Name: לוקליזציה של חלבונים ששונו באמצעות סומו פלורסנט-השמנה חלבונים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 23 s
Description: למד זיהוי חלבוני SUMO ששונו באמצעות kmUTAG פלורסנטי בתרביות תאים יונקים ובשחלות נמטודות. שיטה זו מאפשרת ויזואליזציה ללא נוגדנים לחקר תפקיד SUMO בסרטן ובמחלות נוירודגנרטיביות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו רוצים להודות לכל חברי מעבדת קרשר על תמיכתם, נטלי נגוין לקריאה קריטית של כתב היד, ו Lidia Epp לרצף. עבודה זו נתמכת על ידי קרן המיסחור מחקר של חבר העמים MF16-034-LS כדי OK. הסיוע במחקר לתלמידי W & M סופק על ידי קרן ביילי-יוסטון למחקר, ושארל סנטר כבוד מלגות ל-RY ו-CH.

1. איתור סומו בתאי תרבות קבועה ברקמה באמצעות רקומביננטי KmUTAG-FL חלבון השמנה להשמנה
<ol><li>הגדל תאים התרבות הרקמה של בחירה על 22 מילימטר עגול לכסות מחליק 6-היטב לוחות TC עד 70% – 80% confluent. בצע את שלבים 1.2 – 1.8 בצלחת 6-באר.</li>
	<li>לשטוף את התאים בקצרה עם 1 מ ל של DPBS (מלוחים פוספט באגירה של דולבקו)</li>
	<li>עבור קיבעון, להכין פתרון טרי של 4% פאראפורמלדהיד (בתחתית) פתרון (מדולל ב-DPBS). כדי לתקן תאים, להוסיף 2 מ"ל 4% בכיוון השני של DPBS לכל טוב. דגירה את התאים 20 דקות בטמפרטורת החדר. הערה: יש לבצע את כל השלבים הבאים באמצעות השימוש בה, במכסה של בטיחות מעבדה ולעשות זאת כראוי.</li>
	<li>לשטוף את התאים קבוע 3x ב 1 mL DPBS בזמן הצלחת, 5 דקות כל כביסה.</li>
	<li>כדי לחלחל תאים, מודטת עבור 15 דקות עם 0.1% טריטון X-100 ב DPBS</li>
	<li>לשטוף את התאים 3x ב 1 mL DPBS בזמן לשאת את הצלחת, 5 דקות כל לשטוף</li>
	<li>דגירה את התאים עם 500 μL של 0.1 M גליצין-HCL (pH 2.0) עבור 10 s, ולאחר מכן לנטרל pH מיד עם 500 μL של 10x מאגר פרוטאז הסומו (SPB).</li>
	<li>לשטוף את התאים 3x ב 1 mL DPBS בזמן להפלטה, 5 דקות כל שטיפת</li>
	<li>הסר את הכיסויים מבאר ומניחים אותם בתא לחות. ואז להמשיך עם incubations על שמיכות כדלקמן:<ol>
<li>עבור UTAG-fl כתמים בלבד: מערבבים 1 μg UTAG-fl עם 100 μL של 1x SPB המכיל 5 מ"מ TCEP בצינור, פיפטה את התערובת על התאים על הכיסויים, ו דגירה בטמפרטורת החדר עבור 1 h בחדר הלחות.</li>
		<li>באופן אופציונלי, עבור UTAG-FL ו anti SUMO1 נוגדן שיתוף כתמים, להמשיך עם הבאים:<ol>
<li>מערבבים בצינור 1 μg UTAG-FL ו 0.5 μL SUMO2/3 8A2 (שהתקבל למחקרים התפתחותיים יפידים Bank9) עם 100 μl של חסימת מאגר, פיפטה את התערובת על הכיסויים, ו דגירה בטמפרטורת החדר עבור 1 h.</li>
			<li>לשטוף את התאים על שמיכות 3 פעמים עם 200 μL DPBS, 5 דקות כל כביסה.</li>
			<li>מערבבים צינור 0.5 μL נגד העכבר אלקסה Fluor 488 נוגדן מצובית עם 100 μL חסימת מאגר, פיפטה את התערובת על הכיסויים, ו דגירה בטמפרטורת החדר עבור 1 h.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>כדי לשטוף כיסוי, פיפטה 200 μL DPBS על כל שמיכות ולעזוב במקום 10 דקות. חזור על השטיפה עוד פעמיים.</li>
	<li>הסר שקופית מתוך השטיפה האחרונה והפוך אותה לשקופית מיקרוסקופ מוקדמת עם טיפה של הרכבה בינונית (ראה טבלת חומרים).</li>
	<li>חנות לילה במקפיא של 20 ° c לפני הצפייה מתחת למיקרוסקופ. המחש באמצעות ערכות הסינון המתאימות ל-DAPI (DNA), טקסס רד (kmUTAG-fl), ואלקסה Fluor 488 (אם מבוצעת SUMO2/3 כתמים אופציונליים).</li>
</ol>2. זיהוי סומו בגונדות מנותדה קבוע באמצעות UTAG-fl
<ol><li>העבר המאלף מבוגרים ל-droplet של 8 μL של מאגר ביצים14 בשקופית שטעונה בתוספת שהיתה מצופה בפולי-ל-ליזין. שחררו גונדות מן התולעים באמצעות 27.5 G מחטים. המשיכו עם תיוג או הדבקת נוגדן או תיוג UTAG-fl.</li>
	<li>עבור דגימות נוגדנים לתיוג, המשך כדלקמן:<ol>
<li>הקפאת הקראק דגימות בחנקן נוזלי ולאחר מכן לתקן לילה ב-20 ° c מתנול בצנצנת Coplin.</li>
		<li>גם בצנצנות Coplin, לשטוף שקופיות 3 פעמים ב-1x PBS, ואז לחסום עבור 20 דקות ב-PBS המכיל 0.5% BSA ו 0.1% רצף 20.</li>
		<li>הוסף 30 μL של נוגדן 6F2 אנטי סומו (1:10) לכל שקופית המכסה את הדגימות. המלון משלב בין לילה בחדר לחות ב -4 ° c. הערה: סומו 6F2 התקבל ממחקרים התפתחותיים יפידים בנק15.</li>
		<li>בצנצנות Coplin, לשטוף שקופיות עבור 2 דקות ב-1x PBS, לאחר מכן לכסות דגימות מודלחות עם 30 μL של DyLight 488 עז אנטי עכבר משני נוגדן (1:200) עבור 1.5 שעות בתא לחות בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>בצנצנות של Coplin, לשטוף שקופיות עבור 2 דקות ב-1x PBS, לבצע טבילה מהירה ב-dH20 ולאחר מכן לטעון את השקופיות עם הרכבה בינונית (ראה טבלת חומרים).</li>
	</ol>
</li>
	<li>עבור תיוג KmUTAG-fl, המשך עם הפרטים הבאים:<ol>
