לוקליזציה של חלבונים ששונו באמצעות סומו פלורסנט-השמנה חלבונים
27 באפריל 2019
סומו הוא הכרחי ושמרו במידה רבה, חלבון שימור קטן כמו הצירוף. בפרוטוקול זה אנו מתארים את השימוש רקומביננטי העמידות בפני סומו חלבון השמנה להשמנה (kmUTAG) כדי להמחיש מקורי, שערי סומו לא מתויגים ולוקליזציה שלהם במגוון סוגי תאים.
המשמעות של פרוטוקול זה היא השימוש בחלבון UTAG פלואורסצנטי חדשני לוכדת SUMO לגילוי של מכפיל החלבון SUMO בתאים אוקריוטיים שונים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא פרוטוקול פשוט לגילוי ללא נוגדנים של SUMO במגוון תאים, כולל תרבות רקמת יונקים וגונדס נמטודה. SUMO ממלא תפקידים חשובים בסרטן ובהפרעות ניווניות, וזה מדגיש את הצורך בכלים חזקים ואמינים לגילוי וניתוח תפקודי של חלבונים ששונו על ידי SUMO.
מכיוון ש-SUMO שמור מאוד, ניתן להשתמש בחלבון UTAG לוכד הסומו הפלואורסצנטי כדי לסמן סומו נדוש באורגניזמים רבים ושונים. סרטון זה מדגים את השימוש בו בתאי יונקים. בנוסף, הטקסט המלא מתאר את השימוש בו בוציטים nematode.
ההדגמה החזותית של טכניקה זו מספקת רמזים קריטיים לטיפול בתאים לפני הכתמות וזיהוי SUMO. כדי להתחיל, לגדל תאים תרבות רקמות של בחירה על 22 מילימטר עגול כיסוי מחליק שש בארות TC צלחות עד 70 עד 80% confluent. לשטוף את התאים לזמן קצר עם מיליליטר אחד של DPBS.
כדי לתקן את התאים, הוסף שני מיליליטר של 4%PFA ו- DPBS טריים לכל באר. דגירה התאים במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. לשטוף את התאים הקבועים שלוש פעמים במשך חמש דקות במיליליטר אחד של DPBS תוך כדי אגוזים את הצלחת.
כדי לחלחל לתאים, דגירה במשך 15 דקות עם 1%Triton X-100 ב- DPBS. לשטוף את התאים שוב, כמו קודם. הדגירה את התאים עם 500 microliters של 1 טוחן גליצין HCL pH 2 במשך 10 שניות.
לאחר מכן לנטרל את ה- pH מיד עם 500 microliters של מאגר פרוטאז סומו 10X, או SPB. לאחר שטיפת התאים כמו קודם, להסיר את החלקות המכסה מן הטוב ולמקם אותם בתא לחות. עבור כתמי UTAG-FL בלבד, יש לערבב מיקרוגרם אחד של UTAG-FL עם 100 מיקרוליטרים של 1X SPB המכילים 5 מילימולרים TCEP בצינור.
לאחר מכן, פיפטה לערבב על התאים על להחליק את הכיסוי דגירה בטמפרטורת החדר במשך שעה בתא הלחות. כדי לשטוף את החלקות הכיסוי, פיפטה 200 microliters של DPBS על כל להחליק כיסוי ולהשאיר במקום במשך 10 דקות. חזור על לשטוף פעמיים נוספות.
הסר את החלקות המכסה מהכביסה האחרונה והתהפך על מגלשת מיקרוסקופיה מנוקה מראש עם טיפת מדיום הרכבה. לאחסן את הדגימות לילה במקפיא 20 מעלות צלזיוס לפני הצפייה מתחת למיקרוסקופ. הצג את התאים באופן חזותי באמצעות ערכות המסננים המתאימות עבור DAPI ו- Texas Red.
נא עיין בטקסט המלא לקבלת פרוטוקול על אופן התיוג של SUMO וגונדו נמטודה קבוע. בעוד תיוג תאים יונקים הוא די פשוט, תיוג oocytes nematode דורש הכשרה מוקדמת ניתוחי גונד. KmUTAG-FL עם תאי PMT2 קבועים הראו כתמים גרעיניים ברורים.
הן כתמים גרעיניים מפוזרים והן מוקדים גרעיניים ברורים נראו לעין. לוקליזציה גרעינית אושרה באמצעות כתם שותף עם DAPI. בהתאם לפעילות לכידת SUMO של KmUTAG-FL, דפוס לוקליזציה גרעינית היה מזכיר הכתמת SUMO23.
כתמים שותפים בנוגדן נגד SUMO23 8A2 אישרו את ההתאמה של ה-KmUTAG-FL עם אות SUMO23. פעולה זו מאמתת את היעילות של KmUTAG-FL כדי לזהות SUMO23 בתאי יונקים. גונדות מבודדות מהרמפרודיט למבוגרים המייצרות בוציטים.
