Name: שיטת העברת שריטות וחדר מתקפל לחלל מתורבת בניתוח Vivo של ריפוי פצעים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 34 s
Description: למד שיטות מעבדה וחיות לבדיקת ריפוי פצעי עור, כולל מבחן שריטות בתאי פיברובלסטים וחדר עור מתקפל בעכברים. הטכניקות מאפשרות הערכת תרופות ומנגנוני נדידת תאים בביולוגיה של ריפוי פצעים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לד ר פטרה וייסגרבר ויחידת הטרנסגנים של מתקן בעל חיים SPF (פרויקט P2 של SFB 894) של הפקולטה לרפואה ומתקן בעלי חיים במכון לכירורגיה קלינית וניסויית בפקולטה לרפואה של אוניברסיטת זארלנד, באד ומבורג. אנחנו מודים לד ר אנדראס בק. על קריאה קריטית בכתב היד מחקר זה מומן על ידי הגרמני הפורשיגומיייסמייססביםבבריזאג (DFG) Sonderforschsברםץ (SFB) 894, פרויקט A3 כדי א יהושע ו V.F.).

<ol><li>Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound+repair+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Wound repair and regeneration.</a> Nature. 453, 314-321 (2008).</li>
<li>Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound+healing--aiming+for+perfect+skin+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Wound healing--aiming for perfect skin regeneration.</a> Science. 276, 75-81 (1997).</li>
<li>Gabbiani, G., Gabbiani, F., Heimark, R. L., Schwartz, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+actin+cytoskeleton+during+early+endothelial+regeneration+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Organization of actin cytoskeleton during early endothelial regeneration in vitro.</a> Journal of Cell Science. 66, 39-50 (1984).</li>
<li>Belkacemi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IP3+Receptor-Dependent+Cytoplasmic+Ca%282%2B%29+Signals+Are+Tightly+Controlled+by+Cavbeta3%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">IP3 Receptor-Dependent Cytoplasmic Ca(2+) Signals Are Tightly Controlled by Cavbeta3.</a> Cell Reports. 22, 1339-1349 (2018).</li>
<li>Breuing, K., Eriksson, E., Liu, P., Miller, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Healing+of+partial+thickness+porcine+skin+wounds+in+a+liquid+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Surgical+Research%22%5BJournal%5D)">Healing of partial thickness porcine skin wounds in a liquid environment.</a> Journal of Surgical Research. 52, 50-58 (1992).</li>
<li>Colwell, A. S., Krummel, T. M., Kong, W., Longaker, M. T., Lorenz, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+wounds+in+the+MRL%2FMPJ+mouse+heal+with+scar%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+and+Regeneration%22%5BJournal%5D)">Skin wounds in the MRL/MPJ mouse heal with scar.</a> Wound Repair and Regeneration. 14, 81-90 (2006).</li>
<li>Vagesjo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+wound+healing+in+mice+by+on-site+production+and+delivery+of+CXCL12+by+transformed+lactic+acid+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+National+Academy+of+Science%22%5BJournal%5D)">Accelerated wound healing in mice by on-site production and delivery of CXCL12 by transformed lactic acid bacteria.</a> Proceedings National Academy of Science. 115, 1895-1900 (2018).</li>
<li>Eming, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+wound+closure+in+mice+deficient+for+interleukin-10%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Accelerated wound closure in mice deficient for interleukin-10.</a> American Journal of Pathology. 170, 188-202 (2007).</li>
<li>Sorg, H., Krueger, C., Vollmar, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+insights+in+skin+wound+healing+using+the+mouse+dorsal+skin+fold+chamber%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">Intravital insights in skin wound healing using the mouse dorsal skin fold chamber.</a> Journal of Anatomy. 211, 810-818 (2007).</li>
<li>Laschke, M. W., Vollmar, B., Menger, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dorsal+skinfold+chamber%3A+window+into+the+dynamic+interaction+of+biomaterials+with+their+surrounding+host+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22European+Cell+and+Materials%22%5BJournal%5D)">The dorsal skinfold chamber: window into the dynamic interaction of biomaterials with their surrounding host tissue.</a> European Cell and Materials. 22, 147-164 (2011).</li>
<li>Trepat, X., Chen, Z., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Comprehensive+Physiology%22%5BJournal%5D)">Cell migration.</a> Comprehensive Physiology. 2, 2369-2392 (2012).</li>
<li>Hofmann, F., Belkacemi, A., Flockerzi, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+Alternative+Functions+for+the+Auxiliary+Subunits+of+the+Voltage-Gated+Calcium+Channels%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Molecular+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Emerging Alternative Functions for the Auxiliary Subunits of the Voltage-Gated Calcium Channels.</a> Current Molecular Pharmacology. 8, 162-168 (2015).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9, 676-682 (2012).</li>
