Name: ביטוי וטיהור של Nuclease-מזבל החמצן חינם Protocatechuate 3, 4-דיחמצן (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 14 s
Description: למדו לבטא ולטהר את האנזים PCD לסילוק חמצן ממערכות מימיות באמצעות חומצה פרוטוקטכואית. הפרוטוקול מספק שיטה אמינה לייצור אנזים פעיל ללא זיהומי נוקלאז.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכת על ידי NIH GM121284 ו-AI126742 ל-KEY.

<ol><li>Shera, E. B., Seitzinger, N. K., Davis, L. M., Keller, R. A., Soper, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+single+fluorescent+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Physics+Letters%22%5BJournal%5D)">Detection of single fluorescent molecules.</a> Chemical Physics Letters. 174 (6), 553-557 (1990).</li>
<li>Zheng, Q., Jockusch, S., Zhou, Z., Blanchard, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+contribution+of+reactive+oxygen+species+to+the+photobleaching+of+organic+fluorophores%5BTitle%5D)+AND+%22Photochemistry+and+Photobiology%22%5BJournal%5D)">The contribution of reactive oxygen species to the photobleaching of organic fluorophores.</a> Photochemistry and Photobiology. 90 (2), 448-454 (2014).</li>
<li>Ha, T., Tinnefeld, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photophysics+of+fluorescent+probes+for+single-molecule+biophysics+and+super-resolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Photophysics of fluorescent probes for single-molecule biophysics and super-resolution imaging.</a> Annual Review of Physical Chemistry. 63, 595-617 (2012).</li>
<li>Dixit, R., Cyr, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+damage+and+reactive+oxygen+species+production+induced+by+fluorescence+microscopy%3A+effect+on+mitosis+and+guidelines+for+non-invasive+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%3A+for+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell damage and reactive oxygen species production induced by fluorescence microscopy: effect on mitosis and guidelines for non-invasive fluorescence microscopy.</a> The Plant Journal: for Cell and Molecular Biology. 36 (2), 280-290 (2003).</li>
<li>Davies, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+species+formed+on+proteins+exposed+to+singlet+oxygen%5BTitle%5D)+AND+%22Photochemical+%26+Photobiological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Reactive species formed on proteins exposed to singlet oxygen.</a> Photochemical & Photobiological Sciences. 3 (1), 17-25 (2004).</li>
<li>Sies, H., Menck, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Singlet+oxygen+induced+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%22%5BJournal%5D)">Singlet oxygen induced DNA damage.</a> Mutation Research. 275 (3-6), 367-375 (1992).</li>
<li>Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+oxygen+scavenging+system+for+improvement+of+dye+stability+in+single-molecule+fluorescence+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments.</a> Biophysical Journal. 94 (5), 1826-1835 (2008).</li>
<li>Harada, Y., Sakurada, K., Aoki, T., Thomas, D. D., Yanagida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanochemical+coupling+in+actomyosin+energy+transduction+studied+by+in+vitro+movement+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanochemical coupling in actomyosin energy transduction studied by in vitro movement assay.</a> Journal of Molecular Biology. 216 (1), 49-68 (1990).</li>
<li>Shi, X., Lim, J., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acidification+of+the+oxygen+scavenging+system+in+single-molecule+fluorescence+studies%3A+in+situ+sensing+with+a+ratiometric+dual-emission+probe%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Acidification of the oxygen scavenging system in single-molecule fluorescence studies: in situ sensing with a ratiometric dual-emission probe.</a> Analytical Chemistry. 82 (14), 6132-6138 (2010).</li>
<li>Brown, C. K., Vetting, M. W., Earhart, C. A., Ohlendorf, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biophysical+analyses+of+designed+and+selected+mutants+of+protocatechuate+3%2C4-dioxygenase1%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Biophysical analyses of designed and selected mutants of protocatechuate 3,4-dioxygenase1.</a> Annual Review of Microbiology. 58, 555-585 (2004).</li>
<li>Senavirathne, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+nuclease+contamination+in+commonly+used+oxygen-scavenging+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Widespread nuclease contamination in commonly used oxygen-scavenging systems.</a> Nature Methods. 12 (10), 901-902 (2015).</li>
<li>Senavirathne, G., Lopez, M. A. Jr, Messer, R., Fishel, R., Yoder, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+purification+of+nuclease-free+protocatechuate+3%2C4-dioxygenase+for+prolonged+single-molecule+fluorescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Expression and purification of nuclease-free protocatechuate 3,4-dioxygenase for prolonged single-molecule fluorescence imaging.</a> Analytical Biochemistry. 556, 78-84 (2018).</li>
<li>Jones, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroviral+intasomes+search+for+a+target+DNA+by+1D+diffusion+which+rarely+results+in+integration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Retroviral intasomes search for a target DNA by 1D diffusion which rarely results in integration.</a> Nature Communications. 7, 11409(2016).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cascading+MutS+and+MutL+sliding+clamps+control+DNA+diffusion+to+activate+mismatch+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cascading MutS and MutL sliding clamps control DNA diffusion to activate mismatch repair.</a> Nature. 539 (7630), 583-587 (2016).</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

