מודל עכברוש הרומן והטרנסלבית של זעזוע מוח שילוב כוח וסיבוב עם Vivo מוחין מיקרודיאליזה

שיטה זו יוצרת פרדיגמה למחקרים עתידיים על ידי מתן מודל אמין ותרגום של זעזוע מוח המאפשר אפיון אורך של ההשפעות המולקולריות של זעזוע מוח. מודל עכברוש זה משלב מיקרודיאליזה המאפשרת כימות אנליט מתמשך עם טכניקת גלישת טריז המפעילה האצה מהירה והאטה של הראש ופלג הגוף העליון המחקה תכונה חיונית של טראומה craniocerebral אנושי. המשמעות של טכניקה זו להרחיב לקראת מחקרים טיפוליים של זעזוע מוח כפי שהוא מציע הזדמנות יקרת ערך ללמוד את המנגנון והיעילות של סוכנים פרמקולוגיים ב vivo ו ללא הפרעה.

מומלץ מאוד לעבוד צוותים של שניים במהלך זעזוע מוח וצעדי אינדוקציה מזויפים של שיטה זו כדי להגביל טעויות מניפולציה למקסם את היעילות במהלך הניסוי. הפגנת ההליך תהיה קלואי פרובוסט, טכנאית במעבדה שלנו. כדי להתחיל את ההליך, לגלח את ראשו של החיה באמצעות קוצץ חשמלי.

נקה את האזור המגולח באמצעות פתרון של 2% אלכוהול איזורופיל ו 2% כלורקסידין gluconate שלוש פעמים. לאחר מכן להחיל משחת עיניים סיכה כדי למנוע יובש במהלך הרדמה. לאחר מכן, מניחים את החולדה ב מכשיר סטריאוטוקסי.

הכנס את הסורגים לאוזן לתוך תעלות האוזן בזהירות רבה ומהדק את מהדק האף. לאחר מכן, לתקן 26 מד נירוסטה מדריך cannula לזרוע המחזיק על המנגנון הסטריאוטוקסי. לעשות חתך קו האמצע של שלושה סנטימטרים על הקרקפת.

השאר את הגולגולת ברורה על ידי התקנת ארבעה מלחציים סביב החתך. לגרד את periosteum בחוזקה מן הגולגולת עם הלהב כירורגי עד התפרים bregma ו lambda גלויים. אם יש דימום, לשמור על לחץ מוצק על הגולגולת עם כרית גזה או מוליך כותנה הטה.

אשר אם הגולגולת מיושרת כראוי על המנגנון הסטריאוטוקסי על ידי השוואת הקואורדינטות הגביות של התפרים bregma ו lambda. זהה את הקואורדינטות של הנמלים, הדיולאטרליות והדורסוונטריות של תפר הבריגמה כנקודות הייחוס עבור הקואורדינטות של קנולה המדריך. ואז לוקח את קואורדינטות תפר bregma כהפניות, לחשב את הקואורדינטות של אתר השתלת קנולה מדריך בהיפוקמפוס.

סמן את אתר ההשתלה המדויק באמצעות סמן. לאחר מכן, לקדוח חור עם קוטר של 0.5 מילימטרים דרך הגולגולת באתר היעד של הצינורית מדריך. לקדוח שלושה חורים אחרים כחמישה מילימטרים סביב נקודה זו כדי להשחיל שלושה ברגים עוגן לתוך הגולגולת כי יהיה לחזק את cannula לאחר מלט שיניים אקרילי מוחל.

לאחר מכן, להכניס את cannula לתוך ההיפוקמפוס ולתקן אותו עם מלט שיניים. היזהר לא לשפוך מלט שיניים עודף סביב האתר שבו המשקל יוטל. השאירו את הבטון להתייבש במשך שתי דקות ולאחר מכן להסיר את זרוע המחזיק מן cannula.

הכנס obturator נשלף נירוסטה לתוך צינורית, כדי למנוע פגיעה בנוזל השדרתי ואת הסיכונים של זיהום. לאחר מכן, להסיר את ארבעת המהדקים, למשוך בחזרה את העור נסוג ולתפור אותו עם חוט תפר כירורגי. לאחר מכן, להסיר את החולדה מן המנגנון ולהזריק Buprenorphine תת עורית לטיפול בכאב.

מניחים את המכרסם בחזרה בכלוב שלו עם כרית חימום מתחת עד שהוא הופך להיות מודע. לאחר מכן החזירו אותו למתקן לטיפול בבעלי חיים לתקופת החלמה של שבעה ימים תחת מעקב צמוד. בהליך זה, להסיר את obturator מן cannula ולהכניס בדיקה microdialysis לאט.