<li>Chen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+4.1G+Regulates+Cell+Adhesion%2C+Spreading%2C+and+Migration+of+Mouse+Embryonic+Fibroblasts+through+the+beta1+Integrin+Pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Protein 4.1G Regulates Cell Adhesion, Spreading, and Migration of Mouse Embryonic Fibroblasts through the beta1 Integrin Pathway.</a> Journal of Biological Chemistry. 291, 2170-2180 (2016).</li>
<li>Dewor, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+migration+inhibitory+factor+%28MIF%29+promotes+fibroblast+migration+in+scratch-wounded+monolayers+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Macrophage migration inhibitory factor (MIF) promotes fibroblast migration in scratch-wounded monolayers in vitro.</a> FEBS Letters. 581, 4734-4742 (2007).</li>
<li>Handly, L. N., Wollman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound-induced+Ca%282%2B%29+wave+propagates+through+a+simple+release+and+diffusion+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Wound-induced Ca(2+) wave propagates through a simple release and diffusion mechanism.</a> Molecular Biology of the Cell. 28, 1457-1466 (2017).</li>
<li>Cappiello, F., Casciaro, B., Mangoni, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+In+Vitro+Wound+Healing+Assay+to+Evaluate+Cell+Migration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), 56825(2018).</li>
<li>Hernandez Vera, R., Schwan, E., Fatsis-Kavalopoulos, N., Kreuger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Modular+and+Affordable+Time-Lapse+Imaging+and+Incubation+System+Based+on+3D-Printed+Parts%2C+a+Smartphone%2C+and+Off-The-Shelf+Electronics%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A Modular and Affordable Time-Lapse Imaging and Incubation System Based on 3D-Printed Parts, a Smartphone, and Off-The-Shelf Electronics.</a> PLoS One. 11, 0167583(2016).</li>
<li>Reinhart-King, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell+adhesion+and+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell adhesion and migration.</a> Methods in Enzymology. 443, 45-64 (2008).</li>
<li>Treloar, K. K., Simpson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitivity+of+edge+detection+methods+for+quantifying+cell+migration+assays%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Sensitivity of edge detection methods for quantifying cell migration assays.</a> PLoS One. 8, 67389(2013).</li>
<li>Pirkmajer, S., Chibalin, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+starvation%3A+caveat+emptor%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Cell+Physioliology%22%5BJournal%5D)">Serum starvation: caveat emptor.</a> American Journal of Physiology-Cell Physioliology. 301, 272-279 (2011).</li>
<li>Papenfuss, H. D., Gross, J. F., Intaglietta, M., Treese, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transparent+access+chamber+for+the+rat+dorsal+skin+fold%5BTitle%5D)+AND+%22Microvascular+Research%22%5BJournal%5D)">A transparent access chamber for the rat dorsal skin fold.</a> Microvascular Research. 18, 311-318 (1979).</li>
<li>Deoliveira, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ear+punch+model+for+studying+the+effect+of+radiation+on+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Radiation+Biology%22%5BJournal%5D)">An ear punch model for studying the effect of radiation on wound healing.</a> International Journal of Radiation Biology. 87, 869-877 (2011).</li>
<li>Chen, L., Mirza, R., Kwon, Y., DiPietro, L. A., Koh, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+murine+excisional+wound+model%3A+Contraction+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+and+Regeneration%22%5BJournal%5D)">The murine excisional wound model: Contraction revisited.</a> Wound Repair and Regeneration. 23, 874-877 (2015).</li>
<li>Dunn, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+model+of+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiment%22%5BJournal%5D)">Murine model of wound healing.</a> Journal of Visualized Experiment. (75), e50265(2013).</li>
<li>Wahedi, H. M., Park, Y. U., Moon, E. Y., Kim, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Juglone+ameliorates+skin+wound+healing+by+promoting+skin+cell+migration+through+Rac1%2FCdc42%2FPAK+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+and+Regeneration%22%5BJournal%5D)">Juglone ameliorates skin wound healing by promoting skin cell migration through Rac1/Cdc42/PAK pathway.</a> Wound Repair and Regeneration. 24, 786-794 (2016).</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

בכתב יד זה, אנו מתארים בתוך מבחנה ובvivo הריפוי הפצע ולתאם את התוצאות שהתקבלו. עבור שיטת מחוץ גופית, השתמשנו בעכבר הראשי פיברופיצוצים4,14,15 אשר לשחק תפקיד חשוב בריפוי פצע ושיפוץ רקמה11. סוגים אחרים של תאים החסיד גדל כמו monolayers (למשל, תאים אפיתל, תאים אנדותל, keratinocytes) ניתן להשתמש גם. ציפוי באותו מספר של תאים קיימא ובריא להחיל את השריטה באותה מידה של השטף הוא בעל חשיבות עליונה על מנת להשיג תוצאות...