מערכות ניקוי חמצן כלולים בדרך כלל במיקרוסקופ יחיד מיקרוסקופ פלואורסצנטית כדי להפחית את הלבנה3,7,8. טכניקות אלה מיקרוסקופיה משמשות לעתים קרובות כדי להתבונן חומצות גרעין או אינטראקציות חלבונים עם חומצות גרעין1,13,14. זיהום של OSSs עם הנוקלאוסים עלול להוביל לתוצאות מזויפות.
Osss זמין מסחרית, כולל godcat ו-pcd, ה...

מולקולה יחידה (SM) ביופיזיקה היא שדה הצומח במהירות שינוי הדרך בה אנו מסתכלים על תופעות ביולוגיות. לשדה זה יש את היכולת הייחודית לקשר בין חוקי הפיסיקה והכימיה לביולוגיה. מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית היא אחת שיטה ביופיזית שיכולה להשיג רגישות SM. הקרינה הפלואורסצנטית משמש כדי לזהות biomolecules על ידי קישור אותם fluorophores אורגני קטן או נקודות הקוונטים1. מולקולות אלה יכול לפלוט פוטונים כאשר מתרגש על ידי לייזרים לפני הלבנת הלבנה2. הלבנה מתרחשת כאשר תוויות פלורסנט לעבור נזק כימי אשר הורס את היכולת שלהם להלהיב באורך הגל הרצוי2,3. הנוכחות של מינים חמצן תגובתי (ROS) במאגר מימית הם הגורם העיקרי של photobleaching לבנה2,4. בנוסף, רוס יכול לגרום נזק biomolecules ולהוביל תצפיות שגויות ב ניסויים SM5,6. כדי למנוע נזק חמצוני, מערכות ניקוי חמצן (OSS) ניתן להשתמש3,7,8. מערכת הגלוקוז אוקסידאז/קטלאז (GODCAT) יעילה בסילוק חמצן8, אך היא מייצרת הפרזות עשויות להזיק כintermediates. אלה עלולים להזיק לbiomolecules של עניין בלימודי SM.
לחילופין, protocatechuate 3, 4 diחמצון (pcd) ביעילות להסיר O2 מתוך פתרון מימית באמצעות המצע שלה protocatechuic חומצה (pcd)7,9. PCD הוא מטלואנזים המשתמשת בברזל nonheme כדי לתאם PCD ולזרז את תגובת הפתיחה catechol ring באמצעות מומס O210. זו תגובה צעד אחד מוצג להיות OSS הכולל טוב יותר לשיפור יציבות fluorophore ב ניסויים SM7. למרבה הצער, הרבה אנזימי OSS זמינים מסחרית, כולל PCD, מכילים נוקלאוסים מזהם11. מזהמים אלה יכולים לגרום לנזק של הגרעין מבוססי חומצות מצעים המשמשים בניסויים SM. עבודה זו להבהיר פרוטוקול טיהור מבוסס כרומטוגרפיה לשימוש PCD רקומביננטי במערכות SM. PCD ניתן להחיל באופן כללי על כל ניסוי שבו ROS הם מזיקים מצעים הדרושים עבור רכישת נתונים.