<li>כדי לתקן תאים, להוסיף נפח 1 של 8% PF לדגימות עבור ריכוז סופי של 4% PF. תקן עבור 10 דקות בחדר לחות ולאחר מכן להרוות את התגובה על ידי העברת שקופיות צנצנת Coplin המכילה 1x PBS עם 0.1 M גליצין לפחות 5 דקות.</li>
		<li>בצנצנות Coplin, לשטוף את התאים 5 דקות ב-1x PBS, ולאחר מכן לחלחל את הדגימות ב-1x PBS המכיל 0.1% טריטון-X עבור 10 דקות.</li>
		<li>לשטוף בצנצנת Coplin עבור לפחות 5 דקות ב-1x PBS, ואז להוסיף 200 μL של 0.1 M גליצין-HCl (pH = 2.0) לדגימות על השקופית במשך 10 שניות. מיד להוסיף 200 μL של 10x SPB לנטרל את ה-pH.</li>
		<li>שטוף את השקופית ב-1x PBS בצנצנת של Coplin עבור 5 דקות.</li>
		<li>הסרת שקופית מכביסה ופיפטה 100 μl של 1x spb + 5mm tcep המכיל 2 μg של utag-fl ל-נמטודות על השקופיות, ו-דגירה בחדר לחות עבור 1 h ללא נדנדה.</li>
		<li>החזר את השקופית לצנצנת הקופלין ושטוף 15 דקות ב-1x PBS</li>
		<li>הסר את השקופית מהשטיפה, השתמש בניגוב מעבדה כדי להתייבש מסביב למדגם, ולאחר מכן הבהר את השקופיות עם 5 μL של הרכבה בינונית (ראה טבלת חומרים). אחסן את השקופיות ב-4 ° c. להמחיש באמצעות ערכות מסנן המתאים DAPI (DNA), טקסס אדום (kmUTAG-fl), ו DyLight 488 (SUMO2/3).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Kerscher, O., Felberbaum, R., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+of+proteins+by+ubiquitin+and+ubiquitin-like+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Modification of proteins by ubiquitin and ubiquitin-like proteins.</a> Cell and Developmental Biology. 22, 159-180 (2006).</li>
<li>Kerscher, O. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKerscher%2C+O+%22SUMOylation%22">SUMOylation</a>. , John Wiley & Sons, Ltd. Chichester. 1-11 (2016).</li>
<li>Hay, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUMO%3A+a+history+of+modification%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">SUMO: a history of modification.</a> Molecular Cell. 18 (1), 1-12 (2005).</li>
<li>Fu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+SUMO-specific+protease+2+induces+mitochondria+mediated+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Disruption of SUMO-specific protease 2 induces mitochondria mediated neurodegeneration.</a> PLoS Genetics. 10 (10), e1004579-e1004579 (2014).</li>
<li>Zhang, H., Kuai, X., Ji, Z., Li, Z., Shi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Over-expression+of+small+ubiquitin-related+modifier-1+and+sumoylated+p53+in+colon+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+biochemistry+and+biophysics%22%5BJournal%5D)">Over-expression of small ubiquitin-related modifier-1 and sumoylated p53 in colon cancer.</a> Cell biochemistry and biophysics. 67 (3), 1081-1087 (2013).</li>
<li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUMO-specific+protease+1+promotes+prostate+cancer+progression+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">SUMO-specific protease 1 promotes prostate cancer progression and metastasis.</a> Oncogene. 32 (19), 2493-2498 (2013).</li>
<li>Karami, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+SUMO-Protease+SENP7S+Regulates+%CE%B2-catenin+Signaling+and+Mammary+Epithelial+Cell+Transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Novel SUMO-Protease SENP7S Regulates β-catenin Signaling and Mammary Epithelial Cell Transformation.</a> Scientific Reports. 7 (1), 46477(2017).</li>
<li>Pelisch, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+SUMO-Dependent+Protein+Network+Regulates+Chromosome+Congression+during+Oocyte+Meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">A SUMO-Dependent Protein Network Regulates Chromosome Congression during Oocyte Meiosis.</a> Molecular Cell. 65 (1), 66-77 (2017).</li>
<li>Zhang, X. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUMO-2%2F3+modification+and+binding+regulate+the+association+of+CENP-E+with+kinetochores+and+progression+through+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">SUMO-2/3 modification and binding regulate the association of CENP-E with kinetochores and progression through mitosis.</a> Molecular Cell. 29 (6), 729-741 (2008).</li>
<li>Baker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproducibility+crisis%3A+Blame+it+on+the+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+News%22%5BJournal%5D)">Reproducibility crisis: Blame it on the antibodies.</a> Nature News. 521 (7552), 274-276 (2015).</li>
