Name: שירי תנועה של CFDA מעקב טעון ברקמות הכיור התחתון של Arabidopsis (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min
Description: חקור מנגנוני תחבורה בין-תאית בצמחים באמצעות טעינת CFDA לשורשים ולהיפוקוטיל של Arabidopsis. השיטה מאפשרת הדמיית תבניות הפצה של carboxyfluorescein וחקר פעילות הפלואם.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו ממומנת על ידי הקרן הלאומית למדע הטבע של סין (31671257) ו חוביי המרכז חדשנות שיתופית לתעשיית הדגן (LXT-16-18).

1. ההתפתחות האנכית של הערידופזיס במדיום MS
<ol><li>הפנים של ארון זרימה למינארי צריך להיות מטופלים עם 30 דקות UV אור ו 15 דקות זרימת אוויר לפני השימוש. הקפידו לסגור את דלת הזכוכית כאשר אור UV דולק. רסס את כל הכלים והצלחות עם 70% אתנול לפני הצבת אותם בארון.</li>
	<li>הכינו את המדיום המורראשיג ו Skoog (MS) בצלחת פטרי בקוטר 90 מ"מ מתחת לארון זרימה למינארי. הערה: מדיום MS מכיל את הרכיבים הבאים: 20.6 mM NH4לא3, 18.8 mm מושג3, 1.25 mm KH2הפו4, 1.5 mm mgso4· 7h2o, 3 מ"מ cacl2· 2h2o, 0.1 mm mgso4· H2O, 1.03 Μm Na2MoO4· 2H2O, 0.1 MM H3BO3, 30 μm הלקוסו4·7h 2 o, 0.1 μm cuso4·5H 2 o, 0.1 μm cocl2·6h שני או, 1.39 μk KI, 97 μ M FeSO4 · 7h2O, 114.5 μm החומצה הנילינאית (edta), 4.07 μm חומצה ניקטינית, 2.44 μm pyridoxine HCl, 0.15 μm תיאמין HCl, 2.68 מילימטר גליצין, 555 μm-inositol, 87.7 מילימטר סוכרוז ו -10 גרם/L אגר.</li>
	<li>לחות עצות מעוקר או קיסמים על ידי נגיעה עצה או קיסמים למדיום MS, ולאחר מכן לטבול את הזרעים מעוקר אחד על ידי אחד על המיקום קבוע של כל צלחת פטרי המצוין על ידי כרטיס הזריעה.</li>
	<li>חותם את צלחת פטרי עם סרט פרפין וסרט דביק ומניחים אותו באופן אנכי על דוכן ברור בחדר הצמיחה (22 ° צ', 70% לחות) עם מחזור יום של 16 h של אור ו 8 h של חושך (תאורה מ 06:00 עד 10 pm). הצמח Arabidopsis מוכן הטעינה cfda ביום 9-13 לאחר זריעה. הערה: הפרוצדורה הבאה מבוצעת בשעות אחר הצהריים משעה 14:00 עד 17:00.</li>
</ol>2. CFDA לטעון עם הליך חיתוך השורש
<ol><li>הכינו פתרון חדש לעבודה CFDA באופן מיידי לפני השימוש. לדלל את 1 מ"מ CFDA מניות פתרון מאוחסן ב-20 ° c מקפיא עם מים באולטרטהורים סטרילי לריכוז עובד של 5 μM.</li>
	<li>חותכים את קרום מיקרו נקבובי פרפין הסרט (ראה טבלת חומרים) לחתיכות קטנות של 3 מ"מ x 3 מ"מ גודל.</li>
	<li>לחשוף את הצמחים גדל בחדר ב 22 ° c ולנקות את הלחות עודף עם מגבת נייר. מניחים את חתיכות הסרט הקטנות מתחת לכל שורש. הערה: מכאן ועד שלב 2.6, יש להשלים את התהליך כולו תוך 15 דקות.</li>
	<li>להרים את הצמחים על מכסה צלחת פטרי. חותכים את השורשים בעמדה על 5-10 מ"מ מתחת השורש-היפוקטיל שורש. מניחים את החלק לירות בחזרה על הסרט על המדיום.</li>
	<li>בקפידה להחיל 0.25 μL של CFDA אל קצה החיתוך של כל שורש תחת מיקרוסקופ מבתר. להימנע מתיז לחלקים אחרים של הצמח.</li>
	<li>לכסות את הצלחת ולהשאיר את הצמחים תחת אור עבור 2-3 h (22 ° c) בחדר הצמיחה.</li>
	<li>שטפו את הצמחים המוכתמת שלוש פעמים ברציפות בשלושה ספלים נפרדים מלאים במים מזוקקים, ולאחר מכן שימו לב לצמחים שמתחת למיקרוסקופ עם מערכת הסטריאו עם מרחק של 1.4 x עד 3.3 x (ראו טבלת חומרים). לאיתור הקרינה הפלואורסצנטית, להשתמש בקוביית מסנן יעילות גבוהה (470/20 ננומטר, 495 nm פיצול ו 525/50 ננומטר פליטה) רכוב לשדר את האות הפלואורסצנטית.</li>
</ol>3. CFDA טעינה עם היפוקטיל-צובט הליך
<ol><li>הכינו פתרון חדש לעבודה CFDA באופן מיידי לפני השימוש. לדלל את 1 mM CFDA מניות פתרון מאוחסן-20 ° c מקפיא עם מים באולטרסאונד סטרילי (לראות את הטבלה של חומרים) לריכוז עובד של 5 μm.</li>
	<li>חותכים את קרום מיקרו נקבובי פרפין הסרט (ראה טבלת חומרים) לחתיכות קטנות של 3 מ"מ x 3 מ"מ גודל.</li>
	<li>לחשוף את הצמחים גדל בחדר ב 22 ° c ולנקות את הלחות עודף עם מגבת נייר. הערה: מכאן ועד שלב 3.7, יש להשלים את התהליך כולו תוך 15 דקות.</li>
	<li>הניחו פיסת סרט קטנה מתחת לצומת השורשים הבסיסי של כל צמח.</li>
	<li>מלקחיים להשתמש כדי לצבוט בעדינות את ההיפוטיל ליד השורש-היפוטיל במיקרוסקופ תחת מיקרוסקופ מבתר.</li>
	<li>בזהירות להחיל 0.1 μL של CFDA אל אתר הפצע תחת מיקרוסקופ מבתר. להימנע מתיז לחלקים אחרים של הצמח.</li>
	<li>לכסות את הצלחת, ולהשאיר את הצמחים תחת אור (22 ° c) עבור 2-3 h.</li>
	<li>שטפו את הצמחים המוכתמת שלוש פעמים ברציפות בשלושה ספלים נפרדים מלאים במים מזוקקים, ולאחר מכן שימו לב לצמחים שמתחת למיקרוסקופ עם מערכת הסטריאו עם מרחק של 1.4 x עד 3.3 x (ראו טבלת חומרים). לאיתור הקרינה הפלואורסצנטית, הר קוביית מסנן יעילות גבוהה (470/20 ננומטר, 495 nm לפצל ו 525/50 הפליטה nm) כדי לשדר את האות זריחה.</li>
</ol>