לאחר מכן, לתקן את מכלול החללית למעיין נירוסטה קשור זרוע מנוף מסתובב נוזלי איזון עם מעמד טבעת ומהדקים, כך החיה יכולה לנוע בחופשיות בתוך הכלוב שלה. לחולדות קשורות יש גישה לליביטום אד למזון ומים במהלך כל הליך המיקרודיאליזה. השתמש במשאבת מיקרואינפוז'ן כדי לספק חדור לבדיקה ולאסוף את הדיאליזה מהקו שקע סיליקה התמזגו.

לפחות שעה ו-30 דקות לפני תחילת ההליך, הפעל את הגשוש לקצב זרימת העבודה שלו במיקרוליטר אחד לדקה. ודא שקצב הזרימה של הגשוש עקבי על-ידי מדידת עוצמת הקול לאורך זמן באמצעות פיפטה. לאחר מכן, לאסוף כל דגימת דיאליזאט בבקבוקון שבר טעון מראש עם microliter אחד של 0.25 שומה לכל ליטר חומצה perchloric כדי למנוע השפלה אנלייט.

אחסן את הדגימה בארבע מעלות צלזיוס לניתוח הבא. לאחר איסוף הדגימה האחרונה, הסר את גשוש המיקרודיאליזה מה cannula והחזר את האובטור לפני החזרת החולדה למתקן לטיפול בבעלי חיים. כדי להתקין את מנגנון זעזוע המוח, תדביק יריעת אלומיניום בחוזקה למסגרת פרספקס בצורת U המכילה כרית קצף.

השתמש בסכין גילוח חד כדי להפוך חריצים בגיליון האלומיניום. תדביק את יריעת האלומיניום הממושך. לאחר מכן מקם את מסגרת הפלקסיגלס מתחת לצינור מדריך PVC.

החזק את צינור מדריך PVC במקום עם מעמד מהדק ב 3-1/2 ס"מ מעל אלומיניום מחורר. חבר קו דיג זבוב ניילון דרך לולאת המתכת, כך החלק התחתון של המשקל הוא ב 2-1/2 ס"מ מעל אלומיניום מחורר כדי למנוע להיטים מרובים כאשר החולדה נופלת על כרית קצף בעקבות הפגיעה. ואז לצרף את קו דיג זבוב ניילון לדוכן המהדק.

משוך את המשקל דרך צינור PVC עם קו דיג זבוב ניילון. שמור אותו במקום על ידי החדרת מפתח הקסדציפל דרך החורים שנקדחו ראשוניים במטר אחד מעל רדיד אלומיניום מחורר. כדי לגרום לזעזוע מוח, מניחים את החיה על החזה שלה על יריעת האלומיניום מחוררת, כך ראשו ממוקם ישירות בנתיב של משקל פליז.

הסר את חרוט האף ולמשוך את המפתח כיף. המשקל ייפול אנכית דרך צינור PVC וישפיע על ראש החולדה. כתוצאה מכך, החולדה תעבור סיבוב מהיר של 180 מעלות ותנחת על גבו.

מוציאים את החולדה מכרית הקצף ומ מניחים אותה על גבה בכלוב. השתמש בשעון לוח הזמנים הדיגיטלי כדי למדוד את זמן הרפלקס הנכון כסימן להתאוששות ולחומרת פציעה. זמן הרפלקס הנכון הוא הזמן הכולל מהפגיעה עד שהעכברוש מתעורר ומסתובב באופן ספונטני בחזרה למצב הנוטה או מתחיל ללכת.

שימו לב לסימני מוות, שבר או דימום. עבור אינדוקציה מזויפת, מניחים את החיה על החזה שלה על יריעת אלומיניום מחוררת, כך ראשו שוכב ישירות בנתיב של משקל פליז. הסר את חרוט האף ולאחר מכן להסיר את החיה מן יריעת אלומיניום מבלי למשוך את המפתח כיף.

לאחר מכן, מניחים את החולדה על גבה בכלוב. השתמש טיימר דיגיטלי כדי למדוד את הזמן הנכון כאינדיקטור של שחזור נוירולוגי. בעלי חיים מהקבוצה הפצועה הגדילו באופן משמעותי את זמן ההתאמה בממוצע לעומת מקרים מזויפים ונראה המום עם שובו להכרה.

מתוך 10 המקרים של קבוצת זעזוע המוח, רק חיה אחת הראתה סימנים קלים של דימום תחת אתר הפגיעה בעקבות הירידה במשקל. עליות משמעותיות בריכוזי גלוטמט חוץ תאי נצפו באזור CA1 ההיפוקמפוס במהלך 10 הדקות הראשונות לאחר אינדוקציה טראומה לעומת פציעה מזויפת. אנא זכור במהלך אינדוקציה זעזוע מוח למנוע להשפיע על cannula עם המשקל כמו זה יגרום פציעות הליבה של החולדה כי הם משמעותית יותר חמור מאשר זעזוע מוח.

שיטה זו יכולה להיות מיושמת על חקר זעזועי מוח חוזרים ונשנים שכן ההליך הוא פגיעת ראש קרובה אשר ניתן לחזור על אותם בעלי חיים בנקודות זמן שונות.