<li>Wang, Z., Prelich, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quality+control+of+a+transcriptional+regulator+by+SUMO-targeted+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Quality control of a transcriptional regulator by SUMO-targeted degradation.</a> Molecular and Cellular Biology. 29 (7), 1694-1706 (2009).</li>
<li>Li, S. J., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+protease+required+for+cell-cycle+progression+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A new protease required for cell-cycle progression in yeast.</a> Nature. 398 (6724), 246-251 (1999).</li>
<li>Peek, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUMO+targeting+of+a+stress-tolerant+Ulp1+SUMO+protease%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">SUMO targeting of a stress-tolerant Ulp1 SUMO protease.</a> PLoS ONE. 13 (1), e0191391(2018).</li>
<li>Edgar, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+13+Blastomere+Culture+and+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Chapter 13 Blastomere Culture and Analysis.</a> Methods in Cell Biology. 48, 303-321 (1995).</li>
<li>Pelisch, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+SUMO+modification+regulates+mitotic+chromosome+assembly+and+cell+cycle+progression+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Dynamic SUMO modification regulates mitotic chromosome assembly and cell cycle progression in Caenorhabditis elegans.</a> Nature Communications. 5 (1), 769(2014).</li>
<li>Dillingham, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+single-stranded+DNA+binding+protein+as+a+probe+for+sensitive%2C+real-time+assays+of+helicase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Fluorescent single-stranded DNA binding protein as a probe for sensitive, real-time assays of helicase activity.</a> Biophysical Journal. 95 (7), 3330-3339 (2008).</li>
<li>Ruckman, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2%27-Fluoropyrimidine+RNA-based+aptamers+to+the+165-amino+acid+form+of+vascular+endothelial+growth+factor+%28VEGF165%29.+Inhibition+of+receptor+binding+and+VEGF-induced+vascular+permeability+through+interactions+requiring+the+exon+7-encoded+domain%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">2'-Fluoropyrimidine RNA-based aptamers to the 165-amino acid form of vascular endothelial growth factor (VEGF165). Inhibition of receptor binding and VEGF-induced vascular permeability through interactions requiring the exon 7-encoded domain.</a> The Journal of Biological Chemistry. 273 (32), 20556-20567 (1998).</li>
<li>Hughes, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+specific+inhibitors+of+SUMO-1-+and+SUMO-2%2F3-mediated+protein-protein+interactions+using+Affimer+%28Adhiron%29+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">Generation of specific inhibitors of SUMO-1- and SUMO-2/3-mediated protein-protein interactions using Affimer (Adhiron) technology.</a> Science Signaling. 10 (505), eaaj2005(2017).</li>
<li>Lopata, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Affimer+proteins+for+F-actin%3A+novel+affinity+reagents+that+label+F-actin+in+live+and+fixed+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Affimer proteins for F-actin: novel affinity reagents that label F-actin in live and fixed cells.</a> Scientific Reports. 8 (1), 6572(2018).</li>
<li>Gilbreth, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isoform-specific+monobody+inhibitors+of+small+ubiquitin-related+modifiers+engineered+using+structure-guided+library+design%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Isoform-specific monobody inhibitors of small ubiquitin-related modifiers engineered using structure-guided library design.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (19), 7751-7756 (2011).</li>
<li>Berndt, A., Wilkinson, K. A., Heimann, M. J., Bishop, P., Henley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+characterization+of+the+properties+of+SUMO1-specific+monobodies%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">In vivo characterization of the properties of SUMO1-specific monobodies.</a> Biochemical Journal. 456 (3), 385-395 (2013).</li>
</ol>

