הערכת אנגיוגנזה תרפויטי במודל של מורטין של איסכמיה החוצה
8 ביוני 2019
כאן, המודל הניסיוני הטיפולי איסכמיה מוצג ואחריו סוללה של פונקציונלי, בדיקות היסטולוגית ומולקולרית כדי להעריך את האפקטיביות של טיפולים אנגיוגנטית.
המטרה הכוללת של ניסוי זה, מודל ה ischemia hindlimb שלנו היא להדליק את הניסוי בסיס להערכה מקיפה של ההשפעות התפקודיות, ההיסטולוגיות והמולקולריות של סוכנים אנגיוגניים putative. פרוטוקול זה שדות תקן לבדיקת טיפולים אנגיוגניים אפשריים במודל בעלי חיים קטנים עם פוטנציאל ליישומים עתידיים בהקשר הקליני. כמו revascularization אינו מתאים עשרים עד שלושים אחוזים של חולי איסכמיה קריטיים אנגיוגנזה טיפולית התפתחה כאסטרטגיה חדשנית לשיפור שפע הדם באתר איסכמי.
פרוטוקול ניסיוני זה יכול לספק הבנה מקיפה של המנגנונים שבהם טיפולים אנגיוגניים להפעיל את השפעתם במידה של יעילותם בכל אחת מתוצאותיהם. לאחר שאישר חוסר תגובה לצביטת בוהן בעכבר שחור בן 22 שבועות C57 שש נקבה, לגלח את השיער מן hindlimb הימני ולהבטיח את החיה בדור כדי עמדת cubitus על כרית מחוממת. מניחים את החיה תחת מיקרוסקופ לנתח.
ולהשתמש בלהב אזמל כירורגי מספר 11 כדי להפוך חתך עור סנטימטר אחד מעל הירך של hindlimb הימני. קהה לנתח את השומן התת עורי לחשוף את הצרור הנוירו-וסקולרי. ולהשתמש במטליות מחודדות, מספריים אביביים, ומחזיק מחט עיניים כדי לפתוח את נדן האילופרמורל הממברני כדי לחשוף את האיליאק החיצוני הדיסטלי וכלי הירך.
לאחר ניתוח והפרדת העורק והווריד מהעצב, השתמשו בשבעה תפרי פוליפרופילן O שאינם ניתנים לניתוק כדי ללקט את עורק העובר והווריד הדיסטלי ואת עורק האיליאק החיצוני והווריד. זיהוי עורק האליגה החיצוני הדיסטלי והליגה והניתוס של האליג החיצוני הדיסטלי ועורק הירך והוורידים הם קריטיים להצלחת ההליך. השתמש במספריים האביב כדי לשנות את החלק של העורק iliofemoral וורידים בין הקשרים דיסטלי proximal.
ולסגור את החתך עם תפר נספג. לאחר מכן, בין-צפי לספק פתרון antisedative לתוך החיה ולהחזיר את העכבר לכלוב הבית שלה עם ניטור עד החלמה מלאה. כדי לקצור את שרירי gastrocnemius, להסיר את העור משני hindlimbs.
ולהשתמש ספוגית כותנה כדי להפריד את העור מן השרירים. מחזיק את גיד אכילס, להשתמש במספריים באביב כדי להפריד את השריר מן השוקה ואת השוקית עד מפרק הברך. ולהפריד את שרירי הירך מהשריר gastrocnemius.
השתמש מספריים האביב לחתוך את ההכנסות של שריר gastrocnemius ברמת מפרק הברך. ולהשתמש 10% trigasanth למקם את השרירים שנקטפו בכיוון רוחבי על דיסק פקק קטן. לאחר מכן, הצמד להקפיא את הדגימות בחנקן נוזלי מקורר isopentane עבור מינוס 80 מעלות צלזיוס אחסון.
עבור לכידת לייזר microdissection נימי, לאחר קבלת 12 חלקים מיקרומטר של דגימות השריר, לתקן את הרקמות לשקופיות ב 50 מיליליטר של אצטון טהור מקורר במשך חמש דקות במינוס עשרים מעלות צלזיוס. לאחר ייבוש האוויר ומקיף כל דגימה בעט הידרופובי. ולייבש מחדש את הדגימות עם שני נתרן כלורי טוחן ב- PBS בארבע מעלות צלזיוס.
בסוף ההידרציה מחדש, סמן את הדגימות בנוגדן העיקרי המתאים לעניין בארבע מעלות צלזיוס במהלך הלילה. ואחריו שתי שלוש דקות שוטף טרי שני נתרן כלורי טוחן ב PBS לכל לשטוף. לאחר הכביסה השנייה, סמן את החלקים בנוגדן משני מתאים במשך שלושים דקות בארבע מעלות צלזיוס ואחריו שתי שטיפות בנתרן כלורי ב- PBS כפי שהוכח.