<table><tbody><tr><td>2-מרקפטואתנול</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>M3148</td> <td>ובטא; ME</td></tr><tr><td>30% תמיסת אקרילאמיד וביס-אקרילאמיד, 29:1</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0156</td><td></td></tr><tr><td>חומצה אצטית, ACS Fisherl Chemical מוסמך קרחוני</td><td></td><td>A38C-212</td><td></td></tr><tr><td>אגר, מגורען</td><td>BD Biosciences</td><td>DF0145-17-0</td><td></td></tr><tr><td>AKTA FPLC System</td><td>GE Healthcare Life</td><td>Sciences מטהר AKTA: Box-900, pH/C-900, UV-900, P-900 ו-Frac-920</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-2 יחידת סינון צנטריפוגלי</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC201024</td><td>10 kDa MWCO</td></tr><tr><td>אמוניום ברזל (II) סולפט הקסהידראט</td><td>Sigma</td><td>F-2262</td><td></td></tr><tr><td>אמוניום פרסולפט (APS) טבליות</td><td>Amresco</td><td>K833-100TABS</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Amresco</td><td>0339-25G</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Tryptone</td><td>BD Biosciences</td><td>DF0123173</td><td></td></tr><tr><td>תוסף מדיה תרבית מיובשת BD Bacto: תמצית שמרים בבקבוק</td><td>VWR</td><td>90004-092</td><td></td></tr><tr><td>BIS-TRIS פרופאן,>=99.0% (טיטרציה)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6755-500G</td><td></td></tr><tr><td>ברומופנול כחול</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>B0126-25G</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie בריליאנט</td><td>בלו אמרסקו</td><td>0472-50G</td><td></td></tr><tr><td>Costar 96&ndash; שטוח היטב; צלחת EIA תחתונה</td><td>Bio-Rad</td><td>2240096EDU</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>P212121</td><td>SV-DTT</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco פוספט חוצץ מלח 500 מ"ל</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>D8537-500 מ"ל</td><td>PBS</td></tr><tr><td>אתידיום ברומיד</td><td>תרמו פישר מדעי</td><td>BP1302</td><td></td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>פישר מדעי</td><td>G37-20</td><td></td></tr><tr><td>מגורען LB מרק מילר</td><td>EMD Biosciences</td><td>1.10285.0500</td><td></td></tr><tr><td>Hi-Res Standard Agarose</td><td>AGTC Bioproducts</td><td>AG500D1</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0250-250G</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Goldbio</td><td>I2481C25</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptin</td><td>Roche</td><td>11017128001</td><td></td></tr><tr><td>Lysozyme מחלבון ביצת עוף</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6876-1G</td><td></td></tr><tr><td>מגנזיום כלוריד הקסהידראט</td><td>אמרסקו</td><td>0288-1KG</td><td></td></tr><tr><td>ספקטרופוטומטר מיקרונפח, עם יכולת קובט</td><td>תרמו פישר</td><td>ND-2000C</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>P212121</td><td>RP-S23020</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA Superflow (100 מ"ל)</td> <td>Qiagen</td><td>30430</td><td></td></tr><tr><td>Novagen BL21 תאים מוכשרים</td><td>EMD Millipore</td><td>69-449-3</td><td>מדיה SOC כלולה</td></tr><tr><td>אורנג' G</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>0-267</td><td></td></tr><tr><td>פפסטין</td><td>זהב ביוטכנולוגיה</td><td>P-020-25</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>אמרסקו</td><td>0754-25G</td><td></td></tr><tr><td>חומצה פרוטוקאטצ'ואית</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>ICN15642110</td><td>PCA</td></tr><tr><td>נתרן דודציל סולפט</td><td>P212121</td><td>CI-00270-1KG</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax M2 Microplate קורא</td><td>מכשירים מולקולריים</td><td></td><td></td></tr><tr><td>יחידות סינון חד פעמיות סטריליות עם קרום PES > 250 מ"ל</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>09-741-04</td><td></td></tr><tr><td>יחידות סינון חד פעמיות סטריליות עם קרום PES > 500 מ"ל</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>09-741-02</td><td></td></tr><tr><td>Superose 12 10/300 GL</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17517301</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Amresco</td><td>0761-25ML</td><td></td></tr><tr><td>Tris Ultra Pure</td><td>Gojira Fine Chemicals</td><td>UTS1003</td><td></td></tr><tr><td>טייפון 9410 מצלמת פלואורסצנט במצב משתנה</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UltraPure EDTA</td><td>Invitrogen/Gibco</td><td>15575</td><td></td></tr><tr><td>ZnCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>208086</td><td></td></tr></tbody></table>