רקומביננטי kmUTAG ריאגנטים מסופקים לקהילת המחקר דרך Kerafast.com.

כאן אנו מציגים את השימוש של kmutag-fl, חלבון רקומביננטי, למחקרים פונקציונליים של סומו בתאי יונקים קבועים ובעל בלוטות המין נמטודות. KmUTAG-fl הוא מאוד עמידים ללחץ הפאן-סומו מגיב ספציפי מזהה ומלכודות מקורי סומו מצועם ושרשראות סומו. מאז המבנה השלישוני של סומו הוא שימור מאוד זה סביר מאוד כי משתנים סומו ממודל נוסף מערכות שאינן מודל ניתן לנתח עם מגיב kmUTAG-fl. בתור שכזה, KmUTAG-fl עשוי לייצג חלופה שימושית או משנית עבור פרוטוקולי נוגדנים מסורתיים מכתים.
יש תקדים מספיק לשימוש בחלופות שאינן נוגדנים, כ...

מטרת שיטה זו היא להקל על המחקר והניתוח של חלבונים סומו מצובגים באמצעות רקומביננטי הסומו השמנה UTAG (Ulp בתחום תג) חלבון. כפי שמפורט להלן, UTAG ניתן להשתמש במקום של ריאגנטים אחרים וגישות לטהר, לזהות, ולדמיין חלבונים ששונו סומו. בהתאם לתנאי הגדילה, תאים עשויים להכיל מאות או אלפי חלבונים שהשתנו עם שרשראות סומו או סומו (לסקירה ראה קרשר ואח ' 20061 ו kerscher 20162). זה מייצג קושי ניכר עבור ניתוחים פונקציונליים של חלבונים ספציפיים ששונו הסומו, במיוחד מאז רק חלק של היעד מסוים sumoylation שונה למעשה3. בנוסף לתפקידם בתהליכים סלולאריים חיוניים כגון רגולציה, הומאוסטזיס חלבון, התגובה למתח הסלולר, ושיפוץ כרומטין במהלך מיטוזיס ומיוזיס; עכשיו זה הופך מספיק ברור כי סומו, סומו שונה חלבונים, ורכיבים מסלול סומו יש גם פוטנציאל של ביואריקרס לפתווגיות כגון סרטן והפרעות ניווניות4,5,6 ,7. זה מדגיש את הצורך חזק, אמין, כלים זמינים וגישות חדשניות עבור זיהוי וניתוח פונקציונלי של חלבונים ששונו סומו במגוון של תאים ודגימות.
במערכות רבות, נוגדנים ספציפיים סומו הם ריאגנטים של בחירה עבור איתור, בידוד וניתוחים פונקציונליים של חלבונים ששונו סומו8,9. עם זאת, כמה נוגדנים מסחריים ספציפיים סומו מסוימים הם יקרים, מוגבל בכמות או זמינות, נוטה להציג משתנה בפראות משתנים ופעילות צולבת, ובמקרים מסוימים חוסר התוכנות10. גישה חלופית אחת היא הביטוי של אפירופה-מתויג סומו בתאים ואורגניזמים שעברו שינוי, אך הקישור תגי אפירופה לסומו עשוי באופן מלאכותי להקטין את הקוניוגציה למטרות חלבונים11. בנוסף, האפיסקופים אינם שימושיים כאשר מוערכים תאים או רקמות שאינם משתנים.
Ulp1 הוא פרוטאז סומו שימור מ -S. cerevisiae ס כי שני התהליכים הקודמן סומו ו desumoylates סומו מצווים חלבונים12. פיתחנו את מגיב UTAG מבוסס על התבוננות קרי כי מוטציה של ציסטיין קטליטי (C580S) ב Ulp1's הסומו עיבוד Ulp domain (עוד) לא רק מונע מחשוף סומו אלא גם מלכודות סומו-מצועם חלבונים עם גבוה ובכן12. למען הפשטות, התייחסנו לUlp1 האלה להשמנה של סומו מסופים, בדומה ל-UTAG (קיצור של UD TAG). UTAG הוא חלבון רקומביננטי פאן-סומו השמנה המייצגת חלופה שימושית לנוגדנים אנטי סומו המשמשים לבידוד ואיתור של חלבונים ששונו סומו. וחשוב מכך, הוא מזהה באופן מקורי-מקופל, סומו מצופלת ולא רק אפיסקופים אחד או מספר על סומו. כדי לשפר הן את יציבות החלבון ואת חוזק כריכת סומו של UTAG, יצרנו גרסה של UTAG מן הלחץ עמידים שמרים Kluyveromyces marxianus (ק מ). KmUTAG נקשר בחוזקה סומו-מבצוערים עם זיקה nanomolar13. בנוסף, kmUTAG עמיד בטמפרטורות גבוהות (42 ° c), הפחתת סוכנים (5 מ"מ TCEP-טריס (2-carboxyethyl) פוספלין הידרוכללוריד), denaturants (עד 2 שתנן), סוכני אוקסיגון (0.6% תחמוצת מימן), וחומרי ניקוי לא יוניים. סובלנות זו מועילה במהלך מצב טיהור קשה וזמני דגירה ממושכים, ומבטיחים את היציבות ופעילות ההשמנה של הסומו. לא באופן מפתיע, עם זאת, הפעילות לכידת סומו של KmUTAG אינו תואם את cysteine שינוי ריאגנטים, חומרי ניקוי יוניים ותמציות חלבון מלאה. האהדה והתכונות היוצאות מהכלל של KmUTAG מעידות על כך שניתן להפוך את הדבר לחלק מהרפרטואר הסטנדרטי לחקר חלבונים מסוחיים במינים מרובים.
כאן אנו מספקים שיטה פשוטה כדי לזהות חלבונים ששונו הסומו בתאי היונקים והנטודות באמצעות רקומביננטי פלורסנט mCherry-KmUTAG פיוז'ן חלבון (kmUTAG-fl).