ריפוי בעור הפצע מתחיל מיד לאחר פגיעת העור כדי לשחזר את שלמות העור כדי להגן על האורגניזם מפני זיהומים. תהליך הריפוי בפצע עובר ארבעה שלבים חופפים; קרישה, דלקת, מבנה רקמות חדש ושיפוץ רקמות1. העברת תאים היא קריטית במהלך שלבים אלה. תאים דלקתיים, תאים חיסוניים, keratinocytes, תאים אנדותל, ופיברופיצוצים מופעלים בנקודות זמן שונות לפלוש לאזור הפצע2. שיטות לחקור ריפוי הפצע בתוך מבחנה ובvivo הם עניין גדול לא רק להבין את המנגנונים הבסיסיים אלא גם כדי לבדוק תרופות חדשות לפתח אסטרטגיות חדשות במטרה שפר ולהאיץ ריפוי פצע העור.
כדי לנטר ולנתח העברת תאים, ניתן להשתמש ביכולות העברת הטיוטה. הוא מכונה לעתים קרובות שיטת הריפוי של הפצע מתורבת. שיטה זו מחייבת מתקן תרבית תאים3. זהו הליך פשוט, אין צורך של ציוד high-end ואת הטיפול ניתן לבצע ברוב מעבדות ביולוגיה התא. בצורה זו, שטח נטול תאים נוצר על-ידי הפרעה מכנית של מונאולייר תא מאגד, רצוי לתאים אפיתל או לתאי האנדותל. תאים בשולי השריטה יועברו כדי לאכלס מחדש את הפער שנוצר. הקוונפיקציה של האזור היורד ללא תא לאורך זמן דומה לקצב ההעברה ומציין את הזמן, אשר התאים צריכים לסגור את הפער. למטרה זו, החוקרים יכולים להשתמש בתאים מבודדים בחריפות מעכברים WT או עכברים חסר גן של ריבית4, או תאים מונצח זמין ממאגרי תאים אמינים. שיטת הגירוד מאפשרת ללמוד את ההשפעה של תרכובות פעילות פרמקולוגית או השפעה של cDNAs או siRNAs בהעברת תאים.
ב vivo, ריפוי הפצע הוא תהליך פיזיולוגי מורכב, המחייב סוגי תאים שונים כולל keratinocytes, תאים דלקתיים, פיברותקיעות, תאים חיסוניים ותאי האנדותל כדי לשחזר את היושרה הפיזית של העור מהר ככל האפשר1 . שיטות שונות ללמוד בריפוי vivo פצעים פותחו ובשימוש בעבר5,6,7,8. תא העור המתקפל שמתואר במאמר זה שימש בעבר לריפוי הפצע בחני9. הוא משמש כהכנה לחדר השינה שהשתנה לעכברים. המודל הקאמרי המתוקן של העור יש מספר יתרונות. 1) זה ממזער את התכווצות העור, אשר מונע התבוננות בתהליך הריפוי הפצע עלול להשפיע על תיקון הפצע בעכברים. 2) החדר הזה עושה שימוש בכיסוי הפצע בעזרת שמיכות זכוכית, הפחתת דלקות רקמות והתייבשות, דבר שעלול לעכב את תהליך ההחלמה. 3) זרימת הדם והvascularization יכולים להיות מנוטרים ישירות. 4) זה מאפשר יישום מקומי חוזרות של תרכובות פעילים פרמקוולוגית וריאגנטים כדי לטפל בפצע ולהאיץ את הריפוי9,10.
זיהינו את β3 יחידת של ערוצי סידן מגודרת מתח גבוה (Cavβ3) כמולקולה היעד הפוטנציאלי כדי להשפיע על ריפוי הפצע בעור באמצעות שני פרוטוקולים עצמאיים, כלומר, הגירה בלתי מתורבת ההגירה והוא במודל הקאמרית הvivo. עבור שיטת מחוץ גופית, השתמשנו בגידולים הראשוניים, תאים אלה מבטאים את Cacnb3 Gene קידוד Cavβ3 חלבון אבל חסר depolarization המושרה ca2 + זרם או תלוי מתח ca2 + זרמים. תיארנו פונקציה הרומן של Cavβ3 בפיברופיצוצים אלה: Cavβ3 נקשר ל-אינוזיטול 1, 4, 5-trisp, שנאת קולטן (IP3R) ואילוצים שחרור סידן מתוך רשתית רשתית פלזמית. מחיקת הגן Cacnb3 בעכברים מוביל רגישות מוגברת של IP3R עבור IP3, הגירה תא משופר ומוגברת תיקון פצע העור4.

