Name: בידוד וטיהור של קרום הלב של מורלין (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: למד פרוטוקול מותאם לבידוד וטיהור פריציטים קרדיאליים ממודלים מוריניים. השיטה משתמשת ב-FACS לטיהור תאים ומאפשרת חקר ביולוגיה של פריציטים לבביים ויישומים תרפואיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים רוצים להודות לזרימת Amgen Cy, ליבת הליבה, לעזרתם עם עיצוב לוח fluorophore, פתרון בעיות, מיון תאים.

כל החיות היו שוכנו ונעשה שימוש באגודה להערכת והסמכה של מעבדה טיפול בבעלי חיים הבינלאומי (AAALAC) מתקן מוכר וכל העבודה בעלי חיים נערכה תחת פיקוח וטרינרי המתאים ותחת החיה המוסדית הוועדה טיפול ושימוש (IACUC) אישר את הפרוטוקול של Amgen Inc.
1. הכנת כלים ומדיה לתרבות
<ol><li>אוטוקלב כירורגית 9 ס מ ישר טיפ דק מספריים נקודה 10 ס מ מלקחיים זוויתי משונן.</li>
	<li>הוסף 25 מ ל של 5% סרום של שור עוברי (FBS) ו 5 מ ל של 1% פניצילין סטרפטומיצין (P/S) לתוך 500 mL בקבוק של סידן מגנזיום מלוחים חינם באגירה של הפוספט מדולצ (CMF-DPBS). המקום פתרון באמבט קרח כדי להבטיח שיהיה קר בזמן השימוש. מ50 mL לתוך צינור הבידוד של האדם 50 mL. הוסף 250 יחידות/mL של הפארין תמיסת נתרן לתוך 50 mL aliquot. . זה נקרא הפרניזזד-דPBS</li>
	<li>הוסף 20% FBS (100 mL) ו 1% P/S (5 מ ל) לתוך בקבוק 500 mL של גלוקוז גבוהה בינונית הנשר שונה של דולבקה (DMEM). הדבר נקרא מדיה לתרבות נטולת אנזימים. הורדה 20 מ ל של DMEM זיכרון + 20% FBS + 1% P/S ולהוסיף ב 500 μg/mL של הקולגנאז B. הדבר נקרא פתרון האנזים. שמרו גם על מדיית התרבות ופתרון האנזימים החמים ב-37 ° c בחממה או באמבט מים.</li>
</ol>2. הכנת בעלי חיים ורכש של רקמת לב
<ol><li>Intraperitoneally להזריק עכבר עם 250 יחידות של פתרון הפארין נתרן עם מזרק המחט 31 G. לאחר מכן המתן 10 עד 15 דקות בעוד העכבר נשאר פעיל בכלוב הבית שלה. הערה: נתונים מייצגים במחקר זה הושגו מזכר בן 4 חודשים C57BL/6 עכבר. עם זאת, פרוטוקול זה יכול לשמש על כל עכבר ללא קשר למתח, גיל, מין, משקל, וכו '.</li>
	<li>. שיהיה בסדר בדוק את עומק ההרדמה של העכבר על ידי רפלקס צביטה.</li>
	<li>הציבו את העכבר הורדם במיקום פרקדן והקלטת את המצלמה שלו. פתח בזהירות את חלל החזה וצינורית העורקים היורדים באמצעות מחט פרפר 25 G.</li>
	<li>לעשות ניק בפרוזדור הימני ומבשם הלב עם לפחות 20 מ ל של 250 יחידות/mL heparinized CMF-DPBS ב 2 מ"ל/min עם משאבת משתנה משאבה פריסטלטית. כשהpbs יוצאת מימין. הריאה, הפרזיה הושלמה</li>
	<li>. והניחו אותו לתוך הקרח הקפוא</li>
</ol>3. דיסוציאציה של רקמת הלב
<ol><li>העבירו את הלב לצלחת פטרי בגובה 15 ס מ בגודל 15 ס"מ. חותכים את הלב לחתיכות זעירות (1 מ"מ/פיסת) באמצעות מספריים באביב ומלקחיים נקודה עדינה עם פתרון אנזים מספיק כדי לכסות את החלקים (10 עד 15 מ"ל).</li>
	<li>להעביר את החלקים ואת הפתרון לתוך שפופרת 50 mL, חותם עם פרפין סרט פלסטיק, ו-דגירה ב 37 ° צ' על שייקר מסלולית ב 120 rpm עבור 75 min.</li>
	<li>לאחר העיכול הקולגן עם פתרון האנזים, decant הנוזל באמצעות מסננת תא 100 יקרומטר לתוך צינור חדש 50 mL אבל להשאיר מספיק פתרון כדי לוודא את החלקים לא להתייבש.</li>
	<li>באמצעות מלקחיים נקודה עדין, להוציא את הרקמה מן הצינור ומניחים כמה חתיכות על שקופית מיקרוסקופ. ואז לטחון את הרקמה בין שתי שקופיות מיקרוסקופ כדי לשבור את הרקמה. שטוף את השקופיות עם מדיית תרבות חופשית של אנזימים לתוך צינורית חרוט 50 mL חדשה.</li>
	<li>חזור על השלב 3.4 עד לנתק את כל חלקי הרקמה.</li>
	<li>שלב את הפתרונות משלבים 3.3-3.5 לתוך צינורית אחת. מסננים את ההשעיה שנוצר באמצעות מסננת תא 100 יקרומטר לתוך צינור חדש 50 mL חרוט.</li>
	<li>צנטריפוגה ב 220 x g, 4 ° צ', עבור 5 דקות. להוריד את הפתרון הקודם ובעדינות להשעות מחדש את כדור התאים של האנזים החדש ללא אנזימים בתקשורת.</li>
	<li>ספירת תאים ובדיקת כדאיות באמצעות מונה תאים. לדלל את התאים 1 x 106/mL עם הצביעת facs קר מאגר המכיל 500 ML של dpbs ו 10-25 מ ל של 2-5% בסרום שור (bsa). התאים מוכנים להיות מוכתמים וממוינים.</li>
</ol>4. טיהור כולציטים מתערובת תא גולמי באמצעות FACS
<ol><li>הכן ותייג את הצינורות 5 מ"ל עבור כל הפקדים ודגימות התא. מחלק את התאים (1 מ ל של תאים לצינור) עבור מדגם לא מוכתם, הזריחה מינוס אחד (FMO) בקרות, ו-isotype התואמים פקדים. השתמש בתאים הנותרים עבור המיון. כל הפקדים והדגימות יכולים להיות מוכנים ומוכתמים באותו זמן. הערהסך של 13 מ ל ב 0.5 x 106תאים/mL שימשו עבור הנציג מסוג לב אחד. עם זאת, אמצעי האחסון תלוי במספר התאים שהחוקר מקבל מבידוד שלהם, כמה לבבות הם משתמשים, וכמה טוב רקמת הלב מתעכל; הגודל של כל לב הוא גם משתנה שיכול לשנות את עוצמת הקול.<ol><li>השתמש בחרוזי פיצוי (טבלת חומרים) כדי למטב את שולטת הפיצוי הפלואורסצנטית. הכינו בקרת פיצוי אחד עבור כל fluorochrome בניסוי בשפופרת מתויג 5 mL FACS. עבור ניסוי זה, להכין סך של 9 פקדים פיצוי-2 סוגים של חרוזים בלתי מוכתמים ועוד 7 fluorochromes שונים מהחלונית סמן כולל NG2-FITC, CD31-APC, CD140b-PE, CD146 BV605, CD34-BV421, CD45-PE-Cy7, ואת הכדאיות תא-APC-Cy7 ( טבלת חומרים).<ol>
<li>הוסף טיפה אחת של חרוזי פיצוי (~ 50 μL) מבקבוקון הסחיטה לכל צינור. ואז להוסיף 1 μL של נוגדן לחרוזים. חזרו על כל נוגדן מהחלונית ' סמן '. מערבבים במרץ על ידי הדופק-vortexing. דגירה של 30 דקות ב 4 ° צ' מוגן מפני אור למעט חרוזי הכדאיות התא אשר ניתן להשאיר בטמפרטורת החדר מוגן מפני אור.</li>
			<li>הבא, להוסיף 3 מ ל של FACS הצביעת מאגר לכל צינור וצנטריפוגה ב 300 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c. מכתים את הפתרון ולהשעות מחדש כל גלולה חרוז ב 400 μL של מאגר כתמים של FACS. . שולטת הפיצויים מוכנים לשימוש . המשיכו לאכול</li>
		</ol>
</li>
		<li>השתמש בפקדי FMO כדי למטב את צביעת הרקע עקב חפיפה ספקטרלית.<ol>
<li>הכינו שולטת FMO באמצעות 1 mL של תאים שהיה מצוטט מסעיף 4.1 בצינור 5 mL FACS והוסיף בכל הנוגדנים מהחלונית סמן המתואר בשלב 4.1.1 ב-1:100 דילול אך למעט נוגדן אחד. לדוגמה, להכין FMO NG2-AF488 על ידי כולל נוגדנים עבור CD31-APC, CD140b-PE, CD146-BV605, CD34-BV421, CD45-PE-Cy7, הכדאיות תא לצבוע אבל לא את הנוגדן NG2-AF488. מערבבים בעדינות על ידי הדופק-וורטקנג. חזור על כל נוגדן עבור סך של 7 פקדים. המשך 30 דקות ב -4 ° צ' מוגן מפני אור.</li>
			<li>הבא, להוסיף 3 מ ל של FACS הצביעת מאגר לכל צינור וצנטריפוגה ב 300 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c. מכתים את הפתרון ומשהה מחדש כל גלולה תא ב 400 μL של מאגר כתמים של FACS. פקדי FMO מוכנים לשימוש. . המשיכו לאכול</li>
		</ol>
</li>
		<li>השתמש בנוגדנים בקרה מתאימים (טבלת חומרים) עבור כתמים לא ספציפיים.<ol>
<li>הכינו שולטת isotype על ידי הוספת הנוגדן בקרת בקרה בהתאמה (טבלה של חומרים) ל 1 מ ל של דגימת תאים שהוכנו מסעיף 4.1 בשעה 1:100 דילול כל אחד ב 5 מ ל facs צינור. מערבבים בעדינות על ידי הדופק-וורטקנג. המשך 30 דקות ב -4 ° צ' מוגן מפני אור.</li>
			<li>הבא, להוסיף 3 מ ל של FACS הצביעת מאגר לכל צינור וצנטריפוגה ב 300 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c. מכתים את הפתרון ומשהה מחדש כל גלולה תא ב 400 μL של מאגר כתמים של FACS. פקדי isotype מוכנים לשימוש. . המשיכו לאכול</li>
		</ol>
</li>
		<li>הכן תאים להיות ממוינים על ידי הוספת קוקטייל נוגדן לתאים טריים מבודדים.<ol>
<li>להכין דגימת תא מסעיף 4.1 על-ידי הוספת בקוקטייל נוגדן המכיל אנטי-עכבר NG2-AF488, CD31-APC, CD140b-PE, CD146-BV605, CD34-BV421, CD45-PE-Cy7 ב 1:100 דילול כל הכדאיות תא לצבוע 1:1000 דילול. . מערבולת עדינה לערבב הגנה על דגימות ב -4 ° c עבור 30 דקות מוגן מפני אור.</li>
			<li>לאחר הצביעת, לשטוף תאים עם מאגר הצביעת FACS ידי צנטריפוגה ב 300 x g עבור 5 דקות 4 ° c. מכתים את הפתרון ולהשעות מחדש את הגלולה התא במאגר כתמים FACS כדי 0.5 x 106 תאים/mL.</li>
			<li>באמצעות צינורות facs חדשים כי יש 35 יקרומטר מסנן צמרות, פיפטה מוכתם דגימות תא על העפעפיים פילטרט הכבידה כדי להשיג השעיות תא יחיד. . המשיכו לאכול</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>השתמש בסדרן תאים כדי לטהר את התאים.
	<ol>
<li>הפעל את התאים הבלתי מוכתמים בסדרן התא כדי לקבוע את המתח ולתקן את אות הרקע (לדוגמה, קבע מתח לפיזור קדימה ל-490-560 ו-לפיזור צדדי עד 180-250).</li>
		<li>הפעל כל אחת מדוגמאות החרוזים בצבע אחד בכל פעם כדי לכוונן את המתח עבור כל ערוץ ולהתאים את השערים לאות החיובי. איסוף נתונים. השתמש בתוכנה כדי לחשב חפיפה ספקטרלית על-ידי חישוב מטריצת הפיצוי. . כל המתח מוכן ומוכנים</li>
		<li>הפעל כל פקד isotype אחד בכל פעם וניתן להשתמש בנתונים אלה כדי לכוונן את השערים עבור איגוד לא ספציפי אם קיימים.</li>
		<li>הפעל כל מדגם FMO אחד בזמן ולהתאים את המתח עבור כל ערוץ כדי לתקן את הדימום ספקטרלי בגלל לוח מרובה צבעים.</li>
		<li>הפעל את דגימות התא ויטראז ' בסדרן התא ולאסוף תאים ב 10 מ"ל מדיה לתרבות ללא אנזימים (DMEM גברת + 20% FBS + 1% P/S) בתוך שפופרת אוסף של 15 מ"ל. השתמש באסטרטגיה הבאה לאחר הפעולה: שער לתאים בודדים, שער לתאים חיים, שער לתאים שליליים CD45, שער לתאים CD34 וCD31 שליליים, שער לתאים NG2 חיוביים, ולבסוף שער עבור CD146 וCD140b תאים חיוביים.</li>
	</ol></li>
</ol>5. שתיל קרום הלב
