שיטת העברת שריטות וחדר מתקפל לחלל מתורבת בניתוח Vivo של ריפוי פצעים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור התיקון שריטות מבחנה באמצעות הפיברוכדורים העיקריים עבור vivo העור הפצע הריפוי הטיפול בעכברים. שניהם מספר שיטות ברורות כדי להעריך בתוך מבחנה וריפוי פצעים vivo.

הצורך המורדים לטיפול בפצעי עור. כדי לזהות את מולקולות היעד שלך לטיפולים תרופתיים, מערכות בדיקה במבחנה ו- in vivo נדרשות. המערכות המתאימות הן מוצ"ש השריטה במבחנה, ותא קיפול העור הגבי in vivo.

שניהם הליכים ישר קדימה לניטור נדידת תאים וריפוי פצעי עור, בהיעדר נוכחות של תרכובות פעילות פרמקולוגית. למרות ששתי הטכניקות הן ישר קדימה, החוקרים צריכים לתרגל את יישום השריטה. ואת העור הגבי לקפל את התא השתלה, ופצע כדי להשיג תוצאות אמינות לשחזור.

הדגמת ההליכים תב נעשה על ידי ד"ר מתיאס לאשקה, מנתח ופרופסור מהמכון לכירורגיה קלינית וניסיונית. לפני תחילת ההליך, השתמש בסמן קבוע דק במיוחד כדי לסמן לוח אחד של שש היטב לכל סוג תא, עם קו אופקי בתחתית כל באר כדי לסמן את אזור השריטה עבור כל תרבות. תקיעות הסיבים הראשיות של הצלחת הבאה מבודדות מסוג פראי ובטא 3 עכברים לקויים, בצלחת שש בארות ב 5 פעמים 10 כדי תקיעות סיבים החמישי לכל ריכוז היטב.

ב 2mL של DMEM בתוספת 10% סרום חזיר עוברי. סמן את הלוחות עם סוג התא, הסוג והתאריך. ולמקום את הצלחות באינקובטור תרבות התא במשך 24 שעות.

למחרת בבוקר להוסיף 9 ליטרים של כל דם מבוסס transfection reagent של עניין, לצינורות מיקרו צנטריפוגה בודדים המכילים 150 מיקרו ליטר של מדיום סרום מופחת לכל צינור. הוסף 1.5 ליטרים של siRNA לצינור מיקרו צנטריפוגה שני לכל ריאגנט transfection המכיל 150 מיקרו ליטר של מדיום סרום מופחת לכל צינור. ומערבבים כל פתרון siRNA עם צינור יחיד של פתרון ריאגנט transfection.

לאחר מערבולת קצרה מניחים את תערובות ב 21 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות. במהלך הדגירה בזהירות להחליף את supernate בכל באר. עם 2.25 מ"ל של תרבות טרייה בינונית בצד של בארות.

בסוף הדגירה להוסיף 250 מיקרו ליטר של תערובת reagent transfection siRNA המתאים, טיפה חכמה לתוך כל באר תואמת של תאים. ולהחזיר את הצלחות לאינקובטור תרבות התא במשך 72 שעות. כאשר התאים הגיעו ל- 100%confluency, השלך את התרבות על-טבעית מכל באר.

ולהשתמש טיפ פיפטה 200 מיקרו ליטר כדי ליצור שריטה במונוליאר התא confluent. אנכי לקו האופקי המסומן בתחתית כל באר. לאחר מכן לשטוף בזהירות כל פצוע גם 2 פעמים עם 2mL של PPS לכל לשטוף.

כדי להסיר את כל הגורמים ששוחררו מהתאים הפגועים, תאים רופפים או פסולת מהאזור שרוט. לאחר לשטוף השני להוסיף 2mL של תאים טריים תרבות בינוני בתוספת 1 או 10 אחוז סרום לכל באר. וללכוד תמונות של הפצעים בכל צלחת על הבמה של מיקרוסקופ אור.

מיד לאחר גירוד בהגדלה של פי 10. ואז להחזיר את הצלחת לאנקובטור תרבות התא. ממשיך ללכוד תמונות בנקודות הזמן הניסיוניות המתאימות במשך 30 השעות הבאות.

בסוף הניסוי לכמת את האזור הראשוני ללא תאים ואת האזור הנותר לאחר 6, 10 ו 30 שעות של תרבות. כדי לקבוע את אחוז אזור האחסון מחדש של האחסון מחדש על-ידי התאים הנודדים ביחס לאזור האחסון ההתחלתי של האחסון. לאחר אישור חוסר תגובה לצביטת בוהן, בסוג הפראי או בטא שלוש נוקאאוט C57 שחור שישה עכבר, בזהירות לגלח את הגב.

ולהחיל משחה על עיניו של החיה. החל קרם depilatory כדי לחסל את כל השיער שנותר. הסרת השמנת לאחר 10 דקות.

