תמונות של קטע ילתית של עכבר P17 המושתלים ב P1 עם העברה מראש של CI עם שניהם pcaggs-ires-gfp (gfp) ו pcaggs-hM3D (ג ' קיו)-ires-rfp (rfp) פלמידים ו מטופלים עם cno. המקטע מוכתם בחיסוני של GFP (A), Rfp (B) ו-cfos (C). (ד) התמונה המשולבת של A, B ו-C האימונולואוורנציה (משולבת). שים לב כי רק CIs שיתוף ביטוי הן פלסטלינה (החצים לבנים ב-A-D) הם גם cFos+ לעומת חבר העמים ביטוי רק בקרת-gfp פלמיד (חיצים צהובים ב-A-D). (ה) קוונפיקציה של cfos+rfp+ תאים שנמצאו ב-P17 של עכברים המושתלים ב P1 (מנורמל ל-rfp בסך הכל האוכלוסייה) ומטופלים עם רכב או cfos (N = 2). A-D: תמונה זהה, ערוצים שונים, או שילוב של שלושה ערוצים שונים. קנה מידה ברים = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59568/59568fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59568/59568fig5.jpg"> איור 5: הגידול האוטונומי של התא בפעילות של CIs מגביר את ההישרדות . (A-D) הנציגה המייצגת את התמונות של קליפת המוח הסוP17 פרוסות של עכברים המושתלים ב-P0-P2 עם מכוניות מקדימות בשני pCAGGs-IRES-GFP (GFP) ו pCAGGs-hM3D (ג'י אי)-IRES-RFP (RFP) ומטופלים עם רכב (א-ב) או cno (C-D). (ה) קוונפיקציה של rfp+ תאים שנמצאו במוח הקדמי של P17 עכברים המושתלים ב P0-P2 (מנורמל כל האוכלוסייה gfp+ ). RFP+(רכב) = 47% ± 3%, cno = 61% ± 3%, p = 0.01, בדיקת מדגם t של הסטודנט, n = 3 רכב ו-3 cno, מינימום של 150 תאים שנספרו לכל מוח. A ו-B: תמונה זהה, ערוצים שונים. C ו-D: תמונה זהה, ערוצים שונים. קנה מידה של סרגלים = 50 μm. דמות זו שונתה מ-Denaxa ואח '14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59568/59568fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/59568/59568table1.jpg"> טבלה 1: מידע נוסף הנוגע למדיה המשמשת בפרוטוקול זה.

כאן אנו מציגים פרוטוקול, שנועד להשתמש כלים גנטיים כדי לתמרן את הפעילות של הושלתי בקליפת המוח הפנימי מושתלים לתוך הקליפה של עכברים לידתיים מוקדם.

Neuronal development is regulated by a complex combination of environmental and genetic factors. Assessing the relative contribution of each component is ...