<ol><li>מעיל צלחת 24-באר עם 0.2% ג'לטין עבור 5 דקות ומלא את הפתרון ג'לטין. זרעי התאים שהתקבלו טרי משלב 4.2.5 ב Dמאמ + 20% FBS + 1% P/S עד 2 x 104 תאים/cm2. תאי תרבות באינקובטור תא הממוקם ב37 ° c, 5% CO2 ו 95% O2.</li>
	<li>הפסולוציטים</li>
	<li>לאחר התאים הם 95% confluent, לשטוף תאים עם חם 1x DPBS, ולהרים תאים עם 200 μL של 0.1% טריפסין בכל באר בטמפרטורת החדר עבור 3-5 דקות.</li>
	<li>הקש בעדינות על הצלחת כדי לשחרר את התאים.</li>
	<li>לנטרל את טריפסין עם 3.5 x את כמות התקשורת התרבותית (700 μL Dמאמ + 20% FBS + 1% P/S) ואת הזרע מעבר שני (P2) תאים על צלחת 6-באר מצופה ב 2 x 104 תאים/ס"מ2.</li>
	<li>כל טוב, כאשר שוטפת, ניתן להעביר לתוך הבקבוקון T-75 יחיד כמו תאים P3 אשר לאחר מכן ניתן לפצל ביחס 1:6.</li>
</ol>6. אפיון קרום הלב
<ol><li>
מנתח זרימה
	<ol>
<li>השתמש באותו פרוטוקול של FACS הצביעת ומעבר אסטרטגיה כפי שתוארה קודם לכן בסעיף 4.</li>
		<li>הפעל פקדים ודגימות מוכתם על cytometer זרם. איסוף נתונים וניתוח נתונים באמצעות תוכנת הניתוח (טבלת חומרים).</li>
	</ol>
</li>
	<li>כדי לאסוף תמונות ברייטפילד, לגדול תאים בבקבוקון בחממה תא להגדיר ב 37 ° c, 5% CO2 ו 95% O2. לכידת תמונות על מיקרוסקופ לאחר תאים לצרף אל פני השטח.</li>
	<li>
אימונוציטוטוכימיה
	<ol>
<li>הגדל תאים בצלחת 96-באר עד 90% באמצעות. לשטוף את התאים עם חם 1x DPBS ולתקן עם 4% פאראמפורמלדהיד עבור 30 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>לשטוף את התאים 3x עם 1x DPBS והחדירות עם 0.1% אבקת כביסה עבור 10 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>דגירה תאים עם חסימה מאגר עבור 1 h בטמפרטורת החדר. לאחר חסימת, להוסיף נוגדנים העיקרי (נוגדן אחד לכל טוב) מדולל 1:100 בתוך חסימת מאגר ו דגירה ב 4 ° c לילה. נוגדנים עיקריים הם: anti-NG2, אנטי-CD140b, anti-CD31, אנטי vimentin, אנטי desmin, ו אנטי אלפא שריר חלק actin.</li>
		<li>למחרת, לשטוף את התאים 3x עם מאגר לשטוף (טבלת חומרים). הוסף נוגדן משני מדולל 1:1000 בתוך חסימת מאגר ו הדגירה עבור 2 h בטמפרטורת החדר בחושך. נוגדן משני הוא אנטי ארנב מצומת FITC.</li>
		<li>לשטוף את התאים 3x עם מאגר לשטוף. הוסף 300 μM כתם גרעיני מדולל ב 1:1000 עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>לשטוף את התאים 3x עם DPBS 1x ו הר עם הרכבה מדיה.</li>
		<li>התמונה תאים עם מיקרוסקופ קונפוקלית וקד.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Armulik, A., Abramsson, A., Betsholtz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial%2Fpericyte+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Endothelial/pericyte interactions.</a> Circulation Research. 97 (6), 512-523 (2005).</li>
<li>Armulik, A., Genove, G., Betsholtz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericytes%3A+developmental%2C+physiological%2C+and+pathological+perspectives%2C+problems%2C+and+promises%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Pericytes: developmental, physiological, and pathological perspectives, problems, and promises.</a> Developmental Cell. 21 (2), 193-215 (2011).</li>
<li>Sengillo, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deficiency+in+mural+vascular+cells+coincides+with+blood-brain+barrier+disruption+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Pathology%22%5BJournal%5D)">Deficiency in mural vascular cells coincides with blood-brain barrier disruption in Alzheimer's disease.</a> Brain Pathology. 23 (3), 303-310 (2013).</li>
<li>Avolio, E., Madeddu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovering+cardiac+pericyte+biology%3A+From+physiopathological+mechanisms+to+potential+therapeutic+applications+in+ischemic+heart+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Vascular+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Discovering cardiac pericyte biology: From physiopathological mechanisms to potential therapeutic applications in ischemic heart disease.</a> Vascular Pharmacology. 86, 53-63 (2016).</li>
<li>Dore-Duffy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+cerebral+microvascular+pericytes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of cerebral microvascular pericytes.</a> Methods in Molecular Medicine. 89, 375-382 (2003).</li>
<li>Bryan, B. A., D'Amore, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericyte+isolation+and+use+in+endothelial%2Fpericyte+coculture+models%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Pericyte isolation and use in endothelial/pericyte coculture models.</a> Methods in Enzymology. 443, 315-331 (2008).</li>
<li>Maier, C. L., Shepherd, B. R., Yi, T., Pober, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Explant+outgrowth%2C+propagation+and+characterization+of+human+pericytes%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Explant outgrowth, propagation and characterization of human pericytes.</a> Microcirculation. 17 (5), 367-380 (2010).</li>
<li>Crisan, M., Corselli, M., Chen, W. C., Peault, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perivascular+cells+for+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Perivascular cells for regenerative medicine.</a> Journal of Cellular Molecular Medicine. 16 (12), 2851-2860 (2012).</li>
<li>Crisan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+long-term+culture+of+multipotent+progenitor+cells+affiliated+with+the+walls+of+human+blood+vessels%3A+myoendothelial+cells+and+pericytes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Purification and long-term culture of multipotent progenitor cells affiliated with the walls of human blood vessels: myoendothelial cells and pericytes.</a> Methods in Cellular Biology. 86, 295-309 (2008).</li>
<li>Nees, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+bulk+cultivation%2C+and+characterization+of+coronary+microvascular+pericytes%3A+the+second+most+frequent+myocardial+cell+type+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+Heart+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Isolation, bulk cultivation, and characterization of coronary microvascular pericytes: the second most frequent myocardial cell type in vitro.</a> American Journal of Physiology Heart Circulatory Physiology. 302 (1), H69-H84 (2012).</li>
<li>Avolio, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+and+characterization+of+neonatal+cardiac+pericytes+provides+a+novel+cellular+option+for+tissue+engineering+in+congenital+heart+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Heart+Association%22%5BJournal%5D)">Expansion and characterization of neonatal cardiac pericytes provides a novel cellular option for tissue engineering in congenital heart disease.</a> Journal of the American Heart Association. 4 (6), e002043(2015).</li>
<li>Chen, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+myocardial+pericytes%3A+multipotent+mesodermal+precursors+exhibiting+cardiac+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Human myocardial pericytes: multipotent mesodermal precursors exhibiting cardiac specificity.</a> Stem Cells. 33 (2), 557-573 (2015).</li>
<li>Baily, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Perivascular+Multipotent+Precursor+Cell+Populations+from+Human+Cardiac+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation of Perivascular Multipotent Precursor Cell Populations from Human Cardiac Tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (116), e54252(2016).</li>
<li>Murray, I. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+and+cardiac+muscle+pericytes%3A+Functions+and+therapeutic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology+%26+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Skeletal and cardiac muscle pericytes: Functions and therapeutic potential.</a> Pharmacology & Therapeutics. 171, 65-74 (2017).</li>
<li>Birbrair, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+pericytes+in+skeletal+muscle+regeneration+and+fat+accumulation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Development%22%5BJournal%5D)">Role of pericytes in skeletal muscle regeneration and fat accumulation.</a> Stem Cells Development. 22 (16), 2298-2314 (2013).</li>
<li>Birbrair, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+pericyte+subtypes+differ+in+their+differentiation+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle pericyte subtypes differ in their differentiation potential.</a> Stem Cell Research. 10 (1), 67-84 (2013).</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