<table><tbody><tr><td>0.9% NaCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 מזרקים</td> BD <td>פלסטיפק</td><td>303172</td><td></td></tr><tr><td>6 בארות צלחת</td><td>קורנינג</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>ביופסיה אגרוף</td><td>Kai Industries</td><td>48201</td><td>2 מ"מ</td></tr><tr><td>Cacnb3 עכבר siRNA Oligo דופלקס (מזהה לוקוס 12297)</td> <td>Origene</td><td>SR415626</td><td></td></tr><tr><td>קרם</td><td></td><td></td> אפילציה <td>כל אפילציה קרם</td></tr><tr><td>Dexpanthenol 5% (BEPANTHEN)</td><td>Bayer</td><td>3400935940179.00</td><td>(BEPANTHEN)</td></tr><tr><td>Dihydroxylidinothiazine hydrochloride (Xylazine)</td><td>Bayer Health Care</td><td></td><td>Rompun 2%</td></tr> <tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Gibco by life technologies</td><td>41966-029</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר</td><td>עוברי Gibco by life technologies</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>משושה אגוז</td><td></td><td></td><td></td>מלא</tr><tr><td>קטמין הידרוכלוריד</td><td>Zoetis</td><td></td><td>KETASET</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ אור</td><td>Keyence, אוסקה, יפן</td><td>BZ-8000</td><td>ניתן להשתמש במיקרוסקופים דומים</td></tr><tr><td>Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13778075</td><td></td></tr><tr><td>מיקרו-מלקחיים</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מיקרו-מספריים</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מסנן עכבר</td><td></td> מספריים רגילים תוצרת <td></td><td></td>בית</tr><tr><td>Objective</td><td>Nikon</td><td>plan apo 10x/0.45</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Gibco by life technologies</td><td>51985-026</td><td></td></tr><tr><td>תפרי</td><td></td><td></td><td></td>פוליפרופילן</tr><tr><td></td> עור מברג <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> חומר חיטוי (אוקטנידרם)</td><td>Sch&uuml; לקה & Mayr GmbH</td><td>118212</td><td></td></tr><tr>בורג <td></td><td></td><td></td><td>ראש גבינה מחורץ</td></tr><tr><td>טבעת הצמד טבעת</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>הצמד צבת</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ כירורגי עם מצלמה</td><td>Leica</td><td>Leica M651</td><td></td></tr><tr><td>מסגרות טיטניום לתא קפל העור</td><td>IROLA</td><td>160001</td><td>Halteblech M</td></tr><tr><td>ערימת</td><td></td><td></td> חוטים<td></td></tr></tbody></table>

שיטת העברת שריטות וחדר מתקפל לחלל מתורבת בניתוח vivo של ריפוי פצעים

Scratch Migration Assay and Dorsal Skinfold Chamber for In Vitro and In Vivo Analysis of Wound Healing