ביטוי וטיהור של nuclease-מזבל החמצן חינם protocatechuate 3, 4-דיחמצן

Expression and Purification of Nuclease-Free Oxygen Scavenger Protocatechuate 3,4-Dioxygenase

מיקרוסקופ אחד (SM) משמש במחקר של אינטראקציות מולקולריות דינמיות של fluorophore המסומנים בזמן אמת. עם זאת, fluorophores נוטים לאבד את האות דרך photobleaching לבנה על ידי חמצן מומס (O2). כדי למנוע הלבנת ולהאריך את תקופת החיים fluorophore מערכות ניקוי חמצן (OSS) מועסקים כדי להפחית O2. OSS זמין מסחרית יכול להיות מזוהם על ידי נוקלאוסים כי נזק או לבזות חומצות גרעין, פרשנות מייסדת של תוצאות ניסיוני. כאן אנו מפרטים פרוטוקול עבור הביטוי והטיהור של פסאודומונס מאוד פעיל protocatechuate-3, 4-diחמצון (pcd) ללא זיהום נוקלאז לזיהוי. PCD יכול באופן יעיל להסיר מינים מגיב O2 על ידי המרה של המצע protocatechuic חומצה (pcd) ל 3-קרבוxy-cis, cis-muconic חומצה. שיטה זו יכולה לשמש בכל מערכת ימית שבה O2 ממלאת תפקיד מזיק ברכישת נתונים. שיטה זו יעילה בהפקת פעיל מאוד, נוקלאז חינם pcd בהשוואה pcd זמין מסחרית.

מסחרית זמין החמצן PCD הוא מזוהם לעתים קרובות עם nuclease DNA. פעילות מזהם נוקלאז עלולה להוביל לתוצאות מזויפות בלימודי פלורסנט, בעיקר מחקרים שניתוח dna או dna אינטראקציה חלבונים. מצאנו כי רקומביננטי PCD, הטרודימר של הקסאחדין מתויג למעלה ו-Pcd, ניתן להתבטא ב-E. coli (איור 1). הטרודימר מטוהר תחילה על ידי כרומטוגרפיה של זיקה ניקל (איור 2). PCD משתמט ב -2 שלבים של ריכוזי הפפירון. שברים בכרומטוגרפיה מנותח על ידי SDS-PAGE. שברים של PCD ...

Protocatechuate 3, 4-דיחמצן (PCD) ניתן להסיר בחינם חמצן diאטומית ממערכת מימית באמצעות המצע שלה protocatechuic חומצה (PCD). פרוטוקול זה מתאר את הביטוי, הטיהור וניתוח הפעילות של אנזים ניקוי החמצן.

ביטוי וטיהור של Nuclease-מזבל החמצן חינם Protocatechuate 3, 4-דיחמצן

Single molecule (SM) microscopy is used in the study of dynamic molecular interactions of fluorophore labeled biomolecules in real time. However, ...