<ol><li>Grignon, N., Touraine, B., Durand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((6%285%29Carboxyfluorescein+as+a+tracer+of+phloem+sap+translocation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Botany%22%5BJournal%5D)">6(5)Carboxyfluorescein as a tracer of phloem sap translocation.</a> American Journal of Botany. 76, 871-877 (1989).</li>
<li>Wright, K. M., Oparka, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fluorescent+probe+HPTS+as+a+phloem-mobile%2C+symplastic+tracer%3A+an+evaluation+using+confocal+laser+scanning+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">The fluorescent probe HPTS as a phloem-mobile, symplastic tracer: an evaluation using confocal laser scanning microscopy.</a> Journal of Experimental Botany. 47 (3), 439-445 (1996).</li>
<li>Oparka, K. J., Prior, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Movement+of+Lucifer+Yellow+CH+in+potato+tuber+storage+tissues%3A+A+comparison+of+symplastic+and+apoplastic+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Movement of Lucifer Yellow CH in potato tuber storage tissues: A comparison of symplastic and apoplastic transport.</a> Planta. 176 (4), 533-540 (1988).</li>
<li>Knoblauch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multispectral+Phloem-Mobile+Probes%3A+Properties+and+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Multispectral Phloem-Mobile Probes: Properties and Applications.</a> Plant Physiology. 167 (4), 1211-1220 (2015).</li>
<li>Oparka, K. J., Duckett, C. M., Prior, D. A. M., Fisher, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+imaging+of+phloem+unloading+in+the+root+tip+of+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Real-time imaging of phloem unloading in the root tip of Arabidopsis.</a> The Plant Journal. 6 (5), 759-766 (1994).</li>
<li>Viola, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuberization+in+Potato+Involves+a+Switch+from+Apoplastic+to+Symplastic+Phloem+Unloading%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Tuberization in Potato Involves a Switch from Apoplastic to Symplastic Phloem Unloading.</a> The Plant Cell. 13 (2), 385-398 (2001).</li>
<li>Roberts, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phloem+Unloading+in+Sink+Leaves+of+Nicotiana+benthamiana%3A+Comparison+of+a+Fluorescent+Solute+with+a+Fluorescent+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Phloem Unloading in Sink Leaves of Nicotiana benthamiana: Comparison of a Fluorescent Solute with a Fluorescent Virus.</a> The Plant Cell. 9 (8), 1381-1396 (1997).</li>
<li>Péron, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+Insights+into+Phloem+Unloading+and+Expression+of+Sucrose+Transporters+in+Vegetative+Sinks+of+the+Parasitic+Plant+Phelipanche+ramosa+L+%28Pomel%29%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">New Insights into Phloem Unloading and Expression of Sucrose Transporters in Vegetative Sinks of the Parasitic Plant Phelipanche ramosa L (Pomel).</a> Frontiers in Plant Science. 7 (2048), (2017).</li>
<li>Spallek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interspecies+hormonal+control+of+host+root+morphology+by+parasitic+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+USA%22%5BJournal%5D)">Interspecies hormonal control of host root morphology by parasitic plants.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 114 (20), 5283-5288 (2017).</li>
<li>Complainville, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nodule+initiation+involves+the+creation+of+a+new+symplasmic+field+in+specific+root+cells+of+medicago+species%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Nodule initiation involves the creation of a new symplasmic field in specific root cells of medicago species.</a> The Plant Cell. 15 (12), 2778-2791 (2003).</li>
<li>Bederska, M., Borucki, W., Znojek, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Movement+of+fluorescent+dyes+Lucifer+Yellow+%28LYCH%29+and+carboxyfluorescein+%28CF%29+in+Medicago+truncatula+Gaertn.+roots+and+root+nodules%5BTitle%5D)+AND+%22Symbiosis%22%5BJournal%5D)">Movement of fluorescent dyes Lucifer Yellow (LYCH) and carboxyfluorescein (CF) in Medicago truncatula Gaertn. roots and root nodules.</a> Symbiosis. 58 (1-3), 183-190 (2012).</li>
<li>Robards, A. W., Lucas, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmodesmata%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Plant+Physiology+and+Plant+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Plasmodesmata.</a> Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 41 (1), 369-419 (1990).</li>
<li>Roberts, A. G., Oparka, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmodesmata+and+the+control+of+symplastic+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Plant%2C+Cell+%26+Environment%22%5BJournal%5D)">Plasmodesmata and the control of symplastic transport.</a> Plant, Cell & Environment. 26 (1), 103-124 (2003).</li>