ריפוי בפצע העור לקוי הוא דאגה משמעותית למטופלים הסובלים מסוכרת ולקשישים, ויש צורך בטיפול אפקטיבי. מתאים מחוץ לגוף ובגישות vivo חיוניים לזיהוי מולקולות היעד החדש לטיפול תרופתי כדי לשפר את תהליך הריפוי של הפצע בעור. זיהינו את β3 יחידת של ערוצי סידן מגודרת מתח (Cavβ3) כמולקולה היעד הפוטנציאלי להשפיע על ריפוי הפצע בשני assays עצמאית, כלומר, בשנת הגירה הפריה חוץ גופית ואת המודל הקאמרית vivo העור מתקפל. העכבר העיקרי פיברותקיעות (MEFs) מבודדים בחריפות מן פראי סוג (WT) ו קוβ3-עכברים לקוי (קוβ3 KO) או פיברותקיעות בודד בבידוד מן העכברים WT שטופלו עם sirna למטה-לווסת את הביטוי של הגן Cacnb3 , קידוד קוβ3, שימשו. שריטה הוחלה על מונאולייר תא שוטף וסגירת הפער החלה בעקבות התמונות המיקרוסקופית בנקודות הזמן המוגדרות עד להשלמת האוכלוסיה המלאה של הפער על ידי התאים הנודדים. תמונות אלה נותחו, ושיעור העברת התא נקבע עבור כל תנאי. In in בvivo, השתלנו חדר מתקפל העור על WT ו Cavβ3 KO, להחיל פצע עגול מוגדר של קוטר 2 מ"מ, כיסו את הפצע עם שמיכות זכוכית כדי להגן עליו מפני זיהומים והתייבשות, ופיקוח על סגירת הפצע מאקרוסקופי עם הזמן סגירת הפצע הייתה מהירה באופן משמעותי בעכברים Cacnb3-gene. מכיוון שהתוצאות של הvivo ומחוץ למבחנה מספר מתאם היטב, הטיפול במבחנה עשוי להיות שימושי עבור הקרנת תפוקה גבוהה לפני אימות הפגיעות מחוץ גופית על ידי במודל ריפוי vivo פצע. מה שאנחנו הראו כאן לסוג פראי ו-קוβ3-לקוי עכברים או תאים עשוי להיות גם ישים עבור מולקולות ספציפיות מלבד Cavβ3.

שיטת השריטה בוצעה על מונאולייר של תאים מסוג פראי ובעלי מβ3 לקוי (איור 1ג). לאחר ביצוע "שריטה" באמצעות טיפ 200 μL הצינורות, תאים משני הגנוטיפים להגר לאזור הטיוטה ולסגור את הפער. תמונות צולמו לאחר 6, 10 ו 30 h (איור 1א). העברת תאים כמותית כאחוז (%) של אזור שריטה מאוכלס מחדש על-ידי העברת תאים 6 שעות לאחר ביצוע השריטה. העברת MEFs Cavβ3-לקוי סגרה את אזור האחסון משמעותית מוקדם יותר מאשר MEFs מעכברים מסוג פראי (איו...

כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור התיקון שריטות מבחנה באמצעות הפיברוכדורים העיקריים עבור vivo העור הפצע הריפוי הטיפול בעכברים. שניהם מספר שיטות ברורות כדי להעריך בתוך מבחנה וריפוי פצעים vivo.

שיטת העברת שריטות וחדר מתקפל לחלל מתורבת בניתוח Vivo של ריפוי פצעים

Impaired cutaneous wound healing is a major concern for patients suffering from diabetes and for elderly people, and there is a need for an effective ...