כאשר מחקרים על קרום הלב הם חדשים יחסית, התפקיד של קרום הלב בפיזיולוגיה לב וכלי דם פתופסיולוגיה עדיין לא הוגדרו. באיברים אחרים, הם הוכחו לשחק תפקידים מרכזיים הומאוסטזיס ו זלוף1,2. בהשוואה לספרות של כלולוציטים מאיברים אחרים כגון המוח, יש מספר משמעותי פחות של פרסומים על קרום הלב. הבידוד של קרום הלב הוא קריטי להבנת המאפיינים הפונקציונליים שלהם מנגנוני איתות. לפיכך, פרוטוקול זה יספק לחוקרים דרך קלה יותר לגשת לקרום הלב ממקור רקמות זמין ולקדם את הלימודים בביולוגיה. זה יעזור לענות על שאלות על כמה לב קרום הלב לתרום הומאוסטזיס לב פתופסולוגיה, כמו גם לחקור את הפוטנציאל התרפויטי שלהם.
האוכלוסיה המבודדת מליבו של מוריין ומתאפיינת ב-CD31-CD34-CD45-CD140b+NG2+CD146 הייתה מספר פעמים מרובות (עד P12 ועדיין הולך חזק), שאינו ירידה בכדאיות והפצת במהירות (איור משלים 2). התאים גם היו cryof רוזן והתאושש עם לפחות 95% הכדאיות. עם זאת, אנו מעדיפים להשתמש בתאים P7 או צעירים יותר עבור הניסויים שלנו. השוואת התמונות ברייטפילד של קרום הלב שלנו עם קרום הלב של המוח האנושי, שני קווי התא יש מורפולוגיה תאים דומים (איור 4a) בעוד הם נבדלים במבנה מתאי שריר חלקה (איור 4a). התאים הP7 שלנו הואפיינו על-ידי כימיה חיסונית של סמנים, חלקם מלוח FACS שלנו (NG2 ו-CD140b), ומעטים לא בפאנל (vimentin, desmin, αSMA) ומצאנו כי התאים הביעו סמנים ליטולוציטים (איור 4B). בנוסף, התאים P7 שלנו נותחו על ידי הזרימה cy, לנסות שוב עם פאנל סמן אותו כדי להעריך שינויים בביטוי סמן בשל הפסנה ומצאנו כי לא היו שינויים (איור 4C). לכן, התאים שלנו הם בדרך כלל ומורפולוגית.
המחקרים שנעשו על-ידי העקורים ואח '10, avolio ואח '11, חן ואח '12, ובאלי ואח '13 הראו בדלולי לב מוצלחים. עם זאת, השימוש בציוד מותאם אישית בתוך הבית לנתק את קרום הלב מן המיקרוכלים על ידי המים ואח '10 מעורב שני תאים עם משאבות כי המכונה הפתרון פרוטאז הלוך ושוב דרך מחסנית רשת רשת, אשר היה קשה לשכפל כפי שהם אינו מספק תרשים ו/או תמונה של המנגנון וכיצד הוא נבנה. למרות שאין מדובר ב-10 בהצלחה בבידוד לב הלב ממינים רבים, מעולם לא הצלחנו לשחזר את השיטה שלהם. צעד הניתוק שלנו בפרוטוקול שלנו פשוט משתמש שייקר מסלולית (כדי לנתק את כל התאים) אשר זמין ביותר, אם לא כל המעבדות, עם פתרון הרקמה והאנזים בצינור חרוט ואחריו צעד דיסוציאציה מכני. אין צורך במנגנון מותאם אישית. שנית, הפרוטוקולים הנותרים כוללים את השימוש ברקמות האדם ולכן הרכישה של רקמת האדם מגבילה את החוקרים. הפרוטוקול שלנו הוא שינוי ואופטימיזציה של הפרוטוקולים הנוכחיים9,12 באמצעות מודלים של העכבר (סוג פראי, שונה גנטית, חולה) וחומרים הזמינים בקלות לכל החוקרים.
בגלל התאים הפריסקולריים בכלל רגישים, הכדאיות של התאים הוא קריטי כדי לקבל תשואה טובה. במהלך הרכישה של רקמות לב וכתמים של תאים, את הרקמה/תאים צריך להישמר קרח קר. שנית, העיכול האנזימטי של הרקמה עשוי לדרוש אופטימיזציה על בסיס פרטני. בהתאם ליחידות הפעילות על מבחנות של האחד של אנזימים, ריכוז וזמן העיכול עשוי להיות ממוטב. ודא שהפתרון האנזימטי מוכן טרי בכל פעם שהתשואה אחרת תפחית. שלישית, תערובת גסה מכיל הרבה תאים, כמה מת ו/או גוסס, עדיף להנמיך את הריכוז של FBS במאגר הצביעת מ 5% כדי 2%. אם אתה נתקל בבעיות עם התאים סותם את הזרבובית במהלך מיון, להעשיר את התאים הראשון באמצעות ערכת הסרת תא מת. ניתן גם להוסיף מאגר EDTA/HEPES או הטיפול DNase לתא טרום מיון כדי למנוע כפתור התא. לבסוף, כי הפאנל שלנו של נוגדנים הוא די גדול ומשתמש fluorophores רבים, להיות בטוח שלך FMO פקדים ושולטת פיצוי נעשים כראוי.
מגבלה אחת לשיטה זו היא כמות קרום הלב שניתן להשיג לכל לב. במקרה שלנו, רק 1.1% של התערובת הגולמי שלנו מלב העכבר אחד היו קרום הלב אשר דומה לאחוז של הלב האנושי מבודדים, אבל מספר התאים הוא פחות משמעותית בשל כמות רקמת הלב מספק עכבר. מכיוון שהמספר ההתחלתי של תאים הוא כה נמוך לאחר FACS, עדיף לבודד מכמה לבבות בבת אחת. עם זאת, הבעיה עם זה היא המספר המוחלט של תאים שעליך למיין ביום אחד. אם יש לך יותר מ 30,000,000 תאים, יהיה קשה לעבור את המיון מבלי להשפיע על הכדאיות של התאים. אם היה לחוקר מספר רב של תאים, בידוד ממספר לבבות ביום יהיה בר ביצוע. מגבלה נוספת היא כי אנחנו לא יודעים אם יש אוכלוסיות משנה של קרום הלב בליבו כמו יש שריר השלד15,16, אנחנו לא יודעים אם אנחנו מבטלים תת סוג באסטרטגיית היציאה שלנו. אנחנו בתהליך של אפיון קרום הלב שלנו עד כה בנתונים שלא פורסמו, הם מבחינה פונקציונלית כמו קרום הלב אחרים בספרות.
הפרוטוקול שלנו יאפשר לחוקרים לענות על שאלות על תכונות לב הלב, מאפיינים, פונקציונליות, והיבטים אחרים אשר יסייעו להגדיר את תרומתם להומאוסטזיס הלב והימודינמיקה. תאים אלה יכול להיות פוטנציאל טיפולי למחלות לב וכלי דם פעם ביולוגיה שלהם מובנת טוב יותר.