<li>Duckett, C. M., Oparka, K. J., Prior, D. A. M., Dolan, L., Roberts, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dye-coupling+in+the+root+epidermis+of+Arabidopsis+is+progressively+reduced+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Dye-coupling in the root epidermis of Arabidopsis is progressively reduced during development.</a> Development. 120 (11), 3247-3255 (1994).</li>
<li>Palevitz, B. A., Hepler, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+dye+coupling+of+stomatal+cells+of+Allium+and+Commelina+demonstrated+by+microinjection+of+Lucifer+yellow%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Changes in dye coupling of stomatal cells of Allium and Commelina demonstrated by microinjection of Lucifer yellow.</a> Planta. 164 (4), 473-479 (1985).</li>
<li>van Bel, A. J. E., Kempers, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Symplastic+isolation+of+the+sieve+element-companion+cell+complex+in+the+phloem+of+Ricinus+communis+and+Salix+alba+stems%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Symplastic isolation of the sieve element-companion cell complex in the phloem of Ricinus communis and Salix alba stems.</a> Planta. 183 (1), 69-76 (1991).</li>
<li>Erwee, M. G., Goodwin, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Symplast+domains+in+extrastelar+tissues+of+Egeria+densa+Planch%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Symplast domains in extrastelar tissues of Egeria densa Planch.</a> Planta. 163 (1), 9-19 (1985).</li>
<li>Oparka, K. J., Prior, D. A. M., Wright, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Symplastic+communication+between+primary+and+developing+lateral+roots+of+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">Symplastic communication between primary and developing lateral roots of Arabidopsis thaliana.</a> Journal of Experimental Botany. 46 (2), 187-197 (1995).</li>
<li>Christensen, N. M., Faulkner, C., Oparka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+Unidirectional+Flow+through+Plasmodesmata%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Evidence for Unidirectional Flow through Plasmodesmata.</a> Plant Physiology. 150 (1), 96-104 (2009).</li>
<li>Wróbel-Marek, J., Kurczyńska, E., Płachno, B. J., Kozieradzka-Kiszkurno, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+symplasmic+domains+in+the+embryo+and+seed+of+Sedum+acre+L.+%28Crassulaceae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Identification of symplasmic domains in the embryo and seed of Sedum acre L. (Crassulaceae).</a> Planta. 245 (3), 491-505 (2017).</li>
<li>Liang, D., White, R. G., Waterhouse, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+silencing+in+Arabidopsis+spreads+from+the+root+to+the+shoot%2C+through+a+gating+barrier%2C+by+template-dependent%2C+non-vascular%2C+cell+to+cell+movement%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Gene silencing in Arabidopsis spreads from the root to the shoot, through a gating barrier, by template-dependent, non-vascular, cell to cell movement.</a> Plant Physiology. 159 (3), 984-1000 (2012).</li>
<li>Radford, J. E., White, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+tissue-preparation-induced+callose+synthesis+on+estimates+of+plasmodesma+size+exclusion+limits%5BTitle%5D)+AND+%22Protoplasma%22%5BJournal%5D)">Effects of tissue-preparation-induced callose synthesis on estimates of plasmodesma size exclusion limits.</a> Protoplasma. 216 (1-2), 47-55 (2001).</li>
<li>Kollist, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Responses+to+Abiotic+Stress%3A+Priming+the+Landscape+for+the+Signal+Transduction+Network%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Rapid Responses to Abiotic Stress: Priming the Landscape for the Signal Transduction Network.</a> Trends in Plant Science. 24 (1), 25-37 (2019).</li>
<li>Haupt, S., Duncan, G. H., Holzberg, S., Oparka, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+Symplastic+Phloem+Unloading+in+Sink+Leaves+of+Barley%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Evidence for Symplastic Phloem Unloading in Sink Leaves of Barley.</a> Plant Physiology. 125 (1), 209-218 (2001).</li>
<li>Botha, C. E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+xylem+sap+retrieval+pathway+in+rice+leaf+blades%3A+evidence+of+a+role+for+endocytosis%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">A xylem sap retrieval pathway in rice leaf blades: evidence of a role for endocytosis?</a> Journal of Experimental Botany. 59 (11), 2945-2954 (2008).</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