<table><tbody><tr><td>16% פרפורמלדהיד (פורמלדהיד) תמיסה מימית</td><td>מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית</td><td>30525-89-4</td><td></td></tr><tr><td>צלחות תרבית תאים 6 בארות</td><td>Genesee Scientific/Olympus Plastics</td><td>25-105</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)</td> <td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-545-003</td><td>משמש כנוגדנים משניים לנוגדנים חד-שבטיים של עכבר</td></tr><tr><td>DPBS, ללא סידן, לא מגנזיום</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>Gibco 14190144</td><td></td></tr><tr><td>Dylight 488 מצומד AffiniPure Goat Anti-Moue IgG (H+L)</td> <td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-485-146</td><td>משמש כנוגדנים משניים לנוגדנים חד שבטיים של עכבר</td></tr><tr><td>Fisherbrand Coverglass למשקפיים לכיסוי צמיחה</td><td>Fisherbrand</td><td>12545101</td><td></td></tr><tr><td>FLUORO-GEL II עם DAPI Electron</td><td>Microscopy Sciences</td><td>50-246-93)</td><td>מדיית הרכבה בשלב 1.11</td></tr><tr><td>FLUORO-GEL עם DABCO</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>17985-02</td><td>עם DAPI נוסף ל-1 ומיקרו; גרם/מ"ל; מדיית הרכבה בשלב 2.2.5</td></tr><tr><td>Glycine-HCl</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP3815</td><td></td></tr><tr><td>Glycine-HCl</td><td>ACROS Organics</td><td>6000-43-7</td><td></td></tr><tr><td>KmUTAG-fl</td><td>ריאגנטים Kerafast</td><td></td><td>KmUTAG זמינים ב-Kerafast.com</td></tr><tr><td>Oneblock Western-CL חוסם מאגר</td><td>פרומתאוס</td><td>20-313</td><td></td></tr><tr><td>PBS, מי מלח חוצץ פוספט, 10X Solution</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP3994</td><td></td></tr><tr><td>PNT2 קו תאים</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>95012613</td><td>אפיתל ערמונית רגיל אימורטליזציה עם SV40.</td></tr><tr><td>pSPOT1</td> <td>(ChromoTek GmbH)</td> <td>ev-1</td><td>https://www.chromotek.com/fileadmin/user_upload/pdfs/Datasheets/pSpot1_v1.pdf</td></tr><tr><td>SUMO 6F2</td><td>DSHB</td><td>SUMO 6F2 SUMO</td><td>6F2 הופקד ל- DSHB על ידי Pelisch, F. / Hay, R.T. (DSHB Hybridoma Product SUMO 6F2)</td></tr> <tr><td>מאגר פרוטאז SUMO [10x]</td><td></td><td></td> <td>500 מ"מ Tris-HCl, pH 8.0, 2% NP-40, 1.5 M NaCl</td></tr><tr><td>SUMO-2 נוגדן 8A2</td><td>DSHB</td><td>SUMO-2 8A2</td><td>SUMO-2 8A2 הופקד ב-DSHB על ידי Matunis, M. (DSHB Hybridoma Product SUMO-2 8A2)</td></tr><tr><td>TCEP-HCL</td><td>GoldBio</td><td>51805-45-9</td><td>משמש כחומר הפחתה בריכוז של 5mM</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher BioReagents</td><td>9002-93-1</td><td>משמש לחדירה ב-0.1% ב-DPBS/PBS (לתולעים)</td></tr></tbody></table>

