השתלת כימוגנטית מהונדס בקליפת המוח ושלתי לתוך המוחות המוקדמים של העכבר לנטאל
August 26th, 2019
כאן אנו מציגים פרוטוקול, שנועד להשתמש כלים גנטיים כדי לתמרן את הפעילות של הושלתי בקליפת המוח הפנימי מושתלים לתוך הקליפה של עכברים לידתיים מוקדם.
בשיטה זו, אנו יכולים ללמוד את ההשפעות של פעילות פנימית על התבגרות של מבשרי interneuron קליפת המוח. טכניקה זו מספקת דרך יעילה לפילוח ומניפולציה של המאפיינים התאיים של אבי ההתמחות בקליפת המוח הנגישה לרוב הקהילה המדעית. פרוטוקול זה כרוך בטיפול קפדני של דגימות וציוד, וזה יכול להיות מוערך בצורה הטובה ביותר על ידי הדגמה חזותית.
באמצעות עט עמיד למים, לצייר קו ישר על פני החלק התחתון של פני השטח התחתון של שש מנות פטרי 35 מילימטר. הוסיפו 10 מיליליטר של נוזלים 4%low gelling agarose ב-PBS לשתיים מתוך 35 המילימטרים של מנות פטרי והטמיע שלושה עד ארבעה מוחות מנותקים ב-agarose עם נורות הריח הפונות כלפי מטה לכל מנה מעבר לקו הישר, ומשאירות שלושה עד חמישה מילימטרים של רווח בין כל דגימה. כאשר כל המוחות הוטבעו, מניחים את הכלים בארבע מעלות צלזיוס כדי לאפשר לאגרוז לחזק ולגילף את שלושת המוחות לגוש אחד של אגרוז, ומשאירים כשלושה מילימטרים של ג'ל סביב קצות הדגימות.
הדבק את הבלוק על פני השטח של בסיס microtome ולהשתמש להב כירורגי לחתוך את כל הדרך דרך החלק התחתון של הבלוק בין כל דגימת רקמה כדי להשיג שלושה בלוקים עצמאיים. לאחר מכן, השתמש במיקרוטום להב רוטט כדי לחתוך את הבלוקים בתסרון קרבס קר כקרח לפרוסות בעובי 250 מיקרומטר, באמצעות מיקרוספטולה שטוחה מכופפת כדי לאסוף רק את הפרוסות המכילות את הגנגליוניים המדיאליים או הכרוביים. לאחר מכן, מניחים כל קטע על קוטר בודד של 13 מיקרומטר, קרום מסנן בגודל שמונה מיקרומטר נקבוביות צף על מדיום חיוני מינימלי במרכז פוליסטירן בודדים גם מנות תרבות איברים.
כאשר כל החלקים הושגו, מניחים את הכלים באינקובטור תרבות רקמת פחמן דו חמצני ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת. לפני הזרקת הדנ"א המוקדית, מניחים קוטר של מילימטר אחד, עמודי אגרוז באורך 10 מ"מ עם זכוכית באורך 225 מ"מ, פיפטה זכוכית בקיבולת של שני מיליליטר לתסכולת קרבס קרה כקרח. באמצעות להב כירורגי, לחתוך חתיכה אחת קטנה יותר של אגרוז כדי להתאים על פני השטח של האלקטרודה electroporation וחתיכה אחת גדולה יותר לשמש כבסיס להזרקות DNA המוקד.
לאחר מכן, מניחים את גושי ההתעוררות לתוך פתרון קרבס קר כקרח. להזרקה, מערבבים את הביטוי ושולטים בדנ"א וקטורי בריכוז של מיקרוגרם אחד לכל מיקרוליטר עבור כל וקטור ומוסיפים תב"א מלאי ירוק מהיר בדילול של 1 עד 10. מלאו קוטר פנימי של 0.5 מילימטר, מיקרופיגט זכוכית בקוטר חיצוני של מיליליטר עם 10 מיקרוליטרים של תערובת הדנ"א וטען את המיקרופיט למזרק פיקו-פמפ פנאומטי.
מניחים את הבלוק הגדול יותר של אגרוז תחת מיקרוסקופ סטריאו ומ מניחים את הפרוסה להיות מוזרק על פיסת אגרוז. לאחר מכן, להזריק 25 כדי 50 ננוליטר כרכים לתוך נבחר גנגליוני המדיאלי או אזור גנגליוני כרובית של הפרוסה. מיד לאחר ההזרקה, מניחים את בלוק אגרוז קטן על אלקטרודה צלחת פטרי ולהשתמש microspatula שהסתיים שטוחים כדי לחבר את עמוד אגרוז אלקטרודה כיסוי נייד.
מעבירים את הפרוסה המוזרקת עם הממברנה התומכת שלה אל גוש ההתעוררות ומציבים את האלקטרודה העליונה עם עמוד ההתעוררות על גבי האזור הנבחר של הפרוסה. לאחר מכן, אלקטרופוליזציה האזור עם שני פולסים של חמש אלפיות השניה של 125 וולט, 500 אלפיות השניה זה מזה. לאחר האלקטרופוריה, מניחים את הפרוסה עם הממברנה התומכת שלה בחזרה לתוך צלחת החזקה שלה ולהחזיר את המנה לאנקובטור תרבות הרקמה.
לאחר שעה אחת, החלף את המדיום החיוני המינימלי במדיום בסיסי המתאים לתרבויות עצביות ראשוניות והחזר את הפרוסות לחממה בן לילה. בניסויי אלקטרופורציה אלה, כ -50% מהנוירונים החיוביים של GFP הביעו במשותף את החלבון שהוזרק חיובי ל- RFP ולכן, האוכלוסייה השלילית החיובית של GFP RFP שימשה כבקרה פנימית להשפעת ליגנדים DNA מוזרק. ניהול Clozapine ותחמוצת מגביר באופן סלקטיבי את הפעילות של תאים חיוביים RFP מנודים, כפי שהוכח על ידי הביטוי של חלבון תלוי פעילות, c-Fos, אלה רקמת קורונול שזה עתה נולדו.