מחקרים מתעוררים הראו כי הצמחים יכולים להגיב במהירות לגירויים חיצוניים23, כולל מניפולציה הציג את ההליכים הניסיוניים22. בניסוי הראשוני שלנו, הפיקוח שלנו על ידע זה מוביל לעיתים קרובות להצביעת הכישלון. עם שיעורים אלה, אנו מציעים כי אמצעי הזהירות הבאים יש לזכור בעת ביצוע ניסוי זה: (1) את הזרעים לאחר הקציר יש לשמור בארון אחסון מוגדר טמפרטורה נמוכה לחות נמוכה; (2) מניפולציה של צמחים, במיוחד את החשיפה לאוויר בארון, יש לשמור על זמן מינימלי; (3) התנאים הניסיוניים צריכים להישמר באופן ...

מכוניות פלורסנט רבים עם מגוון רחב של תכונות ספקטרליות, כגון 5 (6)-carboxyfluorescein (CF)1, 8-הhydroxypyrene-1, 3, 6-חומצה טריגופרתית2, לוציפר צהוב CH (lych)3, esculin ו-cter4, פותחו ו מוחל בצמחים כדי לפקח על התנועה באופן סימטרי ופעילות שיפה. באופן כללי, צבע סימטרי מוטען לחתוך ברקמת היעד ואת הפיזור רציפים של הכתב לתוך חלקים אחרים של הצמח יהיה להדגים את התקשורת הבין-תאית. למרות המנגנון של ספיגת הצבע אינו מובן במלואו, העיקרון הבסיסי התנועה CF בתוך תאים חיים כבר הודה נרחב. הצורה אסתר של CF (CF diacetate, CFDA) הוא לא פלורסנט, אבל ממברנה חדיר. מאפיין זה מאפשר דיפוזיה הממברנה המהירה של הצבע לתאים. פעם בתוך תאים חיים, תאיים מוחק להסיר את הקבוצות אצטט ב 3 ' ו 6 ' מיקום של CFDA, שחרור פלורסנט ו-הממברנה ממברנה-CF (איור 1, לחילופין להפנות את רייט et al.2); CF לאחר מכן יכול לעבור דרך פלמודסמאטה לחלקים אחרים של צמחים.
הליך מבוסס היטב עם cfda הוא שזה יכול להיות טעון לתוך עלי מקור ומשמש כדי לפקח על הזרמת שיפה ו לפרוק שיפה ברקמות הכיור של מינים רבים, למשל, כמו הפריקה CF ב arabidopsis שורש5, לפרוק שיפה במהלך לקות תפוחי אדמה6, הפריקה שיפה ב טבק כיור עוזב7, וכן הלאה. לפי גישות העמסה דומות, אימצו מחקרים אחרים את הצבע כדי להדגים את הקשר הסימטרי בין הפונדקאי לטפיל8,9, או כדי לחשוף את יחסי הסימביוזה10,11.
דרך נוספת לעשות שימוש בצבע זה היא לטעון אותו לתוך תאים ספציפיים או תא בודד על-ידי הזרקה כדי לקבוע את דפוס ההפצה שלה. טכניקות מתוחכמות כאלה הקלו מאוד את ההבנה העמוקה יותר של התקשורת הבינתאית בתחום הפלסטימאטה, בעיקר בפיתוח הקונספט של הדומיין הסימטרי12,13. לדוגמה, המיקרו ההזרקה של CFDA לתוך תאים cotyledon של Arabidopsis הביא דפוס צימוד לצבוע באפידרמיס היפוקטיל אבל לא צימוד בתאים הבסיסיים או באפידרמיס השורש, ולכן ההיפוטיל היפוקתא צורות האפידרמיס בתחום הפלסטיק הסימטרי14. תחומים דומים, כגון התאים לשמירה על שיניים15, מסננת הגוף תאים16, שיער בתאי השורש14 וכיפה שורש17,18 זוהו על ידי טכניקה microinjection. באופן מפתיע, מספר תחומים מאפשרים למולקולות מעקב לנוע בכיוון מסוים. קח את התחום יונקת למשל, מיקרוהזרקה של בדיקה פלורסנט לתוך התא באפידרמיס התומך מוביל את זרימת מעקב לתוך התחום יונקת, עם זאת, הזרקת הפוכה אינה מחזיקה true19. הדו ח האחרון מצא גם מצבים דומים בתחומים סימטרי של העובר Sedum 20. כך, כל המקרים לעיל לרמוז כי החלפת אתרי טעינה עלול להוביל תובנות הרומן לתוך תקשורת סימטרית. הניסוי הקודם שלנו במטרה לנתח את המסלול של שורש לירות נייד להשתקה זיהה תחום הרומן סימטרי, או HEJ (היפוקטיל צומת אפיטיל) אזור, אשר נבדק עוד באמצעות טעינת השורש (לא קאנוני כיור הטעינה) CFDA . ניסוי21 כאן, אנו עוד להרחיב את התנועה שורש-to-לירות CF באמצעות שיטה פשוטה לשחזר את תחום הפוטנציאל סימטרי פלסטיק על ידי העברת אתרי הטעינה. יתר על כן, הליך זה עשוי להיות מותאם כדי להבדיל את הרקע הגנטי, כי יש שינוי בסיס לירות הובלה ארוכת טווח.