כדי להכין את תא טיטניום, לתקן חלק אחד של מסגרת תא טיטניום סימטרי, עם ברגים חיבור עם אגוזים. כדי לשמור על 400 עד 500 מיקרומטר בין שני החלקים הסימטריים של התא. כדי למנוע דחיסה של וריתי הדם בעור.

לחטא את העור החשוף עם 70% אתנול. ולתפוס קפל עור מול מקור אור. מקם את הקו האמצעי של השכבה הכפולה של העור למקום שבו יושתל תא הטיטניום.

ולתקן בקרניות וב סיבתיות את קפל העור בתפר פוליפרופילן. הדק את הצד השני של התפר על מתלה מתכת כדי להרים את העור המקופל. ולהתאים את גובה המדף כדי לאפשר לעכבר לשבת בנוחות.

תפר את המסגרת הראשונה של תא טיטניום על ידי תפרים פוליפרופילן על קצה מעולה על החלק האחורי של קפל העור הגבי. לאחר אישור מחדש של סם דם השתמש במספריים עדין כדי לבצע חתכים קטנים בעור. ולהעביר את שני הברגים המחברים המחוברים למחצית הראשונה של תא הטיטניום דרך בסיס קפל העור.

מוציאים את העכבר מהמדף וממקם את החיה במצב משני. מניחים את החצי השני של תא טיטניום על גבי 3 ברגים מחברים. וגם ידנית להפעיל לחץ קל להעביר ברגים אלה דרך המחצית השנייה של מסגרת טיטניום.

שכבת העור המקופלת דחוקה כעת בין שני החצאים הסימטריים של מסגרת הטיטניום. ואז לתקן את שני החלקים הסימטריים עם אגוזי נירוסטה. באמצעות אגרוף ביופסיה בקוטר 2 מ"ל, סמן את אזור הפצע במרכז העור, בתוך חלון התצפית של תא קפל העור.

ולהשתמש מטסות ומספריים עדין כדי להסיר את האפידרמיס כולו ודרמיס בתוך הסימן. כדי ליצור פצע עגול. נקה את 3 וחצי ל 4 וחצי מילומטר מרובע פצע עם 0.5mL של תמיסת מלח סטרילית.

ולכסות את הפצע עם כיסוי זכוכית. השתמש צבת טבעת הצמד על תא טיטניום כדי לתקן את כיסוי במקום. ומיד להעביר את העכבר לשלב ההדמיה של סטריאומיקרוסקופ.

ואז תדמיין את הפצע בהגדלה של פי 40. לפני הנחת העכבר לתוך כלוב עם ניטור עד החלמה מלאה. לאחר יצירת שריטה באמצעות קצה פיפטה 200 מיקרו ליטר כפי שהודגם, בניסוי מייצג זה, תאים משני genotypes היגרו לאזור השריטה וסגר את הפער.

לאחר מכן, העברת התאים כומתה כאחוז אזור האחסון מחדש על-ידי העברת תאים 6 שעות לאחר ביצוע הטיוטה. לדוגמה בניסוי זה העברת Cav beta 3 פיצוצי סיבים לקויים סגרה את אזור השריטה באופן משמעותי מוקדם יותר מאשר תקיעות סיבים מעכברים מסוג בר. כדי לאשר את האפקט התלוי Cav beta 3 נצפתה Cav beta 3 תקיעות סיבים לקוי, תקיעות סיבים מסוג בר נותבו עם siRNA למטה לווסת את בטא Cav 3 חלבון.

תקיעות סיבים שטופלו בבטא Cav 3 siRNAs ספציפיים התנהגו כמו תקיעות סיבים לקויות של בטא 3. כדי להשוות את ריפוי פצעי העור בין שני הגנוטיפים, אזור הפצע בתא קפל העור צולם מיד לאחר הפציעה. והפצע תדמית במהלך השבועיים הבאים.

מידות הפצעים נמדדו בתמונות ובתחום הפצעים, ביום נתון, בא לידי ביטוי כאחוז מאזור הפצע הראשוני. כצפוי, קצב סגירת הפצעים הוגדל בעכברים לקויים של Cav beta 3 בהשוואה לפקדים מסוג פראי. הקפד להפעיל לחץ שווה על קצה פיפטה, עבור כל שריטה כדי להתאים את השריטות על הקווים המסומנים בתחתית הצלחת מקרוב ככל האפשר.

חלון התצפית של תא קיפול העור הגבי ניתן לפתוח בכל עת במהלך תהליך הריפוי. המאפשר את היישום אקטואלי של תרכובות פרמקולוגיות פעילות שונות. ניתן גם למלמל את האזור הפצוע בשלבים שונים של תהליך הריפוי.

לניתוח ביוכימי או היסטולוגי של חלבונים מולקולריים.