הפרוטוקול שלנו מניב PCD פעיל מאוד ללא גרעין לגילוי, אשר ניתן להשתמש בו בכל פתרון שבו חמצן מים הוא מזהם. הטכניקות בהן אנו משתמשים קלות לשכפול ומבטיחות שלא יהיו מזהמי גרעין במוצר. כדי להתחיל, לשלב מיקרוליטר אחד של pVP91A-pcaHG PCD ביטוי פלסמיד ו 20 microliters של מסחרי זמין E.coli BL21 בצינור.מצליפים בצינור כדי לערבב, ומ מניחים את הצינור על קרח במשך חמש דקות. כדי להמשיך את תגובת השינוי, מניחים את הצינור באמבט מים ב 42 מעלות צלזיוס במשך 30 שניות, ולאחר מכן על קרח במשך שתי דקות. הוסיפו 80 מיקרוליטרים של מדיה SOC, ונערו במהירות של 225 סל"ד ו-37 מעלות צלזיוס למשך שעה.לאחר מכן, יוצקים את תערובת תגובת הטרנספורמציה על אגר LB-ampicillin, ולהשתמש מפזר צלחת כדי להפיץ את התערובת. מכסים את הצלחת במכסה, ודוררים את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס במשך 16 עד 18 שעות. לאחר מכן, בחר מושבה אחת מהצלחת, וחסן ב 50 microliters של LB-אמפיצילין בבקבוק ארלנזייר 250 מיליליטר.מניחים את הבקבוקון על שייקר ב 225 סל"ד כדי דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 16 עד 18 שעות. לאחר מכן, להעביר 20 מיליליטר של התרבות דגירה לבקבוק ארבעה ליטר מלא ליטר אחד של LB-ampicillin. לנער ב 225 סל"ד ב 37 מעלות צלזיוס.בכל שעה, לצייר מיליליטר אחד של התרבות לתוך cuvette כדי למדוד את הצפיפות האופטית ב 600 ננומטר על פוטומטר. ככל שהצפיפות האופטית התרבותית עולה קרוב ל- 0.5, הגדל את תדירות המדידות לכל 15 דקות, עד שה- OD600 יגיע ל- 0.5. לאחר מכן, להעביר את בקבוק ארבעה ליטר לפח קרח.מערבלים את הבקבוק באמבט הקרח כדי להפחית את טמפרטורת התרבות. מעבירים את בקבוק הארבעה ליטר לאנקובטור ב-17 מעלות צלזיוס ו-180 סל"ד. המשך לפקח על OD600 כל 20 דקות.ב 0.7 OD600, להוסיף IPTG ו אמוניום ברזל סולפט hexahydrate פתרונות מלאי להגיע לריכוז הסופי של 0.5 מילימולאר ו 10 מיליגרם לליטר, בהתאמה. לנער את התרבות ב 180 סל"ד ו 17 מעלות צלזיוס במשך 18 שעות. לאחר הדגירה, מניחים את בקבוק התרבות בקרח במשך שתי דקות.לקצור מיליליטר אחד של התאים המושרה בצינור מיקרו-מרכזיפוג פוליפרופילן 1.5 מיליליטר לניתוח SDS-PAGE. לאחר מכן, יוצקים את תרבות החיידקים לתוך בקבוקים, 500 מיליליטר כל בקבוק, עבור צנטריפוגה. גלולה את התרבות בארבע מעלות צלזיוס ו 3, 000 פעמים גרם במשך 20 דקות.