התאים הפריכריים הידועים בשם קרום הלב להקיף את המיקרוכלים נימים של עץ כלי הדם1,2. פיזיולוגית, הם ידועים לקדם ולשחק חלק באנגיוגנזה, להגדיל את שלמות המכשול בשל הקשר ההדוק שלהם עם תאי האנדותל, כמו גם ייצוב כלי בוגרים1,2. יתר על כן, תפקוד לקוי ו/או אובדן של תאים אלה היו מעורבים במחלות כגון מחלת אלצהיימר2,3 ומחלות לב וכלי דם שונות4. תאים אלה נמצאים ברחבי הגוף כולו, אך מספרי התאים תלויים ברקמות. כתוצאה מהvasציטים הגבוהות של המכשול ממוח הדם1,2. עם זאת, בלב, הביולוגיה של כלבי קרום הלב היא לומדת באופן לא מנוצל.
לאחרונה, יש הרבה אינטרסים בתחום של קרום הלב, אבל כרגע אין פרוטוקול יעיל זמין לבידוד שלהם מאחד הכלים הנפוצים ביותר בביולוגיה — העכבר. ישנם פרוטוקולים בספרות על בידוד קרום הלב מהמוח5, רשתית6, שליה7, שריר השלד8,9; עם זאת, פרוטוקולים מעטים הם על בידוד כלבי קרום הלב. ישנן מספר קבוצות שיש להם בידוד קרום הלב. בתוך מינים רבים, כולל העכבר, הצליחו לבודד כמות שופעת של קרום הלב. עם זאת, השיטות שלהם השתמשו בציוד ספציפי בתוך הבית אשר מפחית את השגות10. Avolio ואח '11, חן ואח '12, ו baily et al.13 גם בהצלחה בבידוד לב קרום הלב מרקמת לב האדם, אבל רקמות האדם הם לא תמיד זמין וקשה להשיג עבור כמה חוקרים. כאן, פיתחנו שיטת בידוד כדי לקבל קרום הלב מדגמי העכבר עבור חוקרים כדי לחקור את הביולוגיה שלהם עם חומרים זמינים בקלות.
באמצעות מיון והפעלה של תאים מבוססי (FACS)עם סמניםמרכזיים, מאפשר לנו לבודד ולטהר אוכלוסייה של כנוציטים המאופיינת ב-CD31-CD34-CD45- CD140b+NG2+CD146+. לוח הסמנים שלנו מכיל הן סמני הכללה והן סמנים להדרה. CD45 משמש כסמן כדי להוציא תאים המטפאות. CD31 משמש כסמן כדי להוציא תאים אנדותל. CD34 משמש כסמן כדי להוציא את התאים המטפאות והאנדותל. CD146 הוא סמן עבור תאים פריסקולרית. לבסוף, NG2 ו-CD140b (הידוע גם בשם טסיות הנגזרת הצמיחה מקדם הגדילה ביתא-PDGFRβ) הם שני סמנים מקובלים עבור קרום הלב14. התרבות העיקרית המתקבלת יכולה להיות תרבותית ומעבר מספר פעמים ללא שינויים במבנה או בביטוי הסמן. יתר על כן, תאים אלה יכולים להיות שותפים לתרבות עם תאים אנדותל כדי ללמוד אינטראקציות שלהם הצלבות אחד עם השני. שיטת בידוד התא תאפשר לחוקרים ללמוד את הביולוגיה ואת הפתופסולוגיה של קרום הלב מסוג פראי, מחלות, ומודלים גנטית של העכבר משתנה.