טיפול Clozapine ותחמוצת גם תוצאות עלייה בשיעור של תאים חיוביים GFP RFP חיובי RFP ביחס למספר תאים חיוביים GFP RFP שלילי בהשוואה לפסולת מנוהל רכב. הליך זה יכול לשמש כדי ללמוד את ההשפעות של פעילות-לווסת interneurons מושתל על פלסטיות במחזור הדם ותפקוד המוח של המארח.
סקירה
מחקר זה מציג פרוטוקול למניפולציה של פעילות של תאים קודמיים של נוירונים בין-קליפת המוח באמצעות כלים כימוגנטיים בעכברים מוקדם לאחר לידה. השיטה מאפשרת לחוקרים לחקור את ההשפעות של פעילות פנימית על התבגרות של תאים קודמיים אלו, ותורמת להבנה עמוקה יותר של התפקוד של קליפת המוח.
רכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- מדעי המוח
- התפתחות קליפת המוח
- כימוגנטיקה
רקע
- נוירונים בין-קליפת המוח ממלאים תפקידים קריטיים בתפקוד המוח.
- הבנת התבגרותם יכולה להעשיר את המחקר הנוירולוגי.
- כימוגנטיקה מציעה שליטה מדויקת בפעילות נוירונית.
- עכברים לאחר לידה משמשים כמודלים רלוונטיים לחקר התפתחות קליפת המוח.
מטרת המחקר
- למנפולציה של פעילות תאים קודמיים של נוירונים בין-קליפת המוח שהושתלו.
- לבחון את ההשפעות של פעילות פנימית על התבגרות הנוירונים בין.
- לספק פרוטוקול נגיש לחוקרים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- פרוסות מוח ex vivo הוכנו מעכברים מוקדם לאחר לידה לצורך המניפולציות.
- המודל הביולוגי כלל תאים קודמיים של נוירונים בין-קליפת המוח שהושתלו.
- שלבים קריטיים כללו הטמעת רקמות באגרוז והזרקת DNA ממוקדת ואחריה אלקטרופורציה.
- לאחר המניפולציה, פרוסות טופחו ונותחו עבור תגובות פעילות נוירונים.
תוצאות עיקריות
- כ-50% מהנוירונים הפגינו ביטוי משותף של GFP ו-RFP, דבר שמצביע על מניפולציה מוצלחת.
- טיפולים בקלוזאפין ובתחמוצת שיפרו את הפעילות של תאים חיוביים ל-RFP, עם עלייה בביטוי c-Fos.
- שיטה זו מספקת תובנות לגבי האופן שבו נוירונים מושתלים משפיעים על תפקוד המוח המארח.
מסקנות
- מחקר זה מדגים פרוטוקול יעיל למניפולציה של תאים קודמיים של נוירונים בין, ומאפשר חקירה נוספת של תפקידיהם בפלסטיות קליפת המוח.
- הבנת המנגנונים של נוירונים ממודולצים בפעילות יכולה לקדם את הידע במדעי המוח.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Genetic and chemogenetic manipulation of cortical interneuron progenitors enables precise interrogation of neuronal maturation mechanisms, supporting early-stage target validation in neurodevelopmental research. This approach provides predictive confidence for understanding how intrinsic activity and environmental factors influence integration and function of inhibitory circuits. The protocol's ability to dissect gene-environment interactions in a controlled, transplantable system positions it as a valuable tool for de-risking neurobiological targets in preclinical pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables functional interrogation of interneuron maturation and integration in disease-relevant neural circuits.
- Supports mechanistic de-risking by isolating genetic and environmental contributions to neuronal development.
- Facilitates predictive assessment of target modulation effects on inhibitory network assembly.
Screening & Assay Development
- Provides a validated system for quantitative measurement of neuronal activity and gene expression in engineered progenitors.
- Enables reproducible manipulation and tracking of transplanted cell populations using fluorescent reporters.
- Supports assay standardization for evaluating chemogenetic tool efficacy and specificity in neural tissue.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational biomarker strategies by enabling in situ analysis of activity-dependent protein expression (e.g., c-Fos).
- Offers continuity from discovery to preclinical validation by modeling integration of engineered cells in host brain circuits.
- De-risks advancement decisions by providing quantitative readouts of graft function and host response.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol bridges early discovery and preclinical research by enabling genetic manipulation, transplantation, and functional analysis of interneuron progenitors in a single workflow.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on gene-environment interactions in interneuron maturation.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible outputs for evaluating chemogenetic modulation in neural tissue.
- Analytics: Provides molecular and cellular readouts (e.g., co-expression of fluorescent proteins, c-Fos induction) for comparative analysis.
- Translational Research: Models integration and function of engineered cells in vivo, supporting biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for testing diverse genetic constructs and activity modulators in neural progenitors.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation and reduces mechanistic ambiguity in neuronal development.
- Operational Value: Standardizes manipulation and analysis of neural progenitors for scalable, reproducible studies.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by providing robust, quantitative data on engineered cell integration and function.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of neurodevelopmental targets and interventions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in ex vivo electroporation, transplantation, and chemogenetic manipulation of neural tissue.
- Demands access to specialized instrumentation for tissue sectioning, microinjection, and fluorescence imaging.
- Necessitates cross-team standardization of protocols for reproducibility and data comparability.
- Adaptation may be needed for different interneuron subtypes or host models.
- Potential limitations include variability in graft integration and chemogenetic tool specificity.