<table><tbody><tr><td>KNO3&nbsp; &nbsp;</td><td>ריאגנט כימי של סינופארם</td><td>10017218</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4&nbsp;</td><td>מגיב כימי סינופארם</td><td>10017608</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4&middot; 7H2O</td><td>מגיב כימי סינופארם</td><td>10013018</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2&middot; 2H2O</td><td>מגיב כימי סינופארם</td><td>20011160</td><td></td></tr><tr><td>MnSO4&middot; H2O&nbsp;</td><td>ריאגנט כימי של סינופארם</td><td>10013418</td><td></td></tr><tr><td>Na2MoO4&middot; 2H2O</td><td>מגיב כימי סינופארם</td><td>10019818</td><td></td></tr><tr><td>חומצה בורית</td><td>מגיב כימי סינופארם</td><td>10004818</td><td></td></tr><tr><td>ZnSO4&middot; 7H2O</td><td>מגיב כימי סינופארם</td><td>10024018</td><td></td></tr><tr><td>CuSO4&middot; 5H2O</td><td>מגיב כימי סינופארם</td><td>10008218</td><td></td></tr><tr><td>CoCl2&middot; 6H2O</td><td>מגיב כימי סינופארם</td><td>10007216</td><td></td></tr><tr><td>KI</td><td>מגיב כימי סינופארם</td><td>10017160</td><td></td></tr><tr><td>FeSO4&middot; 7H2O</td><td>מגיב כימי סינופארם</td><td>10012118</td><td></td></tr><tr><td>EDTA&nbsp;</td><td>מגיב כימי סינופארם</td><td>10009717</td><td></td></tr><tr><td>מגיב כימי NaOH</td><td>סינופארם</td><td>10019718</td><td></td></tr><tr>מגיב כימי<td>KOH</td><td>סינופארם</td><td>10017018</td><td></td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>מגיב כימי סינופארם</td><td>10021418</td><td></td></tr><tr><td>מיו-אינוזיטול&nbsp; &nbsp;</td><td>MACKLIN</td><td>I811835</td><td></td></tr><tr><td>חומצה ניקוטינית&nbsp;</td><td>מקלין</td><td>N814565</td><td></td></tr><tr><td>פירידוקסין הידרוכלוריד מקלין</td><td></td><td>V820447</td><td></td></tr><tr><td>תיאמין הידרוכלוריד מקלין</td><td>T818865</td><td></td><td></td></tr><tr><td>גליצין</td><td>מקלין</td><td></td> G800880 <td></td></tr><tr><td>אבקת אגר</td><td>מיקרוסקופ</td> פלואורסצנטי נובון <td>ZZ14022</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Zeiss</td><td>Axio Zoom V16</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ מנתח</td><td>SDPTOP</td><td>SRE-1030</td><td></td></tr><tr><td>200&mu; l פיפטה</td><td>מכשירי מעבדה דרקון</td><td>713111110000-20-200ul</td><td></td></tr><tr><td>2.5&mu; l פיפטה</td><td>אפנדורף</td><td>3120000011</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים עדינים&nbsp;</td><td>פינצטה</td><td>ST-15</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>PARAFILM</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>להב דו צדדי נירוסטה</td><td>Gillette</td><td>Platinum-Plus להב</td><td></td> דו-צדדי</tr></tbody></table>