<table><tbody><tr><td>0.25% טריפסין-EDTA</td><td>קורנינג</td><td>25-053-Cl</td><td>מדלל עם 1x DPBS כדי לקבל 0.1%</td></tr><tr><td>100 &mu; מסננת תאים M</td><td>FisherSci</td><td>22363549</td><td></td></tr><tr><td>15 מ"ל צינורות חרוטיים בז</td><td>BD</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>צלחת 24 בארות</td><td>קורנינג</td><td>CLS3527</td><td></td></tr><tr><td>25 גרם מחט פרפר</td><td>FisherSci</td><td>22-253-146</td><td></td></tr><tr><td>31 גרם מזרק מחט</td><td>FisherSci</td><td>B328446</td><td></td></tr><tr><td>50 מ"ל צינורות חרוטיים בז</td><td>BD</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>צלחת 6 בארות</td><td>קורנינג</td><td>CLS3516</td><td></td></tr><tr><td>אנטי-אלפא שריר חלק אקטין ארנב mAb</td><td>abcam</td><td>ab32575</td><td>נוגדן בשימוש ב-ICC 1:100 דילול</td></tr><tr><td>אנטי-CD140b ארנב mAb</td><td>איתות תאים</td><td>28E1</td><td>נוגדן בשימוש ב-ICC 1:100 דילול</td></tr><tr><td>אנטי-CD31 ארנב</td><td>pAb</td><td>abcam ab28364</td><td>נוגדן בשימוש ב-ICC 1:100 דילול</td></tr><tr><td>ארנב נגד דסמין pAb</td><td>abcam</td><td>ab8592</td><td>נוגדן בשימוש ב-ICC 1:100 דילול</td></tr><tr><td>anti-NG2 מצומד ל-AF488</td><td>Millipore</td><td>MAB5384A4</td><td>נוגדן המשמש ב-ICC 1:100 דילול</td></tr><tr><td>אנטי-וימנטין ארנב mAb</td><td>abcam</td><td>ab92547</td><td>נוגדן בשימוש ב-ICC 1:100 דילול</td></tr><tr><td>ArC אמין תגובתי פיצוי חרוזים</td><td>Invitrogen</td><td>A10346</td><td>חרוזי פיצוי עבור חי/מת ליד צבע IR</td></tr><tr><td>Brightfield מצלמת מיקרוסקופ</td><td></td><td></td><td>מחוברת</td></tr><tr><td>CD140b-PE (שיבוט APB5)</td><td>eBioscience</td><td>12-1402-81</td><td>נוגדן המשמש בדילול FACS 1:100</td></tr><tr><td>CD146-BV605 (שיבוט ME-9F1)</td><td>BD</td><td>740434</td><td>נוגדן המשמש בדילול FACS 1:100</td></tr><tr><td>CD31-APC (שיבוט MEC 13.3)</td><td>BD</td><td>551262</td><td>נוגדן המשמש בדילול FACS 1:100</td></tr><tr><td>CD34-BV421 (שיבוט RAM 34)</td><td>BD</td><td>56268</td><td>נוגדן המשמש בדילול FACS 1:100</td></tr><tr><td>CD45-PE-Cy7 (שיבוט 30-F11)</td><td>BD</td><td>552848</td><td>נוגדן המשמש בדילול FACS 1:100</td></tr><tr><td>צנטריפוגה</td><td>אפנדורף</td><td></td><td></td></tr><tr><td>קולגנאז B</td><td>Roche</td><td>11088815001</td><td>0.226 U/mg lyo.</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ</td><td></td><td></td><td></td>קונפוקלי</tr><tr><td>DAPI</td><td>ThermoFisher</td><td>D1306</td><td>כתם גרעיני</td></tr><tr><td>DMEM עם 4.5 גרם/ליטר גלוקוז, L-גלוטמין ונתרן פירובט</td><td>קורנינג</td><td>10-013-CV</td><td>500 מ"ל</td></tr><tr><td>מספריים Dowell</td><td>FST</td><td>15040-11</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Lump-Buffered Saps (DPBS)</td><td>קורנינג</td><td>21-030-CV</td><td>500 מ"ל</td></tr><tr><td>תמיסת מלח חוצצת פוספט של Dulbecco ללא Ca ו-Mg (CMF-DPBS)</td><td>קורנינג</td><td>21-031-CV</td><td>500 מ"ל</td></tr><tr><td>Dumont #5 מלקחיים עדינים</td><td>FST</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>FACSAria סדרן תאים</td><td>BD</td><td></td><td>לייזרים: 405 ננומטר 50 mW, 488 ננומטר 100 mW, 561 ננומטר 50mW, 633 ננומטר 11 mW</td></tr><tr><td>תוכנת FACSAria</td><td></td> שפופרת BD <td></td><td></td></tr><tr><td>Falcon פוליפרופילן תחתון עגול, 5 מ"ל</td><td>BD</td><td>38057</td><td></td></tr><tr><td>צינור פלקון עם מכסה מסננת תאים, 5 מ"ל</td><td>BD</td><td>08-771-23</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>קורנינג</td><td>35-015-CV</td><td>500 מ"ל</td></tr><tr><td>מספריים עדינים</td><td>FST</td><td>14060-09</td><td></td></tr><tr><td>תוכנת FlowJo</td><td>FlowJo LLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fortessa LSR זרימה ציטומטר</td><td>BD</td><td></td><td>לייזרים: 405 ננומטר 50 mW, 488 ננומטר 100 mW, 561 ננומטר 50mW, 633 ננומטר 11 mW</td></tr><tr><td>ציפוי על בסיס ג'לטין</td><td>Cell Biologics</td><td>6950</td><td></td></tr><tr><td>עז נגד ארנב IgG (H+L) נוגדן משני נספג צולב, Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-11008</td><td>נוגדן המשמש ב-ICC 1:1000 דילול</td></tr><tr><td>מלקחיים Graefe FST</td><td></td><td>11049-10</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת נתרן הפרין</td><td>Hospira</td><td>NDC 0409-2720-02</td><td>10,000 יחידות USP / 10 מ"ל; מאינקובטור מעי חזיר</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>מוגדר על 37 מעלות; C, 5% CO2, 95% O2&nbsp;</td></tr><tr><td>חי/מת-ליד IR</td><td>Life Technologies</td><td>L10119</td><td></td></tr><tr><td>שקופיות מיקרוסקופ</td><td>FisherSci</td><td>12-550-343</td><td></td></tr><tr><td>NG2-FITC</td><td>Millipore</td><td></td><td>נוגדן AB5320A4 המשמש ב-FACS 1:100 דילול</td></tr><tr><td>שייקר Oribital</td><td>VWR</td><td></td><td>בפנים 37 & deg; חממה C או חדר</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>FisherSci</td><td>50-980-487</td><td>לדלל עם 1x DPBS כדי לקבל 4%</td></tr> <tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין</td><td>קורנינג</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; צלחת פטרי</td><td>FisherSci</td><td>FB0875714</td><td></td></tr><tr><td>פיפטה וטיפים</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ProLong Diamond</td><td>ThermoFisher</td><td>P36965</td><td>מדיית הרכבה</td></tr><tr><td>Propidum Iodide</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td>צבע כדאיות תאים לאיור משלים 2</td></tr><tr><td>ארנב IgG FITC</td><td>eBiosciences</td><td>11-4614-80</td><td>נוגדן בקרת איזוטיפ - FITC</td></tr><tr><td>Rat IgG2a APC</td><td>נוגדן בקרת איזוטיפ Biolegend</td><td>400512</td><td>- APC</td></tr><tr><td>Rat IgG2a BV421</td><td>נוגדן בקרת איזוטיפ Biolegend</td><td>400536</td><td>- BV421</td></tr><tr><td>Rat IgG2a BV605</td><td>BD</td><td>563144</td><td>נוגדן לבקרת איזוטיפ - BV605</td></tr><tr><td>Rat IgG2a PE</td><td>Biolegend</td><td>400308</td><td>נוגדן לבקרת איזוטיפ - PE</td></tr><tr><td>Rat IgG2b PE-Cy7</td><td>Biolegend</td><td>400617</td><td>בקרת איזוטיפ נוגדן - PE-Cy7</td></tr><tr><td>SuperBlock</td><td>ThermoFisher</td><td>37515</td><td>חסימת מאגר</td></tr><tr><td>T75</td><td>ThermoFisher</td><td>156499</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td>חומר ניקוי, לדלל עם x DPBS כדי לקבל 0.1%</td></tr> <tr><td>חרוזי UltraComp</td><td>Invitrogen</td><td>01-2222-42</td><td>חרוזי פיצוי</td></tr><tr><td>משאבה פריסטלטית בזרימה משתנה</td><td>FisherSci</td><td>13-876-1</td><td></td></tr><tr><td>מונה תאי ViCell</td><td>מאגר</td> Beckman <td></td><td></td></tr><tr><td>Wash</td><td>דילול 1:10 של Superblock ב-1x DPBS</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