לוקליזציה של חלבונים ששונו באמצעות סומו פלורסנט-השמנה חלבונים

Localization of SUMO-modified Proteins Using Fluorescent Sumo-trapping Proteins

כאן אנו מציגים שיטה מקורית לחקר הסורחון של חלבונים ולוקליזציה התת-תאית שלהם בתאי היונקים והנוציטים. שיטה זו מנצלת רקומביננטי שונה חלבון השמנה משבר, kmUTAG, נגזר פרוטאז Ulp1 סומו של הלחץ עמידים שמרים הmarxianus. התאמתי את המאפיינים של kmUTAG למטרת לימוד סומולציה במגוון מערכות מודל ללא שימוש בנוגדנים. למחקר של סומו, KmUTAG יש כמה יתרונות כאשר לעומת הגישות מבוססות נוגדן. זה מאוד עמידים להשמנה סומו השמנה מופק recombinantly, הוא מזהה איזופורמים מקורי של מינים רבים, ובניגוד נוגדנים זמין מסחרית זה מראה זיקה מופחתת עבור סומו בחינם, מצומת. תוצאות הנציגה המוצגות כאן כוללות לוקליזציה של שערי מעלה סומו בתאי תרבות של רקמת היונקים ו נמטודות אוציטים.

KmUTAG-fl הוא רקומביננטי, החלבון מתויג להשמנה סומו. כדי לייצר kmUTAG-fl, שירמנו מיטוב codon ממוטבת-kmUTAG לתוך הpSPOT1 בקטריאלי בקטריות ביטואמצע (איור 1). לאחר האינדוקציה, החלבון kmUTAG-fl היה מטוהר במלכודת ספוט, שהוקפא והוקפא עד לשימוש נוסף. כדי להבטיח את הפעילות לכידת סומו של KmUTAG-fl, אנו אישר את הכריכה ל SUMO1-מצושל חרוזים ומשקעים של חלבון היתוך החתול סומו (נתונים לא מוצגים, אבל לראות את העבודה הקודמת13).
<p class="jove_conten...

סומו הוא הכרחי ושמרו במידה רבה, חלבון שימור קטן כמו הצירוף. בפרוטוקול זה אנו מתארים את השימוש רקומביננטי העמידות בפני סומו חלבון השמנה להשמנה (kmUTAG) כדי להמחיש מקורי, שערי סומו לא מתויגים ולוקליזציה שלהם במגוון סוגי תאים.

Here we are presenting a novel method to study the sumoylation of proteins and their sub-cellular localization in mammalian cells and nematode oocytes. ...