שירי תנועה של cfda מעקב טעון ברקמות הכיור התחתון של arabidopsis

Shootward Movement of CFDA Tracer Loaded in the Bottom Sink Tissues of Arabidopsis

מעקב אחר באופן סימטרי 5 (6)-carboxyפלואורוסקופים diacetate (cfda) כבר הוחל באופן נרחב בצמחים חיים כדי להדגים את החיבור התרבות, התחבורה שיפה ובדיקה כלי הדם. פרוטוקול זה מציג את החלק התחתון למעלה carboxyfluorescein (CF) תנועה ב Arabidopsis באמצעות חיתוך השורש ואת הליך ההיפוקטיל-צובט בהתאמה. אלה שני הליכים שונים התוצאה יעילות שונה של התנועה CF: כ 91% המראה של CF ב נצרי עם הליך ההיפוטיל-צובט, ואילו רק כ 70% המראה של CF עם הליך גזירה השורש. שינוי פשוט של אתרי טעינה, וכתוצאה מכך שינויים משמעותיים ביעילות הניידת של צבע זה באופן סימטרי, מציע התנועה CF עשוי להיות כפוף לתקנה באופן סימטרי, כנראה על ידי צומת השורש-היפוטיל.

התנועה הסימטרית כפופה לעיתים קרובות לתנודות סביבתיות. הפרטורציה של המדינה גדל הצמח, ואפילו את התהליך של הכנת רקמות ישפיע על הגבלת גודל הדרה של פלמודמאטה, ובכך להשפיע על התחבורה הסימטרית22. כדי לשפר את היעילות מכתים, אנו להגביל את הפעולה שלנו בחדר הגידול, שבו הטמפרטורה והלחות נשלטת בחוזקה, וגם לבצע את ההליך כולו מהר ככל האפשר (באופן אידיאלי בתוך 10-15 דקות לאחר הרמת מכסה של צלחת פטרי). אמצעי זהירות אלה במהלך ניסוי יכול להפחית ביעילות את שיעורי הצביעת לירות לא מוצלח....

המטרה של פרוטוקול זה היא להראות כיצד לטעון את ה-CFDA לאתרים שונים של החלקים התחתונים של Arabidopsis. לאחר מכן אנו מציגים את דפוס ההתפלגות שהתקבל של CF ב נצרי.

שירי תנועה של CFDA מעקב טעון ברקמות הכיור התחתון של Arabidopsis

The symplastic tracer 5(6)-carboxyfluorescein diacetate (CFDA) has been widely applied in living plants to demonstrate the intercellular connection, ...