בשיטה זו, אנו יכולים ללמוד את ההשפעות של פעילות פנימית על התבגרות של מבשרי interneuron קליפת המוח. טכניקה זו מספקת דרך יעילה לפילוח ומניפולציה של המאפיינים התאיים של אבי ההתמחות בקליפת המוח הנגישה לרוב הקהילה המדעית. פרוטוקול זה כרוך בטיפול קפדני של דגימות וציוד, וזה יכול להיות מוערך בצורה הטובה ביותר על ידי הדגמה חזותית.באמצעות עט עמיד למים, לצייר קו ישר על פני החלק התחתון של פני השטח התחתון של שש מנות פטרי 35 מילימטר. הוסיפו 10 מיליליטר של נוזלים 4%low gelling agarose ב-PBS לשתיים מתוך 35 המילימטרים של מנות פטרי והטמיע שלושה עד ארבעה מוחות מנותקים ב-agarose עם נורות הריח הפונות כלפי מטה לכל מנה מעבר לקו הישר, ומשאירות שלושה עד חמישה מילימטרים של רווח בין כל דגימה. כאשר כל המוחות הוטבעו, מניחים את הכלים בארבע מעלות צלזיוס כדי לאפשר לאגרוז לחזק ולגילף את שלושת המוחות לגוש אחד של אגרוז, ומשאירים כשלושה מילימטרים של ג'ל סביב קצות הדגימות.הדבק את הבלוק על פני השטח של בסיס microtome ולהשתמש להב כירורגי לחתוך את כל הדרך דרך החלק התחתון של הבלוק בין כל דגימת רקמה כדי להשיג שלושה בלוקים עצמאיים. לאחר מכן, השתמש במיקרוטום להב רוטט כדי לחתוך את הבלוקים בתסרון קרבס קר כקרח לפרוסות בעובי 250 מיקרומטר, באמצעות מיקרוספטולה שטוחה מכופפת כדי לאסוף רק את הפרוסות המכילות את הגנגליוניים המדיאליים או הכרוביים. לאחר מכן, מניחים כל קטע על קוטר בודד של 13 מיקרומטר, קרום מסנן בגודל שמונה מיקרומטר נקבוביות צף על מדיום חיוני מינימלי במרכז פוליסטירן בודדים גם מנות תרבות איברים.כאשר כל החלקים הושגו, מניחים את הכלים באינקובטור תרבות רקמת פחמן דו חמצני ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת. לפני הזרקת הדנ"א המוקדית, מניחים קוטר של מילימטר אחד, עמודי אגרוז באורך 10 מ"מ עם זכוכית באורך 225 מ"מ, פיפטה זכוכית בקיבולת של שני מיליליטר לתסכולת קרבס קרה כקרח. באמצעות להב כירורגי, לחתוך חתיכה אחת קטנה יותר של אגרוז כדי להתאים על פני השטח של האלקטרודה electroporation וחתיכה אחת גדולה יותר לשמש כבסיס להזרקות DNA המוקד.לאחר מכן, מניחים את גושי ההתעוררות לתוך פתרון קרבס קר כקרח. להזרקה, מערבבים את הביטוי ושולטים בדנ"א וקטורי בריכוז של מיקרוגרם אחד לכל מיקרוליטר עבור כל וקטור ומוסיפים תב"א מלאי ירוק מהיר בדילול של 1 עד 10. מלאו קוטר פנימי של 0.5 מילימטר, מיקרופיגט זכוכית בקוטר חיצוני של מיליליטר עם 10 מיקרוליטרים של תערובת הדנ"א וטען את המיקרופיט למזרק פיקו-פמפ פנאומטי.מניחים את הבלוק הגדול יותר של אגרוז תחת מיקרוסקופ סטריאו ומ מניחים את הפרוסה להיות מוזרק על פיסת אגרוז. לאחר מכן, להזריק 25 כדי 50 ננוליטר כרכים לתוך נבחר גנגליוני המדיאלי או אזור גנגליוני כרובית של הפרוסה. מיד לאחר ההזרקה, מניחים את בלוק אגרוז קטן על אלקטרודה צלחת פטרי ולהשתמש microspatula שהסתיים שטוחים כדי לחבר את עמוד אגרוז אלקטרודה כיסוי נייד.מעבירים את הפרוסה המוזרקת עם הממברנה התומכת שלה אל גוש ההתעוררות ומציבים את האלקטרודה העליונה עם עמוד ההתעוררות על גבי האזור הנבחר של הפרוסה. לאחר מכן, אלקטרופוליזציה האזור עם שני פולסים של חמש אלפיות השניה של 125 וולט, 500 אלפיות השניה זה מזה. לאחר האלקטרופוריה, מניחים את הפרוסה עם הממברנה התומכת שלה בחזרה לתוך צלחת החזקה שלה ולהחזיר את המנה לאנקובטור תרבות הרקמה.לאחר שעה אחת, החלף את המדיום החיוני המינימלי במדיום בסיסי המתאים לתרבויות עצביות ראשוניות והחזר את הפרוסות לחממה בן לילה. בניסויי אלקטרופורציה אלה, כ -50% מהנוירונים החיוביים של GFP הביעו במשותף את החלבון שהוזרק חיובי ל- RFP ולכן, האוכלוסייה השלילית החיובית של GFP RFP שימשה כבקרה פנימית להשפעת ליגנדים DNA מוזרק. ניהול Clozapine ותחמוצת מגביר באופן סלקטיבי את הפעילות של תאים חיוביים RFP מנודים, כפי שהוכח על ידי הביטוי של חלבון תלוי פעילות, c-Fos, אלה רקמת קורונול שזה עתה נולדו.טיפול Clozapine ותחמוצת גם תוצאות עלייה בשיעור של תאים חיוביים GFP RFP חיובי RFP ביחס למספר תאים חיוביים GFP RFP שלילי בהשוואה לפסולת מנוהל רכב. הליך זה יכול לשמש כדי ללמוד את ההשפעות של פעילות-לווסת interneurons מושתל על פלסטיות במחזור הדם ותפקוד המוח של המארח.