בידוד וטיהור של קרום הלב של מורלין

Isolation and Purification of Murine Cardiac Pericytes

בתאי קרום הלב, התאים הפריכריים של כלי הדם והנימים, ידועים כחלק ב אנגיוגנזה, ייצוב כלי, ושלמות המכשול האנדותל. עם זאת, פונקציות ספציפיות לרקמות שלהן בלב אינן מובנות היטב. כמו-כן, אין בשלב זה פרוטוקול ניצול חומרים נגישים כדי לבודד ולטהר את קרום הלב ממקור הלב. הפרוטוקול שלנו מתמקד בשימוש במודל היונקים הנפוץ ביותר, בעכבר, כמקור התאים שלנו. בעזרת העיכול האנזימטי והדיסוציאציה המכנית של רקמת הלב, הצלחנו להשיג תערובת תאית גסה שהייתה מטוהרת עוד יותר על-ידי הפעלת מיון תאים באמצעות קרינה פלואורסצנטית (FACS) על ידי שפע של סמנים. מכיוון שאין סמן חד משמעי אחד לקרום הלב, אנו מגודרת עבור תאים שהיו CD31-CD34-CD45-CD140b+NG2+CD146+. לאחר הטיהור, תאים ראשוניים אלה היו מתורבתים ומעבר מספר פעמים ללא כל שינוי מורפולוגיה וביטוי סמן. עם היכולת להשיג באופן קבוע קרום הלב מורלין העיקרי באמצעות הפרוטוקול שלנו, אנו מקווים להבין עוד יותר את התפקיד של קרום הלב בפיזיולוגיה לב וכלי דם הפוטנציאל התרפויטי שלהם.

לאחר העיכול האנזימטי והדיסוציאציה של הלב כולו ולפני הטיהור של התאים, התאים הם תערובת גסה המכילה סוגי תאים שונים רבים מהלב (איור 1A). לאחר הטיהור והתפירה של FACS, התאים הם הומוגניים. הם נוקלאוניים בודדים, שטוחים למדי, ויש להם את המבנה האופייני לקרום הלב (איור 1B).
באמצעות FACS, התאים מטוהרים לאירוע הומופאלי. דגימת תא הבקרה הבלתי מוכתמת משמשת להצגת אסטרטגיית החסימה (איור 2). ראשית, פסולת ו doublets היו מגודרת בהתבסס על הפצות פיזור קדימה בצד. ואז התאים המתים היו מגודרת בשל תגובת האמין שלהם עם הצבע אשר מייצרת אות גדול יותר אינטנסיבי יותר מאשר תאים חיים. של תאים לחיות, תאים המטבטיים היו מגודרת על ידי להיות CD45+. כדי להסיר עוד תאים המטפאות והאנדותל, CD34+ ו CD31+ תאים היו מגודרת. לבסוף, NG2+ ו CD140b+/cd146+ תאים נבחרו להיות התאים הפריאוריים עם ביטוי של סמנים אופייני לקרום הלב (איור 3). פאנל הסמן נבדק גם על התאים הכליליים בעכבר כלילית כפקד (איור משלים 1). רק בערך 1% מתערובת התא הגולמי הייתה מורכבת מקרום הלב לאחר המיון.
כדי לוודא כי התאים היו אכן קרום הלב, העברנו את התאים לאפיון נוסף. תאים גדלו במהירות ברגע שהם הגיעו P3 בתוך מבחנות T-75 ללא שינויים הכדאיות כפי שהם הפכו מבוגרים (משלים איור 2). בהשוואה לקרום הלב של המוח האנושי, לתאים היתה מורפולוגיה דומה (איור 4A). כאשר לעומת העכבר האדם תאים שריר חלק, התאים היו מורפולוגיה שונה (איור 4A). היו גם לא שינויים נצפתה מורפולוגיה או ביטוי סמן ב P7 כאשר מוכתם חיסוני או על ידי הזרימה cy, לנסות ניתוח לאחר הפסנת (איור 4B,C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59571/59571fig1.jpg"> איור 1 : תאים גסים לעומת תאים מטוהרים. (א) התמונה ברייטפילד של תערובת התא הגולמי הצבת את כל העיכול והדיסוציאציה של הלב האנזימטי שהיה מתורבת בבקבוקון T25 במשך 14 יום. (ב) תמונת ברייטפילד של אוכלוסיה הומוגנית בקרום הלב לאחר 14 ימים. סרגל קנה מידה = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59571/59571fig1large.jpg" target="_blank">נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59571/59571fig2v2.jpg"> איור 2 : תמונות מייצגות של ניתוח FACS של תאים בלתי מוכתמים. ייצוג סכימטי של אסטרטגיית העליה המשמשת לטיהור שילוב תאים גולמי. שער לתאים בודדים, חיים, CD45-, CD31-, CD34-, NG2+, CD146+וCD140b+. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59571/59571fig2v2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59571/59571fig3.jpg"> איור 3 : תמונות מייצגות של ניתוח FACS של תאים גולמיים. ייצוג סכמטי של המיון המשמש להשגת אוכלוסיה הומוגנית בקרום הלב. בערך 1% של תאים גולמיים הם CD31-CD34-CD45-CD140b+NG2+CD146+. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59571/59571fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59571/59571fig4.jpg"> איור 4 : אפיון מבודד בעלי לב קרום הלב (א) ברייטפילד תמונות של תאים מתורבתים מהמוח האנושי (hPC) ולבבות העכבר (mpc) מראים דומה מורפולוגיה של תאי קרום הלב אך מורפולוגיה שונה מתאי השריר החלקים האנושיים hsmc) והעכבר החלק השריר החלקה (mSMC). סרגל בקנה מידה = 100 μm. (ב) אפיון פנוטיציאני של תאים בP7 על ידי אימונוציטוכימיה עבור סמנים כלעיים. סרגל בקנה מידה = 100 μm. (ג) ניתוח על ידי זרימה cyP7 try של קרום הלב ב איפה הם היו מגודרת סמנים שליליים CD31, CD34, CD45 ו סמנים חיוביים NG2, CD140b, ו CD146. האוכלוסיה נשארת אחידה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59571/59571fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
משלים איור 1: דמויות מייצגות של הזרימה cy, לנסות בתאי האנדותל באמצעות סמן הפאנל. קו של תא כלילי לעורק העכבר שימש כפקד עבור ספציפיות האיגוד עבור הסמנים. השימוש באותה אסטרטגיה שהיתה בשימוש במיון, למעט שער חיובי עבור CD31 במקום שער שלילי, תאי האנדותל היו שליליים עבור CD45, CD34, NG2, CD140b ו-CD146, אך חיובי עבור CD31 כצפוי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59571/JOVE_Suppl_Figure_1.tif" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד את האיור.</a>
איור משלים 2: תמונות מייצגות של הזרימה cy, לנסות לנתח של קטעים שונים של mPC. קרום הלב המבודד והיסודי. היה תרבותי והגיע למעבר 12 תאים היו מוכתמים propidium יודיד ונותחו על cytometer זרימה. אוכלוסיית הבקרה היא תערובת של תאים מתים ותאים חיים. לא היו הבדלים משמעותיים במספר תאים קיימא בין מעברים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59571/JOVE_Suppl_Figure_2.tif" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד את האיור.</a>

על מנת לבודד ולטהר את קרום הלב למחקרים בסיסיים ולחקור את הפוטנציאל הטיפולי של הביולוגיה שלהם.