CFDA בדיקה בשימוש נרחב, או קצר עבור ניקוד carboxyfluscein, הוא לא פלואורסצנטי. שתי קבוצות H3 והמיקום של 3'6 'על תרכובת זו להפוך אותו ממברנה-permeant. כאשר פעם אחת בתוך תאים, אצטטים הסלולר הפנימי יסיר את קבוצות אצטט ולשחרר את הצורה החדשה של CFDA.זה קרבוקסיפלורסצ'ין, או CF, שהוא פלואורסצנטי. ומכיוון שהצורה החדשה הזו פחות ממברנה- חדירה, המשקל, כל התאים הם לנוע דרך הנקבוביות הבין-תאיות, או הפלסמודוסמטה בצמחים, זה גורם לניקוד הזה לגרד את החללית האידיאלית לחקר תחבורה בין תאית בפעילות פלואם. בסרטון של היום, אנחנו הולכים להדגים את טעינת CFD לשורש והיפוקוטיל של הצמחים Arabidopsis, בהתאמה, ואנחנו נראה איך שני הליכים שונים במקצת ישפיעו על התנועה מלמטה למעלה של בדיקה פלואורסצנטי זה.השג תוצאות מכתמות באופן עקבי, אנו מאחסנים את זרעי Arabidopsis שנקטפו בארבע מעלות צלזיוס, 40% ארון לחות. זרעים שנקצרו לאחרונה המאוחסנים במצב זה במשך יותר משבעה ימים משמשים בקלות לזרוע. כדי להבטיח שכל צמח גדל בחלל דומה יחסית בצלחת פטרי, אנו משתמשים בכרטיס כיתה אזור זרע.עכשיו, מרטיבים את הקצה הסטרילי, טובלים בזרעים הסטריליים וזורעים את הזרעים בזה אחר זה על העמדה המיועדת. לאחר סיום זריעה, לאטום את צלחת פטרי עם parafilm וקלטת דביקה, לשים אותם על דוכן צלחת פטרי כדי לאפשר לו לגדול אנכית. הנה הכלים שבהם נשתמש בניסוי הזה.שים לב שכדאי שנטען את הצבע מהר ככל האפשר. בדרך כלל, אתה מסיים את כל התהליך תוך 10 עד 15 דקות. לפני שאנו מבצעים את ניסוי הטעינה CFDA, אנחנו תמיד מכינים פתרון CFDA טרי.כאן, לדלל את CFDA מילימולר אחד לתוך ריכוז micromolar חמישה עם מים לפני השימוש מיד. חותכים את הפרפילם לחתיכות קטנות בגודל של שלושה על שלושה מילימטרים. מכיוון שיש עיבוי על המכסה והתחתית של צלחת פטרי, אנחנו צריכים לנקות אותם עם מגבת נייר, כדי למנוע צבע זורם מסביב.חתיכת פרפילם קטנה מושם מתחת לשורש. להרים את הצמחים ולשים אותם על המכסה. חותכים את השורשים בערך 5 עד 10 מילימטר מתחת להיפוקוטיל.קח את היורה בחזרה על חתיכות קטנות של פרפילם. עכשיו בזהירות להחיל CFDA microliter אחד על קצה החיתוך של השורש. נסו להימנע מזיהום כל פרוטו-צמחים.ואז לכסות את המכסה, ולאחר מכן להשאיר אותם בחדר הצמיחה במשך שעתיים. שיטת צביטת היפוקוטיל. חתיכת הפרפילם הקטנה, כפי שהוכן בעבר, נמצאת מתחת לצומת השורש-היפוקוטיל.אנו משתמשים בעיקול כדי לצבוט בעדינות את ההיפוקוטיל קרוב לרקמת השורש, ולהחיל בזהירות CFDA מיקרוליטר 0.1 על הצד הצבט ולהשאיר את הצמח במשך שעתיים. התמונות מתשע עד 12 יום לאחר צמחים מכתימים אזור. כולם מראים את דפוס הכתמת כלי הדם הן בקוטילדונים והן בעלים האמיתיים.רק במקרה נדיר מאוד, עלה הקוטילדון הראה דפוס הכתמה של חצי עלים. אז בעצם, שתי השיטות לא עשו את ההבדל בדפוס הכתמים CF, אולם אם אנו מבצעים טעינת צבע לתוך יותר ויותר צמחים, אנו מוצאים את שני ההליכים לתת עסקה הבדל משמעותי ביעילות. בשיטת חתך השורש, כ-70% מהצמחים מראים את האות הפלואורסצנטי בצילומים.אבל ניתן להגדיל את היעילות ל-91% באמצעות שיטת צביטת ההיפוקוטיל. ניסינו גם את שיטת צביטת השורש, אבל שיטה זו לגרום ליעילות נמוכה עוד יותר, זה בערך 30%לכן, נראה שהדרך לטעון את הצבע אינה לוקחת בחשבון את הפרש הכתמים. ההבדל טמון ככל הנראה באתרי הטעינה, שעשויים להיות מופרדים על ידי מחסום סימפלסטי.הראינו איך אנחנו מעמיסים את ה-CFDA לשורשי Arabidopsis והיפוקוטיל. השתמשנו בשני הליכים שונים במקצת, ושני הליכים שונים במקצת אלה גורמים להבדל משמעותי בתנועת בדיקה זו מלמטה למעלה. אנו מציעים כי שיטה זו יכולה לעזור לנו לזהות מחסום סימפסטי פוטנציאלי עבור אותות ירי שמקורם שורש.

shootward-movement-cfda-tracer-loaded-bottom-sink-tissues

Research

JoVE Journal

Environment

סביבה

הבסיס המולקולרי של מרחבי ספציפי התגובות phytochrome נחקרת באמצעות הצמחים הטרנסגניים כי התערוכה רקמות איברים ספציפיים ליקויים phytochrome. הבידוד של תאים ספציפיים מציג המושרה דלדול chromophore phytochrome על ידי תא הקרינה המופעל מיון ואחריו מנתח microarray הוא מנוצל כדי לזהות גנים המעורבים מרחבית ספציפית התגובות phytochrome.