transplantation-chemogenetically-engineered-cortical-interneuron

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

מקור: Weber, R. Z., et al. השתלה תוך מוחית ומעקב ביולומינסנציה in vivo של תאי אב עצביים אנושיים במוח העכבר. J. Vis. Exp. (2022)סרטון זה מדגים את ההשתלה הסטריאוטקסית של תאי אב עצביים אנושיים מהונדסים גנטית (NPCs) לתוך מוח העכבר. חוקרים מזריקים NPCs המבטאים לוציפראז וחלבונים פלואורסצנטיים, המאפשרים הדמיה ביולומינסנציה in vivo ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית לאחר המוות כדי לחקור את הישרדות התאים, נדידה ואינטגרציה במחקר נוירולוגי.

השתלת תאי אב עצביים אנושיים במוח העכבר

מקור: Quattrocolo, G., et al. השתלה הומוכרונית של מבשרי אינטרנוירונים במוח עכברים מוקדמים לאחר הלידה. J. Vis. Exp. (2018)סרטון זה מדגים את ההשתלה של תאים מבשרים בין-נוירוניים למוח העכבר היילוד באמצעות גישה הומוטופית או הטרוטופית. ההליך כולל אבטחת גור מושתל מורדם, זיהוי אזור מוח היעד והזרקת תרחיף של תאים קודמים שמקורם בגור תורם באותו שלב התפתחותי. לאחר ההזרקה, הגור מועבר לכרית חימום להתאוששות, מה שמאפשר הערכה לאחר מכן של הישרדות התא התורם והתבגרותו.

השתלת תאי מבשר בין-נוירוניים למוח של גור עכבר

מקור: Gonzalez-Ramos, A., et. al., השתלת נוירונים GABAergic שמקורם בתאי גזע אנושיים בהיפוקמפוס העכבר המוקדם לאחר הלידה כדי להפחית הפרעות נוירו-התפתחותיות. J. Vis. Exp. (2022)סרטון זה מדגים את ההזרקה הסטריאוטקסית של תאי מבשר אינטרנוירונים שמקורם באדם לתוך ההיפוקמפוס של גור עכבר מהונדס גנטית עם אינטרנוירונים מעכבים מופחתים, במטרה להחזיר את האיזון המעורר-מעכב.

השתלת תאי מבשר בין-עצביים שמקורם באדם בהיפוקמפוס גור העכבר

מקור: Denaxa, M., el al., השתלת אבות של אינטרנוירונים קליפתיים מהונדסים כימוגנטית לתוך מוחות עכברים מוקדמים לאחר הלידה. J. Vis. Exp. (2019)סרטון זה מדגים את ההליך להזרקת וקטור פלסמיד הנושא את הגן המעניין לאבות בין-נוירוניים בפרוסת מוח עוברית, ואחריו אלקטרופורציה לכניסת פלסמיד וביטוי גנים. אבות אבות מותאמים אלה יכולים לשמש מאוחר יותר לטיפול בהפרעות מוחיות.