Pericytes, perivascular cells of microvessels and capillaries, are known to play a part in angiogenesis, vessel stabilization, and endothelial barrier ...

הפרוטוקול שלנו מותאם למודל העכבר ומשתמש בחומרים הזמינים לכל החוקרים. טכניקה זו יכולה להיות מיושמת על מודלים בריאים, מחלות או עכברים שהשתנו גנטית. הפרוטוקול שלנו יאפשר לחוקרים לענות על כל שאלה על ביולוגיה של פריסייט לב מכל מודל עכבר של מחלה או וריאציה גנטית.הליך זה יספק תובנה על ביולוגיה של פריציט לב ויעזור לנו להבין את תרומתם הונוסטזיס לב המודינמיקה הן בריאות ומחלות. מניחים את העכבר הרדמה בתמקם סופין, וקלטת לאורך צלעותיו. בזהירות לפתוח את חלל החזה, ו cannulate את בית הנוקטה היורד באמצעות מחט פרפר 25-מד.תעשה חתך באולם הנכון. לאחר מכן, לבלבל את הלב עם לפחות 20 מיליליטר של 250 יחידות למיליליטר heparinized, סידן-מגנזיום ללא פוספט של דולבקו תמיסת מלח במאגר בשני מיליליטר לדקה עם משאבה פריסטולית זרימה משתנה. זלוק הושלם כאשר PBS נקי יוצא האטריה הנכונה.חותכים את הלב ב aorta, וממקמים אותו לתוך DPBS קר כקרח סידן-מגנזיום. לאחר מכן, מעבירים את הלב לצלחת פטרי באורך 15 על 15 ס"מ. חותכים את הלב לחתיכות זעירות באמצעות מספריים האביב מדפים נקודה עדין עם פתרון אנזים מספיק כדי לכסות את החלקים.עכשיו, להעביר את החלקים והפתרון לתוך צינור חרוט 50 מיליליטר, ולאטום עם סרט פלסטיק פרפין. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס על שייקר מסלולית ב 120 סל"ד במשך 75 דקות. לאחר עיכול קולגנס עם פתרון האנזים, decant הנוזל דרך מסננת תא 100 מיקרון לתוך צינור חדש 50 מיליליטר, משאיר מספיק פתרון, כך חתיכות לא להתייבש.באמצעות מדפים עדין נקודה, לקחת את הרקמה מהצינור ולמקום כמה חתיכות על מגלשת מיקרוסקופ. לאחר מכן, לטחון את הרקמה בין שתי שקופיות מיקרוסקופ כדי לשבור את הרקמה. שטפו את השקופיות עם מדיה תרבותית נטולת אנזימים לצינור חרוט חדש של 50 מיליליטר.חזור על שלב זה עד שכל חתיכות הרקמה ינותק. שלבו את הפתרון המתוח ואת רקמת הקרקע לצינור אחד. מסננים את ההשעיה וכתוצאה מכך דרך מסננת תא 100 מיקרון לתוך צינור חרוט חדש 50 מיליליטר.צנטריפוגה המדגם ב 220 פעמים g וארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. שאפו את הפתרון הקודם, והשקיעו בעדינות את גלולת התא במאגר כתמים קר של FACS המכיל DPBS ואלבומין סרום בקר. ספור את התאים ובדוק את יכולת הקיום באמצעות מונה תאים.לדלל את התאים למיליון תאים למיליליטר עם מאגר כתמים FACS קר המכיל DPBS ואלבומין סרום בקר. התאים מוכנים כעת להיות מוכתמים ומימוינים. הכן ותייג צינורות FACS באורך חמישה מיליליטר עבור כל הפקדים ודגימות התאים.Aliquot מיליליטר אחד של תאים לצינור עבור מדגם נגוע, פלואורסצנטיות מינוס פקד אחד, ופקדים תואמי isotype. השתמש בתאים הנותרים עבור המיון. ניתן להכין ולהכתים בו זמנית את כל הפקדים והדגימות.כמו כן, להכין ולתייג צינורות FACS חמישה מיליליטר עבור סך של תשעה פקדי פיצוי, שני סוגים של חרוזים נגועים בתוספת שבעה פלואורוכרומים שונים מ לוח הסמן. כדי לייעל את פקדי פיצוי הפלואורסצנטיות, הוסף טיפה אחת של קדימות פיצוי מבקבוקון הסחיטה לכל צינור. לאחר מכן, מוסיפים מיקרוליטר אחד של נוגדן ל חרוזים.חזור על הפעולה עבור כל נוגדן מחלונית הסמן. השתמש בפקדי FMO כדי למטב כתמי רקע עקב חפיפה ספקטרלית. לתאים בצינורות הבקרה של FMO, הוסיפו את כל הנוגדנים מהלוח של הסמן בדילול של אחד ל-100, אך אל תכלול נוגדן אחד.חזור על הפעולה עבור כל נוגדן עבור סך של שבעה פקדים. השתמש בנוגדני בקרה תואמי isotype עבור כתמים לא ספציפיים. לתאים בצינורות המסווים התואמים לאיסוטיפ, הוסיפו את נוגדן הבקרה תואם האימוטיפ בדילול של 1 ל-100.לאחר מכן, הכן את התאים למיון. לתאים המבודדים הטריים, הוסיפו קוקטייל נוגדנים בדילול של 1 עד 100. כמו כן, להוסיף צבע הכדאיות של התא בדילול של אחד ל-1, 000.מערבבים במרץ את בקרות הפיצוי על ידי מערבולת דופק. דגירה במשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס, מוגן מפני אור, למעט חרוזי הכדאיות התא, אשר ניתן להשאיר בטמפרטורת החדר, מוגן מפני אור. ערבבו בעדינות את פקדי ה-FMO, את הפקדים התואמים לאימוטיפ ואת התאים למיון לפי מערבולות דופק.דגירה במשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס, מוגן מפני אור. הוסף שלושה מיליליטר של מאגר כתמי FACS לכל בקרת פיצוי, בקרת FMO ובקרת isotype. צנטריפוגה הצינורות ב 300 פעמים g במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס.שאף את הפתרון, ולחץ מחדש על כל גלולה ב-400 מיקרוליטרים של מאגר הכתמים FACS. פקדי הפיצוי, פקדי FMO ופקדי isotype מוכנים כעת לשימוש. לאחר הכתמים, לשטוף את התאים עם חיץ כתמים FACS על ידי צנטריפוגה ב 300 פעמים g במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס.שאף את הפתרון, ולחץ מחדש על גלולת התא במאגר הכתמים FACS ל-0.5 מיליון תאים למיליליטר. באמצעות צינורות FACS חדשים עם צמרות מסנן 35 מיקרון, pipette דגימות התא המוכתם על המכסים ואת סינון הכבידה כדי להשיג מתלים חד-תאיים. שמור על קרח.השתמש בסדרן תאים כדי לטהר את התאים. הפעל את התאים שאינם נגועים בסדרן התאים כדי להגדיר מתחים ולתקן את אות הרקע. הפעל כל דגימת חרוז פיצוי בצבע יחיד בזה אחר זה כדי להתאים מתחים עבור כל ערוץ ולהתאים שערים לאות החיובי.לאסוף את הנתונים. השתמש בתוכנה כדי לחשב עבור חפיפה ספקטרלית על-ידי חישוב מטריצת הפיצוי. כל המתחים מוכנים ומוגדרים.הפעל כל פקד isotype בזה אחר זה. ניתן להשתמש בנתונים אלה כדי להתאים שערים עבור איגוד לא ספציפי אם קיימים כאלה. הפעל כל דגימת FMO אחת בכל פעם.כוונן מתחים עבור כל ערוץ כדי לתקן את הגלישה הספקטרלית עקב לוח צבעוני. הפעל את דגימות התא המוכתמות בסדרן התאים. לאסוף תאים במדיה 10 מיליליטר ללא אנזימים תרבות בצינור איסוף חרוט 15 מיליליטר.השתמש באסטרטגיית gating הבאה. ראשית, שער לתאים בודדים. ואז, שער לתאים חיים.לאחר מכן, שער לתאים שליליים CD45. שער לתאים שליליים CD34 ו- CD31. לאחר מכן, שער לתאים NG2 חיוביים.ולבסוף, שער לתאים חיוביים CD146 ו- CD140b. לתרבות pericytes, לזרוע את התאים שהושגו טרי במדיה תרבות ללא אנזימים על צלחת מצופה 24 באר. תרבו את התאים באינקובטור תאים ב-37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו-חמצני ו-95% חמצן.לאחר עיכול אנזימטי ודיסוציאציה של הלב כולו ולפני טיהור FACS של התאים, תאים הם תערובת גסה המכילים סוגי תאים רבים ושונים מהלב. לאחר טיהור FACS ו culturing, תאים הם הומוגניים. הם גרעין יחיד, שטוח למדי, ויש להם את המורפולוגיה הרומבואידית הטיפוסית.באמצעות FACS, תאים מטוהרים להומוגניים. ראשית, פסולת וכפולים היו מגודרים החוצה בהתבסס על חלוקות פיזור קדימה וצד. לאחר מכן, תאים מתים היו מגודרים החוצה עקב תגובת המין שלהם עם הצבע, אשר מייצר אות גדול יותר אינטנסיבי יותר מאשר תאים חיים.מתוך התאים החיים, תאים hematopoietic היו מגודרים החוצה על ידי היותו CD45 חיובי. כדי להסיר עוד יותר תאים hematopoietic ו אנדותל, CD34 חיובי ו CD31 חיובי תאים היו מגודרים החוצה. לבסוף, תאים חיוביים NG2 ו CD140b/CD146 חיובי נבחרו להיות תאים כלי דם עם ביטוי של סמני pericyte טיפוסי.בהשוואה לתותח מוח אנושי, לתאים הייתה מורפולוגיה דומה. בהשוואה לעכבר ותאי שריר חלקים אנושיים, לתאים היה אפיון פנוטיפי מורפולוגי שונה של תאים במעבר שבע על ידי אימונוציטוכימיה עבור סמני פריצייטים לא הראו שינויים שנצפו במורפולוגיה או בביטוי סמן. באופן דומה, ניתוח על ידי ציטומטריית זרימה של pericytes במעבר שבע אישר כי האוכלוסייה נשאר הומוגנית.כדאיות התא היא קריטית כדי להשיג תשואה טובה. שמור על קור רקמות במהלך הרכש, ולשמור על התאים קרים במהלך כתמי התא. כמו כן, ודא כי הפתרון אנזימטי מוכן טרי בכל פעם.כדי להבטיח בידוד של התאים הנכונים לאחר culturing, לאפיין אותם עם ציטומטריה זרימה וכתמים immunofluorescent. תאים אלה יכולים לשמש בניסויים coculture עם תאים אנדותל למחקרי מחסום תפקודי, כמו גם בדיקות ללמוד את התפקוד הביולוגי והפיזיולוגי שלהם ואת המאפיינים. יליצי לב ממלאים תפקיד בסיסי בשלמות כלי הדם וביציבותם, והתפקוד הלקוי שלהם הוא תוצאתי לתפקוד הלב העולמי.עם הטכניקה שלנו, חוקרים יכולים לחקור את הפוטנציאל הטיפולי של pericytes לב.