הצורך המורדים לטיפול בפצעי עור. כדי לזהות את מולקולות היעד שלך לטיפולים תרופתיים, מערכות בדיקה במבחנה ו- in vivo נדרשות. המערכות המתאימות הן מוצ"ש השריטה במבחנה, ותא קיפול העור הגבי in vivo.שניהם הליכים ישר קדימה לניטור נדידת תאים וריפוי פצעי עור, בהיעדר נוכחות של תרכובות פעילות פרמקולוגית. למרות ששתי הטכניקות הן ישר קדימה, החוקרים צריכים לתרגל את יישום השריטה. ואת העור הגבי לקפל את התא השתלה, ופצע כדי להשיג תוצאות אמינות לשחזור.הדגמת ההליכים תב נעשה על ידי ד"ר מתיאס לאשקה, מנתח ופרופסור מהמכון לכירורגיה קלינית וניסיונית. לפני תחילת ההליך, השתמש בסמן קבוע דק במיוחד כדי לסמן לוח אחד של שש היטב לכל סוג תא, עם קו אופקי בתחתית כל באר כדי לסמן את אזור השריטה עבור כל תרבות. תקיעות הסיבים הראשיות של הצלחת הבאה מבודדות מסוג פראי ובטא 3 עכברים לקויים, בצלחת שש בארות ב 5 פעמים 10 כדי תקיעות סיבים החמישי לכל ריכוז היטב.ב 2mL של DMEM בתוספת 10% סרום חזיר עוברי. סמן את הלוחות עם סוג התא, הסוג והתאריך. ולמקום את הצלחות באינקובטור תרבות התא במשך 24 שעות.למחרת בבוקר להוסיף 9 ליטרים של כל דם מבוסס transfection reagent של עניין, לצינורות מיקרו צנטריפוגה בודדים המכילים 150 מיקרו ליטר של מדיום סרום מופחת לכל צינור. הוסף 1.5 ליטרים של siRNA לצינור מיקרו צנטריפוגה שני לכל ריאגנט transfection המכיל 150 מיקרו ליטר של מדיום סרום מופחת לכל צינור. ומערבבים כל פתרון siRNA עם צינור יחיד של פתרון ריאגנט transfection.לאחר מערבולת קצרה מניחים את תערובות ב 21 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות. במהלך הדגירה בזהירות להחליף את supernate בכל באר. עם 2.25 מ"ל של תרבות טרייה בינונית בצד של בארות.בסוף הדגירה להוסיף 250 מיקרו ליטר של תערובת reagent transfection siRNA המתאים, טיפה חכמה לתוך כל באר תואמת של תאים. ולהחזיר את הצלחות לאינקובטור תרבות התא במשך 72 שעות. כאשר התאים הגיעו ל- 100%confluency, השלך את התרבות על-טבעית מכל באר.ולהשתמש טיפ פיפטה 200 מיקרו ליטר כדי ליצור שריטה במונוליאר התא confluent. אנכי לקו האופקי המסומן בתחתית כל באר. לאחר מכן לשטוף בזהירות כל פצוע גם 2 פעמים עם 2mL של PPS לכל לשטוף.כדי להסיר את כל הגורמים ששוחררו מהתאים הפגועים, תאים רופפים או פסולת מהאזור שרוט. לאחר לשטוף השני להוסיף 2mL של תאים טריים תרבות בינוני בתוספת 1 או 10 אחוז סרום לכל באר. וללכוד תמונות של הפצעים בכל צלחת על הבמה של מיקרוסקופ אור.מיד לאחר גירוד בהגדלה של פי 10. ואז להחזיר את הצלחת לאנקובטור תרבות התא. ממשיך ללכוד תמונות בנקודות הזמן הניסיוניות המתאימות במשך 30 השעות הבאות.בסוף הניסוי לכמת את האזור הראשוני ללא תאים ואת האזור הנותר לאחר 6, 10 ו 30 שעות של תרבות. כדי לקבוע את אחוז אזור האחסון מחדש של האחסון מחדש על-ידי התאים הנודדים ביחס לאזור האחסון ההתחלתי של האחסון. לאחר אישור חוסר תגובה לצביטת בוהן, בסוג הפראי או בטא שלוש נוקאאוט C57 שחור שישה עכבר, בזהירות לגלח את הגב.ולהחיל משחה על עיניו של החיה. החל קרם depilatory כדי לחסל את כל השיער שנותר. הסרת השמנת לאחר 10 דקות.כדי להכין את תא טיטניום, לתקן חלק אחד של מסגרת תא טיטניום סימטרי, עם ברגים חיבור עם אגוזים. כדי לשמור על 400 עד 500 מיקרומטר בין שני החלקים הסימטריים של התא. כדי למנוע דחיסה של וריתי הדם בעור.לחטא את העור החשוף עם 70% אתנול. ולתפוס קפל עור מול מקור אור. מקם את הקו האמצעי של השכבה הכפולה של העור למקום שבו יושתל תא הטיטניום.ולתקן בקרניות וב סיבתיות את קפל העור בתפר פוליפרופילן. הדק את הצד השני של התפר על מתלה מתכת כדי להרים את העור המקופל. ולהתאים את גובה המדף כדי לאפשר לעכבר לשבת בנוחות.תפר את המסגרת הראשונה של תא טיטניום על ידי תפרים פוליפרופילן על קצה מעולה על החלק האחורי של קפל העור הגבי. לאחר אישור מחדש של סם דם השתמש במספריים עדין כדי לבצע חתכים קטנים בעור. ולהעביר את שני הברגים המחברים המחוברים למחצית הראשונה של תא הטיטניום דרך בסיס קפל העור.מוציאים את העכבר מהמדף וממקם את החיה במצב משני. מניחים את החצי השני של תא טיטניום על גבי 3 ברגים מחברים. וגם ידנית להפעיל לחץ קל להעביר ברגים אלה דרך המחצית השנייה של מסגרת טיטניום.שכבת העור המקופלת דחוקה כעת בין שני החצאים הסימטריים של מסגרת הטיטניום. ואז לתקן את שני החלקים הסימטריים עם אגוזי נירוסטה. באמצעות אגרוף ביופסיה בקוטר 2 מ"ל, סמן את אזור הפצע במרכז העור, בתוך חלון התצפית של תא קפל העור.ולהשתמש מטסות ומספריים עדין כדי להסיר את האפידרמיס כולו ודרמיס בתוך הסימן. כדי ליצור פצע עגול. נקה את 3 וחצי ל 4 וחצי מילומטר מרובע פצע עם 0.5mL של תמיסת מלח סטרילית.ולכסות את הפצע עם כיסוי זכוכית. השתמש צבת טבעת הצמד על תא טיטניום כדי לתקן את כיסוי במקום. ומיד להעביר את העכבר לשלב ההדמיה של סטריאומיקרוסקופ.ואז תדמיין את הפצע בהגדלה של פי 40. לפני הנחת העכבר לתוך כלוב עם ניטור עד החלמה מלאה. לאחר יצירת שריטה באמצעות קצה פיפטה 200 מיקרו ליטר כפי שהודגם, בניסוי מייצג זה, תאים משני genotypes היגרו לאזור השריטה וסגר את הפער.לאחר מכן, העברת התאים כומתה כאחוז אזור האחסון מחדש על-ידי העברת תאים 6 שעות לאחר ביצוע הטיוטה. לדוגמה בניסוי זה העברת Cav beta 3 פיצוצי סיבים לקויים סגרה את אזור השריטה באופן משמעותי מוקדם יותר מאשר תקיעות סיבים מעכברים מסוג בר. כדי לאשר את האפקט התלוי Cav beta 3 נצפתה Cav beta 3 תקיעות סיבים לקוי, תקיעות סיבים מסוג בר נותבו עם siRNA למטה לווסת את בטא Cav 3 חלבון.תקיעות סיבים שטופלו בבטא Cav 3 siRNAs ספציפיים התנהגו כמו תקיעות סיבים לקויות של בטא 3. כדי להשוות את ריפוי פצעי העור בין שני הגנוטיפים, אזור הפצע בתא קפל העור צולם מיד לאחר הפציעה. והפצע תדמית במהלך השבועיים הבאים.מידות הפצעים נמדדו בתמונות ובתחום הפצעים, ביום נתון, בא לידי ביטוי כאחוז מאזור הפצע הראשוני. כצפוי, קצב סגירת הפצעים הוגדל בעכברים לקויים של Cav beta 3 בהשוואה לפקדים מסוג פראי. הקפד להפעיל לחץ שווה על קצה פיפטה, עבור כל שריטה כדי להתאים את השריטות על הקווים המסומנים בתחתית הצלחת מקרוב ככל האפשר.חלון התצפית של תא קיפול העור הגבי ניתן לפתוח בכל עת במהלך תהליך הריפוי. המאפשר את היישום אקטואלי של תרכובות פרמקולוגיות פעילות שונות. ניתן גם למלמל את האזור הפצוע בשלבים שונים של תהליך הריפוי.לניתוח ביוכימי או היסטולוגי של חלבונים מולקולריים.