המשמעות של פרוטוקול זה היא השימוש בחלבון UTAG פלואורסצנטי חדשני לוכדת SUMO לגילוי של מכפיל החלבון SUMO בתאים אוקריוטיים שונים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא פרוטוקול פשוט לגילוי ללא נוגדנים של SUMO במגוון תאים, כולל תרבות רקמת יונקים וגונדס נמטודה. SUMO ממלא תפקידים חשובים בסרטן ובהפרעות ניווניות, וזה מדגיש את הצורך בכלים חזקים ואמינים לגילוי וניתוח תפקודי של חלבונים ששונו על ידי SUMO.מכיוון ש-SUMO שמור מאוד, ניתן להשתמש בחלבון UTAG לוכד הסומו הפלואורסצנטי כדי לסמן סומו נדוש באורגניזמים רבים ושונים. סרטון זה מדגים את השימוש בו בתאי יונקים. בנוסף, הטקסט המלא מתאר את השימוש בו בוציטים nematode.ההדגמה החזותית של טכניקה זו מספקת רמזים קריטיים לטיפול בתאים לפני הכתמות וזיהוי SUMO. כדי להתחיל, לגדל תאים תרבות רקמות של בחירה על 22 מילימטר עגול כיסוי מחליק שש בארות TC צלחות עד 70 עד 80% confluent. לשטוף את התאים לזמן קצר עם מיליליטר אחד של DPBS.כדי לתקן את התאים, הוסף שני מיליליטר של 4%PFA ו- DPBS טריים לכל באר. דגירה התאים במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. לשטוף את התאים הקבועים שלוש פעמים במשך חמש דקות במיליליטר אחד של DPBS תוך כדי אגוזים את הצלחת.כדי לחלחל לתאים, דגירה במשך 15 דקות עם 1%Triton X-100 ב- DPBS. לשטוף את התאים שוב, כמו קודם. הדגירה את התאים עם 500 microliters של 1 טוחן גליצין HCL pH 2 במשך 10 שניות.לאחר מכן לנטרל את ה- pH מיד עם 500 microliters של מאגר פרוטאז סומו 10X, או SPB. לאחר שטיפת התאים כמו קודם, להסיר את החלקות המכסה מן הטוב ולמקם אותם בתא לחות. עבור כתמי UTAG-FL בלבד, יש לערבב מיקרוגרם אחד של UTAG-FL עם 100 מיקרוליטרים של 1X SPB המכילים 5 מילימולרים TCEP בצינור.לאחר מכן, פיפטה לערבב על התאים על להחליק את הכיסוי דגירה בטמפרטורת החדר במשך שעה בתא הלחות. כדי לשטוף את החלקות הכיסוי, פיפטה 200 microliters של DPBS על כל להחליק כיסוי ולהשאיר במקום במשך 10 דקות. חזור על לשטוף פעמיים נוספות.הסר את החלקות המכסה מהכביסה האחרונה והתהפך על מגלשת מיקרוסקופיה מנוקה מראש עם טיפת מדיום הרכבה. לאחסן את הדגימות לילה במקפיא 20 מעלות צלזיוס לפני הצפייה מתחת למיקרוסקופ. הצג את התאים באופן חזותי באמצעות ערכות המסננים המתאימות עבור DAPI ו- Texas Red.נא עיין בטקסט המלא לקבלת פרוטוקול על אופן התיוג של SUMO וגונדו נמטודה קבוע. בעוד תיוג תאים יונקים הוא די פשוט, תיוג oocytes nematode דורש הכשרה מוקדמת ניתוחי גונד. KmUTAG-FL עם תאי PMT2 קבועים הראו כתמים גרעיניים ברורים.הן כתמים גרעיניים מפוזרים והן מוקדים גרעיניים ברורים נראו לעין. לוקליזציה גרעינית אושרה באמצעות כתם שותף עם DAPI. בהתאם לפעילות לכידת SUMO של KmUTAG-FL, דפוס לוקליזציה גרעינית היה מזכיר הכתמת SUMO23.כתמים שותפים בנוגדן נגד SUMO23 8A2 אישרו את ההתאמה של ה-KmUTAG-FL עם אות SUMO23. פעולה זו מאמתת את היעילות של KmUTAG-FL כדי לזהות SUMO23 בתאי יונקים. גונדות מבודדות מהרמפרודיט למבוגרים המייצרות בוציטים.נמטודות אלגנס סומנו בנוגדנים נגד סומו. בקנה אחד עם דיווחים קודמים, נוגדן נגד SUMO בתחילה מקומי לפלסמה הגרעינית של אוציטים פרופאזה מיוטי מאוחר. לאחר מכן הוא הופץ מחדש למתחם הטבעת המרכזי של ההומולוגים הזוגיים כאשר המעטפה הגרעינית התקלקלה והכרומוזומים נעו לכיוון צלחת המטה-פאזה.בהכנות מקבילות, גונאדים שכותרתו עם KmUTAG-FL חשפו דפוסים דומים. KmUTAG-FL עבר מתווית הגרעין להתרכז במתחם הטבעת כאשר oocytes החל והשלים את תהליך פירוק המעטפה הגרעינית. תוצאות אלה מאמתות KmUTAG-FL ככלי שימושי לניתוח של מיוזיס ותהליכים הקשורים SUMO ב- c.אלגנס ואולי נמטודות אחרות. בעת ביצוע קיבעון, זה קריטי להשתמש paraformaldehyde טרי זמן קיבוע קצר כדי לשמור על SUMO מקופל באופן מקורי, כך שהוא יכול להיות מוכר על ידי KmUTAG. מכיוון שהמבנה שליו של SUMO שמור מאוד, סביר מאוד כי גרסאות SUMO ממודלים נוספים ומערכות שאינן מודל ניתן לנתח עם ריאגנט KmUTAG-FL.נכון לעכשיו, אנו משתמשים בחלבון UTAG פלואורסצנטי חדשני זה כדי לחקור את הפונקציה של SUMO במהלך הלחץ התאי. לבסוף, שים לב כי כל השלבים באמצעות paraformaldehyde תיקון צריך להתבצע מכסה המנוע בטיחות במעבדה ואת זה reagent יש להיפטר כראוי.

localization-sumo-modified-proteins-using-fluorescent-sumo-trapping

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

Snap-תג קליפ תג תיוג מערכות חלבון לאפשר את הקובץ המצורף ספציפי, קוולנטי של מולקולות, כולל צבעי ניאון, לחלבון עניין בתאים חיים. משובטים לאחר והביע, החלבון מתויג ניתן להשתמש עם מגוון מצעים עבור יישומים רבים במורד הזרם מבלי שיבוט שוב.