נמטודות אלגנס סומנו בנוגדנים נגד סומו. בקנה אחד עם דיווחים קודמים, נוגדן נגד SUMO בתחילה מקומי לפלסמה הגרעינית של אוציטים פרופאזה מיוטי מאוחר. לאחר מכן הוא הופץ מחדש למתחם הטבעת המרכזי של ההומולוגים הזוגיים כאשר המעטפה הגרעינית התקלקלה והכרומוזומים נעו לכיוון צלחת המטה-פאזה.
בהכנות מקבילות, גונאדים שכותרתו עם KmUTAG-FL חשפו דפוסים דומים. KmUTAG-FL עבר מתווית הגרעין להתרכז במתחם הטבעת כאשר oocytes החל והשלים את תהליך פירוק המעטפה הגרעינית. תוצאות אלה מאמתות KmUTAG-FL ככלי שימושי לניתוח של מיוזיס ותהליכים הקשורים SUMO ב- c.
אלגנס ואולי נמטודות אחרות. בעת ביצוע קיבעון, זה קריטי להשתמש paraformaldehyde טרי זמן קיבוע קצר כדי לשמור על SUMO מקופל באופן מקורי, כך שהוא יכול להיות מוכר על ידי KmUTAG. מכיוון שהמבנה שליו של SUMO שמור מאוד, סביר מאוד כי גרסאות SUMO ממודלים נוספים ומערכות שאינן מודל ניתן לנתח עם ריאגנט KmUTAG-FL.
נכון לעכשיו, אנו משתמשים בחלבון UTAG פלואורסצנטי חדשני זה כדי לחקור את הפונקציה של SUMO במהלך הלחץ התאי. לבסוף, שים לב כי כל השלבים באמצעות paraformaldehyde תיקון צריך להתבצע מכסה המנוע בטיחות במעבדה ואת זה reagent יש להיפטר כראוי.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מתאר את השימוש בחלבון פלואורסצנטי חדש ללכידת SUMO (kmUTAG) לצורך זיהוי של תצמידי SUMO בתאים איקריוטיים שונים. טכניקה זו מאפשרת ויזואליזציה של SUMO ללא שימוש בנוגדנים, דבר החיוני להבנת תפקידו בסרטן ובהפרעות נוירודגנרטיביות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- מודיפיקציה של חלבונים
רקע
- SUMO הוא חלבון מודיפיקטור קטן דמוי-יוביקוויטין השמור מאוד בין מינים שונים.
- הוא ממלא תפקידים משמעותיים בתהליכים תאיים שונים, כולל תגובה למעיקה ומיקום חלבונים.
- שיטות זיהוי אמינות של חלבונים שעברו מודיפיקציית SUMO חיוניות לניתוח פונקציונלי.
- פרוטוקול זה משתמש בחלבון לכידת-SUMO רקומביננטי כדי להדמיא את ה-SUMO בסוגים שונים של תאים.
מטרת המחקר
- מתן שיטה פשוטה לזיהוי תוצרי SUMO conjugates ללא שימוש בנוגדנים.
- הדגמת היישום של kmUTAG בתאים של יונקים וביציות של נמטודה.
- שיפור ההבנה של תפקידו של SUMO בבריאות ובמחלה.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- סימון פלואורסצנטי של SUMO באמצעות חלבון kmUTAG.
- ויזואליזציה של תצמידי SUMO בתרביות רקמה של יונקים.
- יישום של הטכניקה בשחלות של נמטודות.
- ניתוח של לוקליזציית SUMO בתאי איקריוטים שונים.
תוצאות עיקריות
- הדמיה מוצלחת של תצמידי SUMO בסוגי תאים שונים.
- הדגמה של יעילות ה-kmUTAG לזיהוי ללא נוגדנים.
- תובנות לגבי הלוקליזציה והתפקוד של חלבונים שעברו מודיפיקציית SUMO.
- יישומים פוטנציאליים בחקר תפקידו של SUMO בסרטן ובהסתלקות נוירודגנרטיבית.
מסקנות
- חלבון ה-kmUTAG הוא כלי בעל ערך לגילוי SUMO באורגניזמים שונים.
- שיטה זו מפשטת את חקר התפקודים הביולוגיים של SUMO.
- מחקרים עתידיים יכולים להשתמש בטכניקה זו כדי לחקור מסלולים הקשורים ל-SUMO בבריאות ובמחלה.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
זיהוי של מודיפיקציות SUMO ללא שימוש בנוגדנים מאפשר תיקוף איתור (target validation) חסון במערכות רלוונטיות למחלות, במיוחד בתוכניות למחלות אונקולוגיות וניוון עצבי שבהן SUMOylation משפיע על יציבות חלבונים ותפקודם. ריאגנט ה-kmUTAG מספק כלי רקומביננטי חוצה-מינים המפחית את השונות במבחנים ותומך בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי ויזואליזציה ישירה של קונג'וגטים אנדוגניים של SUMO בתאים חיים או מקובעים. גישה זו משפרת את הביטחון החזוי בשלבי הגילוי המוקדמים על ידי ביטול ארטיפקטים התלויים בנוגדנים ומאפשרת בחינה סטנדרטית של נתיב ה-SUMO במערכות מודל שונות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה ישירה של ויסות חלבונים תלוי-SUMO ללא הפרעה של נוגדנים, ובכך תומך בבדיקת היפותזות לגבי מטרות במודלים של סרטן ומחלות נוירודגנרטיביות.