תדקן את העל-טבעיים. פיפטה כדי לעכל מחדש את כדורי, כל אחד 12.5 מיליליטר של PBS קר, ולשלב כל שני resuspensions בצינור חרוט 50 מיליליטר. גלולה התאים שוב כמו קודם לכן.לאחר מכן, השלך את העל-טבעיים, ולהשתמש בפיגט כדי להוסיף 10 מיליליטר של מאגר תיזה בכל צינור כדי לנצל מחדש את התאים. לאחר sonicating את הצינורות עם תאים המושרה, יוצקים את lysate חיידקי לתוך בקבוק פוליקרבונט מקורר מראש. צנטריפוגה במשך 60 דקות ב 120, 000 פעמים גרם וארבע מעלות צלזיוס, ויוצקים את העל טבעי לצינור חרוט קר 50 מיליליטר.לאחר הכנת מכשיר FPLC עם עמודת שף טעון ניקל, לטעון את המדגם לעמודה ב 0.15 מיליליטר לדקה. לשטוף את העמוד עם 20 מיליליטר של חיץ ניקל ב imidazole 20 מילימולאר. שמור את הכביסה בצינור 50 מיליליטר לניתוח.לאחר מכן, לשטוף את העמוד עם 15 מיליליטר של חיץ ניקל ב 125 מילימולרים imidazole. לאסוף את האלוטיון ב 19 שברים של 0.8 מיליליטר כל אחד. לשטוף את הטור שוב עם 15 מיליליטר של 100% ניקל חיץ B, ולאסוף 75 שברים נוספים של 0.2 מיליליטר כל אחד.המשך עם הניתוח של שברים שנאספו על 12% SDS-PAGE ג'לים כדי לאשר נוכחות של PCD. ראשית, להוסיף 35 microliters של חיץ תגובה לצינור מיקרו-מרכזיפוג פוליפרופילן 1.5 מיליליטר. בצינור, לשלב חמישה microliters של שברי כרומטוגרפיה שיא 500 ננוגרם של שלושה קילו-ק"מ זוג פלסמיד pXba supercoiled.מניחים את הצינור באמבט מים ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת. לאחר הכנת ג'ל אגרוז על פי כתב היד, מוסיפים 30 מיקרוליטרים של כל תגובה לתוך בארות בג'ל. אלקטרופורזה ב 10 וולט בסנטימטר בטמפרטורת הסביבה במשך כשעה.עכשיו, צבע הג'י הכתום הגיע לקצה הג'ל. מיד, השתמש בסורק פלואורסצנטי כדי לדמיין את אות האתידיום ברומיד של הג'ל. עם הפונקציה של העוצמה וגודל פיקסל התמונה, קבע את נפח הפיקסלים של מיני הדנ"א השונים, כגון עיגולים על-צבעיים, ליניאריים ועיגולים חתוכים.כדי לקבוע את האחוז של כל מין דנ"א, חלק את נפח הפיקסלים של מין דנ"א יחיד בנפח הפיקסלים הכולל עבור כל המינים הבודדים. ניתוח SDS-PAGE מראה את שיא האלוטיון השני מכיל זיהום חלבון מינימלי, המייצג הטרודימר PCD כמעט טהור ופעילות נוקלאאז מינימלית עד בלתי ניתנת לגילוי. לכן, לשלב אלה 10 שברים מן elution PCD השני בצינור חרוט חמישה מיליליטר לניתוח נוסף.