scratch-migration-assay-dorsal-skinfold-chamber-for-vitro-vivo

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

היכולת לנדוד היא פונקציה מרכזית של סוגי תאים רבים ושונים, כולל תאי סטרומה מזנכימליים (MSCs). עם זאת, כימות שינויים ביכולת הנדידה לאחר נזק הוא מאתגר. פרוטוקול זה מתאר בדיקת הגירה הניתנת להתאמה בקלות המשתמשת בסטטיסטיקה קפדנית כדי לכמת שינויים ביכולת הנדידה של MSC לאחר נזק.

אופטימיזציה של assay Scratch הפצע כדי לזהות שינויים בנדידת תאי Murine mesenchymal סטרומה לאחר נזק על ידי תמצית עשן סיגריות מסיס

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבצע assay נדידת תאי תפוקה למחצה גבוהה על צלחת תרבית תאי 96-היטב. פרוטוקול זה הוא שיטה מהירה, פשוטה וחסכונית ליצור פצעי שריטה עקביים על monolayer תא.

מכשיר לביצוע נדידת תאים / ריפוי פצעים צלחת 96-ובכן

המחקר מדווח על שתי שיטות שונות לניתוח של הפלישה תא והעברה: וזמינותו קאמרית בוידן, במבחנה וידאו מבוסס-מיקרוסקופ ריפוי פצע וזמינותו. הפרוטוקולים עבור שני ניסויים אלה מתוארים, היתרונות והחסרונות שלהם מושווים.