- ערך תפעולי: ייצור רקומביננטי מבטיח עקביות בין מנות ויכולת הרחבה למסעות סריקה בעלת תפוקה גבוהה הדורשים קריאות של פעילות SUMO.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- ערך מדעי: מייצר קריאות פלואורסצנציה כמותיות של מצב הצמדת SUMO, מה שמאפשר סטנדרטיזציה של בדיקות לשינויים ב-SUMOylation המושרים על ידי תרכובות.
- ערך תפעולי: תואם לתהליכי מיקרוסקופיה וקיבוע סטנדרטיים, מה שמאפשר שילוב בפלטפורמות קיימות של בדיקות מבוססות תאים ללא צורך בציוד מיוחד.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מקל על מחקרי לוקליזציה של SUMO בין מינים שונים, מתאי תרייתים ועד לאוציטים של נמטודות, ובכך תומך בהתאמה של ביומרקרים תרגומיים במסלולי תגובה למעמס (stress-response) שמורים.
- ערך תפעולי: יעיל בהכנות של רקמה מקובעת, מה שמאפשר ניתוח רטרוספקטיבי של דינמיקת SUMO במודלים פרה-קליניים של מחלות.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
השיטה משתלבת בתהליכי גילוי מוקדמים שבהם מודולציה של מסלול ה-SUMO מהווה מנגנון פעולה, ומספקת תיקוף אורתוגונלי למחקרי הפרעה ביוכימיים או גנטיים של SUMO לפני אופטימיזציה של תרכובות מובילות.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בסריקה מונחית-השערה על ידי אישור צימוד SUMO למטרה (on-target) בתגובה למודולטורים של מסלולים או להשתקת גנים (genetic knockdowns).
- סריקה: מאפשר זיהוי בר-שחזור של היווצרות מוקדי SUMO כקריאה פנוטיפית במערכי סריקה בעלי תוכן גבוה (high-content screening).
- אנליטיקה: מספק נתונים כמותיים על לוקליזציה תת-תאית (גרעינית לעומת ציטופלזמית, דיפוזית לעומת מוקדית) שניתן להקרין לטיפול בתרכובות או לרקע גנטי.
- מחקר תרגומי: מדגים שימור של דפוסי תעבורת SUMO בין מינים, ובכך תומך בהכללה ממודלים של נמטודות למערכות יונקיים.
- שימוש חוזר ארגוני: ניתן לאגור kmUTAG-FL רקומביננטי ולשתף אותו בין מחלקות כריאגנט סטנדרטי לניטור מסלול ה-SUMO.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית תוצאות חיוביות שגויות בזיהוי SUMO על ידי מזעור הקישור ל-SUMO חופשי, ובכך מגביר את רמת הוודאות באותות ספציפיים לקונג'וגטים.
- ערך תפעולי: מבטל את הצורך ברכישת נוגדנים, תיקוף ותסבוב (טיטרציה), ובכך מקצר את לוחות הזמנים ומפחית את עלויות פיתוח הבדיקה.
- ערך אסטרטגי: מאפשר קבלת החלטות מסוג go/no-go על בסיס ויזואליזציה ישירה של מעורבות המטרה במנגנון ה-SUMO, ובכך מפחית עמימות מכניסטית בפרויקטים בשלביהם המוקדמים.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם-סיכון של תרכובות המווסתות SUMOylation, על ידי אספקת ראיות פונקציונליות המבוססות על לוקליזציה לפעילות המסלול.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בתרביות תאים, קיבוע ומיקרוסקופיית פלואורסצנציה להכנה נכונה של הדגימות ולהדמייתן.
- התהליך תלוי בגישה למיקרוסקופיית פלואורסצנציה עם סטים של מסננים מתאימים לערוצי DAPI ו-Texas Red.
- סימון של ביציות נמטודות מחייב הכשרה מוקדמת בדיסקציה של הגונד, דבר המגביל את יכולת ההרחבה המיידית במעבדות שאינן מתמחות בכך.
- קיבוע באמצעות פאראפורמאלדהיד טרי הוא קריטי לשימור המבנה השלישוני של SUMO, דבר המצריך טיפול סטנדרטי בריאגנטים בכל אתרי העבודה.
- למרות יעילותו בתאי יונקים וב-C. elegans, ייתכן שיהיה צורך בתיקוף אמפירי עבור מערכות מודל חדשות כדי לאשר את התאימות ל-kmUTAG-FL.