חקירת רקמות ו איברים ספציפיים התגובות Phytochrome באמצעות FACS בסיוע נייד מסוג פרופיל ביטוי ספציפי ארבידופסיס thaliana</em

הסחר בין Macromolecular בתאי צמח ניתן להעריך על ידי transiently לבטא חלבון fluorescently-tagged עניין וניתוח ההפצה התוך ואת אינטר שלה על ידי מיקרוסקופיה confocal.

תא אל תא Macromolecular התחבורה Assay ב Planta ניצול ההפגזה Biolistic

אנו מתארים את השימוש perfluorodecalin כמדיום הרכבה infiltrative. זוהי שיטה פשוטה לשיפור עומק...

שיטה פשוטה הדמיה ארבידופסיס מותיר שימוש Perfluorodecalin כנושאת הדמיה Infiltrative

ניתוח ספציפי של תא<em&gt; ארבידופסיס</em&gt; עלים באמצעות מיון תא הופעל פלואורסצנטי

מאמר זה מספק פרוטוקול לגידול שתילים של ארבידופסיס ב RootChip, פלטפורמת הדמיה microfluidic המשלבת שליטה אוטומטית של תנאי הגידול עם מעקב שורש מיקרוסקופי ו להתרגז על בסיס מדידת רמות מטבוליט תאיים.

זמן לשגות דימות פלואורסצנטי של צמיחה רוט ארבידופסיס עם מניפולציה מהירה של הסביבה רוט שימוש RootChip

איתות 2 + Ca מסדירה תהליכים ביולוגיים מגוונים בצמחים. כאן אנו מציגים גישות לניטור לחץ אביוטי המושרה Ca מרחב ובזמן 2 + אותות בתאי ארבידופסיס ורקמות באמצעות Ca 2 + אינדיקטורים מקודד גנטי Aequorin או Case12.

מדידת מרחב ובזמן Ca 2 + אותות בצמחים ארבידופסיס

אנחנו מדווחים על שיטה פשוטה רב-תכליתי לביצוע פלורסנט לחיות-הדמיה של עלים תודרנית לבנה על פני תקופה ארוכה של זמן. אנו משתמשים צמח תודרנית הטרנסגניים לבטא גן כתב פלורסנט תחת השליטה של יזם הקשורות חסינות כדוגמה להשגת הבנה ייתכן של תגובות חיסוניות הצמח.

שיטה רב-תכליתי עבור הרכבה תודרנית יוצא Intravital הדמיה בצילום מואץ

מתרגם הריבוכמה אהדה (מלכודת) מציעה את האפשרות לנתח תוכניות התפתחותיות עם עיבוד מינימלי של איברים ורקמות. הפרוטוקול מניב RNA באיכות גבוהה מתאים המיועדים עם חלבון פלורסנט ירוק (GFP)-יחידת משנה ריבוזומבית. כלים לניתוח במורד הזרם, כגון רביעיית-PCR או RNA-seq, חושפים פרופילי ביטויים ספציפיים לסוג תאים.

מתרגם הריבוכמה אהדה לטיהור (מלכודת) כדי לחקור את התפתחות השורש של הספר הבסיסי בקנה מידה ספציפי לסוג תא

איתות סידן מערכתי המופעל על ידי גלוטמט חוץ-תאי הוא קריטי לגיוס תגובות הגנת הצמח לפצעים מכניים ולתקפת אוכלי עשב בצמחים. מאמר זה מתאר שיטה לדמיין את הדינמיקה המרחבית והטמפורלית של שני גורמים אלה באמצעות צמחי תאליאנה ערבידופסיס המבטאים ביוסנסורים פלואורסצנטיים רגישים לסידן וגלוטמט.

שדה רחב, הדמיה בזמן אמת של אותות פצע מקומיים ומערכתיים ב Arabidopsis

מספר שיטות נפוצות מוצגות כאן כדי לחקור את אירועי הסחר בקרום של קולטן פלזמה קינאז. כתב יד זה מתאר פרוטוקולים מפורטים הכוללים את הכנת החומר הצמחי, טיפול תרופתי ומערך הדמיה קונפוקלית.

שיטות מבוססות תמונה לחקר אירועי סחר בממברנות בתאי שושלת סטומאטלית

חקור מנגנוני תחבורה בין-תאית בצמחים באמצעות טעינת CFDA לשורשים ולהיפוקוטיל של Arabidopsis. השיטה מאפשרת הדמיית תבניות הפצה של carboxyfluorescein וחקר פעילות הפלואם.

שירי תנועה של CFDA מעקב טעון ברקמות הכיור התחתון של Arabidopsis

גלה סרטונים נוספים