העברת גנים בסיוע אלקטרופורציה משובצת אגרוז באבות אבות בין-עצביים בקליפת המוח של עכברים

פרוטוקול זה מתאר שיטה ליצירת interneuron קורטיקלית אבות ו מבשרי פוסט-mitotic interneuron של תאי גזע עובריים בעכבר בשיטה שונה embryoid גוף-כדי-טפט. אלה אבות/מבשרי יכולים להיות בשימוש במבחנה או fluorescently מיון מושתלים לתוך קליפת neonatal ללמוד קביעת גורל, או שימוש ביישומים טיפולית.

התמיינות של תאי גזע עובריים בעכבר לתוך Interneuron קורטיקלית מבשרי

מאתגר צעיר הנוירונים באזורים במוח חדש יכול לחשוף תובנות חשובות איך הסביבה מפסל גורל עצביים ועם בגרות. פרוטוקול זה מתאר הליך כדי לקצור מבשרי interneuron מאזורים ספציפיים במוח, השתלת אותם גם homotopically או heterotopically לתוך המוח של הגורים כמחנכת.

השתלת Homochronic של סימנים מקדימים Interneuron לתוך מוח העכבר כמחנכת מוקדם

בהתבסס על הנדסת חוץ גופית ויראלי של מראש עצבי, שיתוף ההשתלה שלהם למוח פראי סוג ולזווג הערכה מורמטרית של "מבחן" ו "שליטה" נגזרים, שיטה זו מאפשרת דוגמנות מדויקת של בקרת vivo gene של הנאוקורטילית עצב מורפולוגיה בדרך פשוטה ובמחיר סביר.

השתלת השתלות מהונדסים של הנדסה עצבית בVivo לימודי נוירוארכיטקטורה

פרוטוקול זה מדגים מתודולוגיות עבור מודל העכבר של פגיעה במוח הגולגולת טראומה טראומטית השתלת הגוף האנושי המושרה pluripotent שפעה התאים הנגזר לתוך האתר פציעה. מבחנים התנהגותיים והיסטולוגיים של תוצאות מהליכים אלה מתוארים גם בקצרה.

מבוקרת מודל השפעה בקליפת המוח של פגיעה במוחו של העכבר עם השתלת הטיפולית של האדם המושרה Pluripotent תא גזע תאים הנגזרים

אנו מתארים את ההשתלה התוך-פרנכימלית של תאי אב עצביים אנושיים שעברו התמרות עם וקטור מדווח כפול המבטא חלבון פלואורסצנטי ירוק-לוציפראז (GFP) במוח העכבר. לאחר ההשתלה, אות הלוציפראז נמדד שוב ושוב באמצעות תאים מושתלים in vivo bioluminescence ותאים מושתלים המבטאים GFP שזוהו בחתכי מוח באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.

השתלה תוך-מוחית ומעקב ביולומינסנציה In Vivo של תאי אב עצביים אנושיים במוח העכבר

השתלה של נוירונים GABAergic שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים שנוצרו על ידי תכנות עצבי יכולה להיות גישה טיפולית פוטנציאלית להפרעות נוירו-התפתחותיות. פרוטוקול זה מתאר את הדור וההשתלה של מבשרים עצביים GABAergic שמקורם בתאי גזע אנושיים במוחם של עכברים ילודים, מה שמאפשר חקירה ארוכת טווח של נוירונים מושתלים והערכת הפוטנציאל הטיפולי שלהם.

השתלת תאי עצב GABAergic שמקורם בתאי גזע אנושיים בהיפוקמפוס העכברים המוקדם לאחר הלידה כדי למתן הפרעות נוירו-התפתחותיות

חקור שיטה לשליטה בפעילות תאי עצב ביניים בקליפת המוח בעכברים ניאונטליים באמצעות כלים כימוגנטיים. הפרוטוקול מאפשר לחקור את השפעת הפעילות הפנימית על הבשלת תאי העצב ותפקוד המוח.

השתלת כימוגנטית מהונדס בקליפת המוח ושלתי לתוך המוחות המוקדמים של העכבר לנטאל

גלה סרטונים נוספים