isolation-and-purification-of-murine-cardiac-pericytes

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

כאן אנו מתארים פרוטוקול לבידוד והתרבות של Murine לתאי אנדותל ריאתי. שיטה זו כוללת מכונאי דיסוציאציה האנזימטית רקמת הריאות, כמו גם תהליך צעד 2-טיהור באמצעות אנטי PECAM-1 ואנטי ICAM-2 נוגדנים מצומדות כדי חרוזים מגנטיים, אשר מייצר אוכלוסיה טהור תא האנדותל של כלי הדם בעיקר מקור.

בידוד תרבות לתאי אנדותל ריאתי מעכברים ילודים

סרטון זה מדגים שיטה לבידוד פריציטים מוחיים ממוח עכבר. התאים המבודדים מתורבתים במדיה ספציפית לפריציטים כדי לקדם את התפשטות הפריציטים.

בידוד וטיפוח פריציטים מוחיים של עכברים

מטרת פרוטוקול זה היא להדגים את טכניקות בידוד וההתרבות של תאי שריר חלק בכלי דם בעכברים עיקריים (VSMCs) מהמחזור כלילית. לאחר VSMCs בודד, הם יכולים לשמש עבור טכניקות תרבות סטנדרטיות רבות.

בידוד של תאי שריר חלק Murine כלילית דם

ברקמת לב אדם מטפחת אוכלוסיות תאי מבשר perivascular מולטיפוטנטיים שעשויה להיות מתאים התחדשות שריר לב. הטכניקה המתוארת כאן מאפשרת בידוד סימולטני וטיהור שתי אוכלוסיות תאי סטרומה מולטיפוטנטיים קשורות כלי דם מקומיים, כלומר CD146 + CD34 - pericytes ו CD34 + CD146 - תאי adventitial, מן שריר הלב האנושי.

בידוד של אוכלוסיות תאי perivascular מולטיפוטנטיים המבשרים מרקמות אדם לב

עבודה זו מתארת ​​פרוטוקול מבוסס FACS המאפשר בידוד קל בו זמנית של סוג I ו pericytes סוג II של שרירי השלד.

בידוד של סוג אני ו II סוג pericytes של עכבר שרירי השלד

Microvascular תאי אנדותל של שרירי השלד (MMEC) לעצב את הדופן הפנימית של שריר נימים ולווסת את שניהם, חילופי נוזלים/מולקולות והעברה של תאים (חיסוניים) בין רקמת שריר, דם. בידוד של MMEC מאתר ראשי, כפי שמתואר כאן, מאפשר מקיף חקירות במבחנה של יחידת"myovascular".

בידוד של תאי אנדותל Microvascular ראשי שריר השלד מאתר

אנחנו מציגים פרוטוקול להפקת. קרום המוח של מורציטים פרוטוקול זה הינו כלי רב ערך עבור מחקרים בלתי מתורבת המספקים טוהר גבוה ותשואה גבוהה, ובכך מקטין את מספר החיות הנסיוניות המשמשות.

שיטת פלט גבוהה כדי לבודד קרום הלב של מוחין מהעכבר

פיתחנו שיטה פישוטe לבידוד תאי לב בודדים באיכות גבוהה על ידי טכניקת זלוף antegrade. שיטה זו היא נטולת לנגנדורף ושימושית לבידוד מיוציטים חדריים ופרונליים או תאים ביניים, כגון פיברובלסטים לבביים או אבות.

שיטת זלוף Antegrade לבידוד קרדיומיוציטים מעכברים

תקן הזהב בקרדיולוגיה לניסויים פונקציונליים תאיים ומולקולריים הוא קרדיומיוציטים. מאמר זה מתאר התאמות לטכניקה שאינה לנגנדורף לבידוד קרדיומיוציטים של עכברים.

שיטה פשוטה ויעילה לבודד באופן עקבי קרדיומיוציטים עכבר

כדי להשיג פריציטים קורטיקליים במוח העכבר העומדים בדרישות scRNA-seq, אנו מציגים פרוטוקול FACS מותאם באופן קריטי המבוסס על בחירת CD13⁺/CD31⁻. השיפורים המרכזיים שלנו משפרים משמעותית את חיוניות התא ואת שלמות ה-RNA, ומאפשרים פרופיל טרנסקריפטומי אמין.

בידוד פריציטים מרקמת קורטיקת העכבר באמצעות FACS לצורך ריצוף תא יחיד

למד פרוטוקול מותאם לבידוד וטיהור פריציטים קרדיאליים ממודלים מוריניים. השיטה משתמשת ב-FACS לטיהור תאים ומאפשרת חקר ביולוגיה של פריציטים לבביים ויישומים תרפואיים.

בידוד וטיהור של קרום הלב של מורלין

גלה סרטונים נוספים