לאחר מכן, סמן את הדגימות עם מתחם פרוקסידזה אצמוי אבידין במשך שלושים דקות בארבע מעלות צלזיוס. ואחריו שטיפה וחמש דקות של תיוג עם מצע peroxidase DAB. בסוף הדגירה, לייבש את הרקמות בקרח רציף קר 90% אתנול ו 100% אמרסי אתנול.
לאחר מכן, השתמש במערכת microdissection מאוחר יותר, מצויד פולס למצב מוצק 355 לייזר ננומטר לנתח 10, 000 נימים לכל עכבר להזניק את נימי לנתח לתוך כובע דבק צינור microfuge. כפי שמודגם, אובדן מוחלט של תדלוק hindlimb נצפתה מיד לאחר אינדוקציה איסקימיה hindlimb. הערכה כמותית של זרימת הדם, שבאה לידי ביטוי כיחס בין ISC לאיבר NISC, הוכיחה חליטת דם גפיים משופרת באופן משמעותי בעכברים שנחשפו לגירוי הפרו-אנגיגני בימים 15 ו -45 לאחר HLI.
כימות נימים חיוביים CD31 בחלקים היסטולוגיים של חלקי רקמת שריר gastrocnemius מראה כי צפיפות נימי גדול יותר באיבר איסכמי לעומת האיבר הלא איסכמי. כצפוי. אבל אפקט זה מוגבר עוד יותר לאחר הטיפול עם הסוכן pro-angiogenic.
צפיפות כלי המשנה גם עולה באופן עקבי באיבר האיסכמי ועלייה זו גבוהה משמעותית לאחר החשיפה לגירוי הפרו-אנגיוגניים. ניתוח תגובת שרשרת פולימראז תעתיק הפוך של ביטוי גנים פרו-אנגיוגניים בתאי אנדותל חיוביים CD31 מדגים וריאציה ברורה בביטוי גנים בין עכברים שנחשפו או לא לסוכן הפרו-אנגיוגני. חשוב להשתמש במחט עיניים מבוגרת יותר כדי לפתוח את נדן iliofemoral קרום, כדי למנוע קריעת העורק והווריד במהלך ניתוח הכלי.
הכלי מגיב איסכמיה hindlimb בהערכה בקלות על ידי מדידות זלוש מבוסס דופלר לייזר ואת כימות היסטולוגי של צפיפות כלי נימי מאפשר לנו להעריך את אנגיוגנזה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג מודל ניסויי של איסכמיה בגפה תחתונה, שנועד להעריך את היעילות של טיפולים אנגיוגניים באמצעות הערכות תפקודיות, היסטולוגיות ומולקולריות. הפרוטוקול שואף להניח תשתית לבחינת חומרים אנגיוגניים פוטנציאליים במודל של בעלי חיים קטנים.
מרכיבי מפתח במחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- אנגיוגנזה
- איסכמיה
רקע
- רוואסקולריזציה אינה מתאימה עבור 20-30% מהחולים עם איסכמיה קריטית.
- אנגיוגנזה טיפולית היא אסטרטגיה חדשנית לשיפור הפרפוזיה של הדם.
- המחקר נועד להבין את המנגנונים של טיפולים אנגיוגניים.
- למודל זה עשויות להיות יישומים קליניים בעתיד.
מטרת המחקר
- להערכת ההשפעות התפקודיות של טיפולים אנגיוגניים.
- להערכת שינויים היסטולוגיים בתגובה לטיפול.
- לניתוח תוצאות מולקולריות של סוכנים אנגיוגניים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הקמת מודל של איסכמיה בגפה האחורית בעכברים.
- הערכות תפקודיות באמצעות תגובת צביטה של בהונות.
- ניתוח היסטולוגי לאחר טיפול.
- בדיקות מולקולריות להערכת יעילות הטיפול.
תוצאות עיקריות
- הוכח כי המודל יעיל בהערכה של טיפולים אנגיוגניים.
- סופקו תובנות לגבי התוצאות התפקודיות וההיסטולוגיות.
- זוהו מנגנוני פעולה פוטנציאליים עבור סוכנים אנגיוגניים.
- סופקה תמיכה ליישומים קליניים עתידיים של הממצאים.
מסקנות
- מודל איסכמיה של הגפה האחורית הוא כלי בעל ערך למחקר.
- טיפולים אנגיוגניים מראים הבטחה בשיפור מצבים איסכמיים.
- נדרשים מחקרים נוספים כדי לבחון השלכות קליניות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
פרוטוקול זה מבסס מודל עכברי הדיר וניתן לשחזור של איסכמיה בגפה התחתונה להערכה של טיפולים אנגיוגניים לאיסכמיה קריטית של הגפה, מצב שבו 20-30% מהמטופלים אינם מתאימים לרווזקולריזציה. על ידי מתן אפשרות להערכה תפקודית, היסטולוגית ומולקולרית של התאוששות הפרפוזיה, צפיפות נימיים וביטוי גנים אנגיוגניים, המודל תומך בתיקוף יעדים ובצמצום סיכונים מכניסטיים בתוכניות פרה-קליניות לאנגיוגנזה. הוא מספק מסגרת תרגומית לתעדוף מועמדים מובילים לפני השקעה קלינית.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח ביו-פרמצבטיים
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות הנוגעות לאנגיוגנזה טיפולית באמצעות תוצאי ביסור (perfusion) וצפיפות נימיים הניתנים לכימות.