תיוג פלורסנט של COS-7-SNAP הבעת תג חלבונים Fusion עבור דימות תא חי

סרטון זה מדגים את שיטת in vitro עבור SUMOylation של חלבוני סובסטרט באמצעות מפל אנזימים רציף. יתר על כן, מצב SUMOylated של החלבון מזוהה באמצעות אלקטרופורזה וטכניקת immunoblotting.

בדיקת SUMOylation: טכניקה במבחנה לזיהוי מצב SUMOylation של חלבוני סובסטרט על ידי immunoblotting

כאן אנו מתארים את המכשור ושיטות לגילוי מולקולות חלבון בודד fluorescently שכותרתו אינטראקציה עם מולקולת DNA חד התלויה בין שני microspheres הלכוד אופטי.

שילוב מניפולציה מולקולה בודדת והדמיה לחקר אינטראקציות החלבון-DNA

כתב יד זה מתאר את הגילוי של sumoylation וubiquitination של חלבוני קינטוכור, Ndc10 וNdc80, בcerevisiae Saccharomyces שמרי ניצנים.

טכניקת טיהור חלבון המאפשרת איתור של Sumoylation וUbiquitination של שמרים להנץ החלבונים קינטוכור Ndc10 וNdc80

כתב יד זה מתאר שיטה כדי להמחיש ולכמת תרגום לשפות אחרות אירועים בתאים subcellular. הגישה המוצעת כתב יד זה דורש מערכת הדמיה קונאפוקלית בסיסית, ריאגנטים, והוא מהיר וחסכוני.

Immunofluorescence כמותי מודדים הגלובלי לשפות אחרות תרגום

ההתאמה המדויקת של תושבים גולג'י חיוני להבנת פונקציות הסלולר של גולג'י. עם זאת, מיקרוסקופ אופטי קונבנציונאלי אין אפשרות לפענח את מבנה תת-גולג'י. כאן נתאר את פרוטוקול שיטה סופר-רזולוציה מיקרוסקופיה קונבנציונאלי המבוסס באופן כמותי לקבוע לוקליזציה תת-גולג'י של חלבון.

לוקליזציה כמותית של חלבון גולג'י על ידי הדמיה המסה מרכז של זריחה

חלבונים משפחתי קטן הקשורות אוביקוויטין צירוף (סומו) הם מצומדת ל ליזין שאריות לחלבונים היעד כדי לווסת תהליכים תאיים שונים. מאמר זה מתאר פרוטוקול איתור רטינובלסטומה (Rb) חלבון SUMOylation בתנאים אנדוגני, אקסוגני בתאים אנושיים.

אין ויוו זיהוי וניתוח של SUMOylation חלבון Rb בתאי אדם

בניגוד ligases אוביקוויטין, זוהו מספר ligases סומו E3. ששונה זה במבחנה SUMOylation פרוטוקול הוא מסוגל לזהות ligases סומו E3 הרומן מאת assay שיחזור במבחנה .

במבחנה SUMOylation Assay ללמוד סומו E3 ליגאז פעילות

כאן, אנו מציגים עבור צבע רב לוקליזציה של חלבוני ממברנה בודדת פרוטוקול organelles של תאים חיים. כדי לצרף fluorophores, משמשים החלבונים תיוג עצמי. חלבונים, במיקום שונה ממברנות תאי האברון המשמש אותו, יכול להיות מקומי עם דיוק של ~ 18 ננומטר.

צבע רב לוקליזציה מיקרוסקופיה של חלבוני ממברנה בודדת ב- Organelles של תאים בתרבית של חיים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להעשיר, לבודד, לזהות, ולאפיין חלבונים ששונו על-ידי סומו ב vivo הן של תאי hepatoma אנושיים וגידולים בכבד שהתקבלו מדגמי העכבר של קרצינומה hepatocתאיים באמצעות ישויות כריכת סומו (SUBEs).

מחייב סומו ישויות (SUBEs) ככלים עבור העשרה, בידוד, זיהוי, ואפיון של פרוטאום סומו בסרטן הכבד

אנו מציגים כאן הליך למדידת אוליגומרים של חלבונים וצבירה בתאים ליזלתיים ותאים חיים באמצעות ספקטרוסקופיית מתאם פלואורסצנטיות.

איתור צבירת חלבונים באמצעות ספקטרוסקופיית מתאם פלואורסצנטי

למד זיהוי חלבוני SUMO ששונו באמצעות kmUTAG פלורסנטי בתרביות תאים יונקים ובשחלות נמטודות. שיטה זו מאפשרת ויזואליזציה ללא נוגדנים לחקר תפקיד SUMO בסרטן ובמחלות נוירודגנרטיביות.

לוקליזציה של חלבונים ששונו באמצעות סומו פלורסנט-השמנה חלבונים

גלה סרטונים נוספים