הערכה של הפלישה התא, תהליך ההעברה: השוואה של השריטה מבוסס-מיקרוסקופ וידאו פצע Assay ואת וזמינותו קאמרית בוידן

כתב יד זה מתאר איך חתך דמוי נגעים על monolayers בתרבית תאים אפיתל בנוחות דגם פצע ריפוי במבחנה, ומאפשר הדמיה על ידי קונאפוקלית או סריקה מיקרוסקופ לייזר, אשר יכול לספק באיכות גבוהה נתונים כמותיים ואיכותיים ללמוד בהתנהגות התא והן את המנגנונים המעורבים בהעברה.

מיקרוסקופ המבוסס על שיטות להערכה של נדידת תאים אפיתל במהלך במבחנה ריפוי הפצע

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי להעריך את ההשפעה של פפטידים על ההעברה של תאי אפיתל כנגד ברונכיט. שיטה זו מאפשרת הקניית מהיר ולא מאוד לשחזור נתונים כמותיים על מהירות הסגר ההעברה וגמר התא.

הרומן במבחנה פצע ריפוי הנועד להעריך את נדידת תאים

כאן נתאר הליך כדי לבחון את התא ההעברה במבחנה עם מיקרוסקופ אופטי מצלמה אוטומטית. וזמינותו מאפס כבר בשימוש נרחב שבו הסגר על השריטה מלווה קצוב. מיקרוסקופ אופטי מאפשר זיהוי אמין וזול של נדידת תאים.

אופטימיזציה Assay מאפס במבחנה בדיקה של נדידת תאים עם מצלמה אופטית אוטומטית

מחקר זה מתמקד מודל במבחנה של הפצע הריפוי (גירוד assay) בתור מנגנון לקביעת מזהמים סביבתיים איך כגון ארסן השפעה הסלולר ההעברה. התוצאות מדגימים כי assay חוץ גופית בתוך זה מספק אינדיקציות מהיר ולא מוקדם של שינויים ההעברה הסלולר לפני ניסויים ויוו .

במבחנה לגרד Assay כדי להדגים את השפעת הרעל על נדידת תאים בעור

בפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה משולבת חוקרים נדידת תאים סרטן ופלישה על פלטפורמה אחת בזמן אמת, מתן אפשרות היעילה הדירים בקלות ללמוד ניידות תא ו מורפולוגיה.

זרימת עבודה פשוטה הגירה/הפלישה באמצעות Imager אוטומטיות של תאים חיים

כאן, שני מודלים מורתיים ריפוי הפצע מתוארים, אחד שנועד להעריך את התגובה התאית הפצע ריפוי והשני כדי לכמת את שיעור סגירת הפצע. שיטות אלה ניתן להשתמש עם דגמי מחלות מורכבות כגון סוכרת כדי לקבוע מנגנונים של היבטים שונים של ריפוי הפצע המסכן.

הערכה של ריפוי בפצע חריפה באמצעות השרכה העור מפוליויניל כוהל של הרקמה העורית והזנב Excisional הפצע מודלים.

אנו מציגים שיטה חסכונית לגיירת השריטות המספקת גישה חדשה לקביעת העברת תאים ללא שימוש בשיטות עתירות ציוד. בעוד פיברובלסטים שימשו בפרוטוקול זה, זה יכול להיות מותאם ומנוצל כדי ללמוד סוגי תאים נוספים והשפעות על העברת תאים.

תס"א של העברת שריטות חסכונית ותואמה

מחקר זה מציג את בדיקת נדידת פצעי השריטה הדו-ממדית (2D) ואת בדיקת הנבטת הספרואידים התלת-ממדית (3D), יחד עם שיטות הניתוח שלהם במורד הזרם, כולל מיצוי RNA ואימונוציטוכימיה, כבדיקות מתאימות לחקר אנגיוגנזה במבחנה.

חקירת אנגיוגנזה ברמה תפקודית ומולקולרית על ידי מינוף בדיקת נדידת פצע השריטה ובדיקת הנבטת הספרואיד

למד שיטות מעבדה וחיות לבדיקת ריפוי פצעי עור, כולל מבחן שריטות בתאי פיברובלסטים וחדר עור מתקפל בעכברים. הטכניקות מאפשרות הערכת תרופות ומנגנוני נדידת תאים בביולוגיה של ריפוי פצעים.

שיטת העברת שריטות וחדר מתקפל לחלל מתורבת בניתוח Vivo של ריפוי פצעים

גלה סרטונים נוספים