- ערך תפעולי: מספק מודל כירורגי סטנדרטי לבידוד השפעתם של גירויים פרו-אנגיוגניים על התגובה של רקמה איסכמית.
- ערך ניבוי: תומך בביטחון במטרה על ידי קישור ביטוי גנים אנגיוגניים בתאים אנדותליאליים להשגה של התאוששות תפקודית של זרימת הדם.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מוכנות הבדיקה: מייצרת נקודות קצה כמותיות הכוללות יחסי פרפוזיה של Doppler לייזר, צפיפות קפילריים חיוביים ל-CD31 ומספרי כלי דם קולטרליים לצורך סריקת תרכובות.
- שחזוריות: משתמשת בנהלי ליגציה וכריתה סטנדרטיים כדי להבטיח השראה עקבית של איסכמיה בקרב קבוצות המחקר.
- מדרגיות: תומכת במיקרו-דיסקציה באמצעות לכידה בלייזר של תאים אנדותליאליים לצורך פרופיל מולקולרי בין קבוצות הטיפול.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: מדמה את הפתופיזיולוגיה של איסכמיה קריטית של הגפיים להערכת מנגנונים של טיפול אנגיוגני בסביבה המשקפת מצב קליני.
- המשכיות תרגומית: מקשר בין חתימות אנגיוגניות מולקולריות לתוצאות היסטולוגיות ותפקודיות לצורך קבלת החלטות המותאמות לסמנים ביולוגיים.
- קידום מותאם סיכונים: מאפשר קבלת החלטות להמשך או הפסקה (go/no-go) המבוססות על תיקוף רב-שכבתי של פרפוזיה, היסטולוגיה וביטוי גנים.
שילוב תהליכי עבודה (Pipeline) וזרימה (Workflow)
המודל משתלב ברצף הגילוי, החל מתיקוף המטרה, דרך זיהוי מובילים (lead identification) ועד לבדיקות יעילות פרה-קליניות, ובכך מספק מערכת רלוונטית למחלה להערכת טיפול אנגיוגני.
- ביולוגיה של הגילוי: תומכת בבדיקת השערות לגבי גורמים אנגיוגניים באמצעות מדדי ביצוע של פרפוזיה פונקציונלית ואנגיוגנזה היסטולוגית.
- סריקה: מספקת פלטיים כמותיים וסטנדרטיים להשוואה בין תגובות של גפיים איסכמיות לגפיים מטופלות.
- אנליטיקה: מאפשרת השוואה סטטיסטית של יחסי פרפוזיה, צפיפות נימיים וביטוי גנים ב-RT-PCR בין תנאים ניסיוניים שונים.
- מחקר תרגומי: מקשרת בין ביטוי גנים אנגיוגניים בתאים אנדותלייאליים לבין רה-ארגון וסקולרי ברמת הרקמה להשגת תובנה מכניסטית.
- שימוש חוזר ארגוני: מכוננת פלטפורמה הניתנת לשימוש חוזר לבדיקה איטרטיבית של סוכנים אנגיוגניים במספר פרויקטים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית על ידי קורלציה בין ביטוי גנים אנגיוגניים לבין פרפוזיה פונקציונלית וצמיחת נימים.
- ערך תפעולי: מבטיח שחזוריות באמצעות תהליכי עבודה כירורגיים, היסטולוגיים ומולקולריים סטנדרטיים.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות go/no-go פרה-קליניות על ידי שילוב נתוני יעילות מולטי-פרמטריים.
- השפעה על פורטפוליו: תומך בתיעדוף מותאם סיכונים של מועמדים אנגיוגניים בהתבסס על מעורבות מטרה (target engagement) ומודולציה של מסלולים מאושרים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בליגציה (קשירה) וכריתה מיקרו-כירורגית של כלי דם במודלים של עכברים.
- תלוי בתשתית של דימות פרפוזיה באמצעות לייזר דופלר (laser Doppler perfusion imaging), צביעה היסטולוגית ומיקרו-דיסקציה באמצעות לכידה בלייזר (laser capture microdissection).
- מחייב סטנדרטיזציה של תהליכי העיבוד ההיסטולוגי, סימון הנוגדנים וזרימות העבודה של RT-PCR כדי להשיג תוצאות מולקולריות עקביות.
- כולל שיקולי התאמה בעת יישום המודל על רקעים גנטיים שונים או על שיטות טיפוליות שונות.
- מוגבל על ידי יכולתו של המודל העכברי לשחזר במלואו את המחלות הנלוות של איסכמיה קריטית של הגפיים בבני אדם.