לאחר טיהור כרומטוגרפיה של PCD, בחדר קר של ארבע מעלות צלזיוס, לשלב בצינור microcentrifuge נפח מתאים של נתרן כלורי, טריס הידרוכלוריד, מגנזיום כלורי, dithiothreitol, PCA, ו pXba פלסמיד supercoiled לעשות מלאי 5X. מניחים צלחת שטוחה תחתונה 96 היטב על קרח, ולהעביר 10 microliters של פתרון 5X משולב ל בארות. מיד לפני הניתוח, להוסיף לכל באר 10 microliters של שברי PCD SEC בודדים.קבעו את קורא הלוחות לטמפרטורה פנימית של 37 מעלות צלזיוס, והעבירו את צלחת ה-96 היטב למחזיק הצלחת. יש לסגת ממחזיק הלוח לתוך המכשיר, ולמדוד ספיגה ב-290 ננומטר במרווחים של 20 שניות למשך שעה. הגדר את הכלי לנער את הצלחת חמש שניות לפני כל קריאה.לאחר שעה אחת, להוסיף 10 microliters של פתרון עצירה לכל באר כדי לסיים את התגובות. בצע אלקטרופורזה ג'ל עבור שברי ה-SEC PCD. בחר שברים עם פעילות חמצון PCA ביותר, המצוין על ידי ספיגה מופחתת ולא זיהום גרעין שנצפה.למדוד את הספיגה ב 280 ננומטר, ולחשב את ריכוז PCD הכולל מבוסס על ספיגת מקדם ההכחדה. אחסן את השברים שנבחרו לאחסון לטווח ארוך במינוס 80 מעלות צלזיוס. בניסוי זה, נמצא כי PCD רקומביננטי, הטרודימר של hexahistidine מתויג pcaH ו pcaG, בא לידי ביטוי E.coli.ההטרודימר טוהר לראשונה על ידי כרומטוגרפיה של זיקה לניקל. הספיגה מוצגת בכחול, ואת הריכוז אחוז של חיץ ניקל B מוצג באדום. הזרימה מראה את החלבונים החיידקיים המסיסים שלא נקשרו לאסין הניקל.כמה PCD אלוט בנוכחות imidazole 125-מילימולאר, אבל רוב החלבון eluted ב imidazole 250 מילימולאר. ניתוח SDS-PAGE מייצג מציין שהשברים מצעד האלוטיון היו נקיים ממזהמים. ג'ל אגרוז של בדיקת גרעין חושף זיהום באמצעות השוואה עם השליטה השלילית ללא תוספת חלבון ושליטה חיובית מזוהמת בגרעין DNA.כימות של מיני ה-DNA השונים שנצפו בבדיקת ג'ל ג'ל אגרוז מראה שברים 29 עד 38 הייתה פעילות נוקלאז קטנה, אשר נבחרו להיות משולבים, מרוכזים, ומטוהרים עוד יותר על ידי ה-SEC. נתונים משלושה שברי SEC מייצגים הראו כי PCD מטוהר הפחית את הספיגה ב 290 ננומטר, המציין חמצון של PCA. בעקבות הליך זה, PCD מטוהרים ניתן להשתמש אופטימיזציה במערכת ניקוי החמצן הרצוי.פעולה זו תקבע את הכמות המדויקת של PCD הנדרש עבור המערכת. טכניקה זו שימשה כדי להאריך את אורך החיים פלואורופור בניסויים מיקרוסקופיים מולקולה אחת, אשר אפשרה תקופות ארוכות יותר של איסוף נתונים. האולטרהצנטריפוגה המשמשת מסוכנת.ודא כי צנטריפוגות מאוזנות כראוי לפני ספינינג. אתידיום ברומיד הוא רהוט מסוכן. הימנע ממגע על ידי לבישת ציוד מגן אישי, והיפטר ממנו כראוי.

expression-purification-nuclease-free-oxygen-scavenger

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

זרימות עבודת תיוג איזוטופים יציבות...

פרוטאז וחומצת קטליזאטור זרימות עבודת תיוג המעסיק<sup&gt; 18</supמים&gt; O-מועשר

אנו מתארים פרוטוקול עבור דור האור היה זרז של מי חמצן - גורם-שותף עבור טרנספורמציות חמצונים.

אור מונחה אנזימתי Decarboxylation

אנו מציגים פרוטוקול מפורט לבנייה וסינון של ספריות מוטנטיות עבור מסעות אבולוציה מכוונים ב-Saccharomyces cerevisiae.

בימוי שיטת אבולוציה<em&gt; שמר האפייה</em&gt;: יצירת ספריית Mutant והקרנה

מוצג פרוטוקול לייצור, טיהור ושימוש בשלפוחיות ממברנה חיצוניות ארוזות אנזימים (OMV) המספק יציבות אנזימים משופרת ליישום ביישומים מגוונים.

אריזת חלבון בימוי בתוך החיצון ממברנה השלפוחית ​​מ<em&gt; Coli Escherichia</em&gt;: עיצוב, ייצור טיהור

כאן, אנו מציגים עבור טיהור יעיל צעד בודד של האדם לא מתויגות הפעיל פרוטוקול 10-11 טרנסלוקציה-2 (TET2) dioxygenase 5-methylcytosine באמצעות יונים כרומטוגרפיה ואת וזמינותו שלה באמצעות מסה טנדם-כרומטוגרפיה נוזלית מסות (LC-MS/MS)-המבוסס על הגישה.

טיהור יעיל ופיתוח Assay LC-MS/MS-מבוסס על 10-11 טרנסלוקציה-2 5-Methylcytosine Dioxygenase

כאן אנו מציגים עבור טיהור חלבון אנאירובית, ריכוז חלבון אנאירובית, ואפיון עוקבות קינטי משתמש במערכת אלקטרודה חמצן פרוטוקול. השיטה מומחש באמצעות האנזים DesB, אנזים dioxygenase אשר פעיל כאשר מטוהרים ומאוחסנים בסביבה אנאירובית ויציבה יותר.

חלבון אנאירובית טיהור וניתוח קינטי באמצעות אלקטרודה חמצן ללמוד DesB Dioxygenase פעילות וניגוד

כאן, אנו מציגים עבור פרוטוקול סינתזה ואפיון של חלקיקי תחמוצת צריום (nanoceria) עבור ROS (מינים חמצן תגובתי) ניקוי ויוו, nanoceria הדמיה ברקמות הצמח על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית, אין ויוו ניטור של nanoceria ROS ניקוי על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית.

ניקוי קטליטי של הצמח חמצן תגובתי מינים In Vivo על ידי חלקיקי תחמוצת צריום Anionic

אנו מתארים אסטרטגיה כיצד להשתמש בדגימות RNA מתוך דגימות הצדפה הפסיפיק, ולהעריך את החומר הגנטי על ידי השוואה עם נתוני הגנום זמין בפומבי כדי ליצור ספריית cDNA כמעט רציף.

אסטרטגיה מתכנס לדור של ספריית דנ א בלתי מופנה מצדפות פסיפיק

מוצג כאן הוא פרוטוקול לביצוע מולקולה בודדת Förster העברת אנרגיה ללמוד החלטה ג'ונסון. עירור שני הצבעים משמש לקביעת קבועי הדיסוציאציה. הזמן חד צבע לשגות smfret הוא לאחר מכן בזמן אמת מחשוף בחני להשיג את התפלגות זמן לשכון לפני הרזולוציה ג'ונסון.

מולקולה בודדת Förster שיטות העברת אנרגיה בזמן אמת על החלטה של צומת הולידיי-GEN1

כאן, אנו מציגים פרוטוקול המשלים מונומר חלבון על ידי אנזימים היוצרים פולימר פולימרי עם רצף מבוקר ומשתק אותו על פני השטח עבור לימודי מולקולה בודדת של כוח ספקטרוסקופיית.

OaAEP1-תיווך אנזימטית והשתק של חלבון פלסטריזציה לספקטרוסקופיית מולקולות יחיד

מאמר זה מתאר מתודולוגיה לביטוי יתר של Nsp15 רקומביננטי, נוקלאז רעיל, במערכת ביטוי C41(DE3), ואחריה טיהור החלבון המתויג באמצעות כרומטוגרפיה של זיקה והדרת גודל. ניתן להתאים את הפרוטוקולים האלה לחלבונים רעילים מאתגרים אחרים.

שאיבת יתר וטיהור נוקלאז רעיל מ-Escherichia coli

למדו לבטא ולטהר את האנזים PCD לסילוק חמצן ממערכות מימיות באמצעות חומצה פרוטוקטכואית. הפרוטוקול מספק שיטה אמינה לייצור אנזים פעיל ללא זיהומי נוקלאז.

ביטוי וטיהור של Nuclease-מזבל החמצן חינם Protocatechuate 3, 4-דיחמצן

גלה סרטונים נוספים