הפונקציונליזציה של מיקרוסקופ כוח אטומי מנופים עם תאים חד-טי או חלקיק יחיד לספקטרוסקופיית של כוח בודד אימונולוגיים

פרוטוקול זה מתאר את הדרך הטובה ביותר לתפקד על-ידי ה- AFM באמצעות תאי T בודדים וחלקיקים מוצקים. לאחר מכן ניתן להשתמש בטיפים אלה כדי לחקור אינטראקציות תא-T דנדריטיות של זוג יחיד ולנטר תגובות תאיות בגודל הפכפך, בהתאמה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא משתמשת דבק תואם ביולוגית עבור פונקציונליזציה תא T יחיד של cantilevers.

דבק זה אינו פעיל לתאים אוקריוטיים, ובכך שומר על תאי T בשלב ההפעלה הבסיסי שלהם. שיטות אלה מספקות תובנה על הפעלת תאים חיסוניים ואירועים בין תאיים מורכבים, כגון היווצרות סינפסה חיסונית. ניתן גם להאריך את השיטות למערכות אחרות המערבות אינטראקציות בין תאים לתאים או פני תאים.

עבור מישהו חדש בטכניקה זו, חשוב לוודא כי תאי T נמצאים במצב טוב לפני השימוש, כי הם מטופלים מראש עם IL-2 לילה. בנוסף, בעת שימוש בדבק biocompatible, לנוע במהירות כדי להגן עליו מפני חמצון מיותר. כדי להתחיל בהליך זה, הכן את תאי ה- T הבודדים למיקרוסקופיה על-ידי ביצוע פעולה זו בפרוטוקול הטקסט.

לאחר מכן, הכינו כיסויי זכוכית עם תאי DC2.4, והדגירה את התאים בן לילה בתא לח ב-37 מעלות צלזיוס ו-5%CO2. יש לנקות את ה- cantilevers רכים וחסרי קצה עם קבוע קפיץ נמוך באמצעות טיפול פיראנה, ניקוי פלזמה או ניקוי UV-ozone. לאחר מכן, הר את ה- cantilever הנקי לראש הסריקה של AFM.

לאחר מכן, הכינו תא דגימה נקי, ומלאו אותו במים טהורים. כייל את ה- cantilever בתסיכת המים על ידי הפעלת עקומת כוח על מצע הזכוכית כדי לקבל את הרגישות של cantilever. לאחר מכן, להקליט ספקטרום רעש תרמי כדי לחלץ את קבוע האביב.

כאשר ה- cantilever מכויל כראוי, הסר את ראש הסריקה של AFM מהפתרון. לשטוף את cantilever רכוב עם כמה טיפות של אתנול טהור, ולשמור את cantilever יבש על ראש הסריקה. מחממים מארז סביבת תאים חיים ל-37 מעלות צלזיוס עם 5%CO2.

לאחר מכן, הר את כיסוי הזכוכית עם תאי DC2.4 למכלול התא לדוגמה, ומיד להוסיף 600 microliters של בינוני B לתא. מקם את ההרכבה שהושלמה על שלב הדגימה של AFM. הוסף תאי CD4 חיוביים דמויי IL-2 לתאי T חיוביים לתא הדגימה.

המתן עד שתאי T של הפילוח ייוחסו במלואם בתחתית הכיסוי ולאחר מכן הבא את התאים לשדה התצוגה מתחת למיקרוסקופ. עכשיו, תוסיף טיפה של שני מיקרוליטר של דבק תואם ביולוגית לקצה התבלין הרכוב עם פיפטה. לאחר הדבק biocompatible הוחל על cantilever, השלבים הבאים צריכים להסתיים בהקדם האפשרי על מנת למקסם את ההידבקות.

מניחים במהירות את ראש הסריקה על במת הדגימה, טובלים את ה-cantilever מצופה הדבק בתסרון. הזז את שלב הדגימה עד שתא T בריאותי ימוקם מתחת לקצה ה- cantilever. לאחר מכן, התאם גם את מיקומו על-ידי הזזת ראש הסריקה.

לאחר מכן, הורידו את ה-cantilever ידנית. התחל עם גודל צעד 50 מיקרון, ולאחר מכן להקטין ל 10, חמש, ושניים ולבסוף 0.5 מיקרון בהדרגה, כפי שצוין על ידי החדות של התמונה cantilever. עכשיו, להחזיק את המיקום של מנועי צעד, ולהתאים את המיקום של ראש הסריקה כדי ליישר טוב יותר את קצה cantilever ואת התא.

המשך עד מגע המשרד מסומן על ידי תזוזה קטנה של המיקום של הלייזר, המתאים כוח טיפוסי של 0.5 כדי 1.5 nanonewtons. לאחר 30 שניות של מגע, לסגת cantilever. אם התא זז עם ה- cantilever, הקובץ המצורף הצליח.

אם לא, חזור על צעד ההיתוך עד שלוש פעמים לפני המעבר ל- cantilever חדש. מקם את תא ה- T המחובר מעל תא DC2.4 על-ידי הזזת שלב הדגימה וראש הסריקה. לאחר הגדרת פרמטרים מתאימים, הפעל ספקטרוסקופיית כוח מעל המדגם.

לסיבוב חדש של בירור, הר cantilever חדש, נקי. כייל אותו במים טהורים, ולאחר מכן חזור לצמד תאים דנדריטיים של תאי T וחזור על הסריקה. הר כיסוי זכוכית ניקה למכלול התא לדוגמה.

בצד שמאל של הכיסוי, מוסיפים טיפה של תותב חרוזים כי כבר מדולל באתנול ומכיל 6 מיקרון קוטר גם גם פוליסטירן. לאחר הממס מתאדה, לבדוק את המרווח של חרוזים באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר מצויד מטרה 20x. ודא כי חרוזים בודדים מופרדים היטב.

לאחר מכן, טובלים טיפ מיקרופיפטי או קיסם בדבק אפוקסי מעורב היטב, ומעבירים כמות קטנה של הדבק לשלוש נקודות נפרדות עם נגיעות עדינות רצופות בצד ימין אך קרוב למרכז העטיפה, כפי שמוצג כאן. לאחר מכן, הרם מנקה, cantilever חסר קצה לראש סריקת AFM, וכייל אותו באוויר עם משטח נקי כדי לקבל את קבוע האביב. לאחר מכן, למקם את קצה cantilever מעל הגבול השמאלי של נקודת דבק אפוקסי האחרון, ולאט לאט להביא את cantilever קרוב הדבק באמצעות גדלי צעד קטנים על מנועי צעד.

לאחר מגע נעשה עם הדבק, במהירות למשוך את cantilever באופן צדדי על ידי הזזת ראש סריקת AFM לאחור. הסר כל דבק עודף על ידי שפשוף אותו על הזכוכית, משאיר רק כמות זעירה של הדבק ממש בקצה הקצה. עכשיו, תזיז את קצה הזיזים על גבי חרוז מבודד היטב.

לגשת חרוז יחיד לאט, ותיצור קשר איתם במגע איתם בטווח של שניים עד חמישה nanonewtons במשך כ 10 שניות. בעת יצירת מגע, השתמשו בהתאמות עדין כדי למקם את חרוז בקצה הקצה. חזור בך מהטיפ בסוף איש הקשר.

אם חרוז נעלם ממישור המוקד המקורי, אירוע הידבקות מוצלח התרחש. לבסוף, דרגו את ה-cantilever שעבר שינוי חרוזים בזהירות, ואחסנו אותו בקופסת קנטיליוור בן לילה כדי שהאפוקסי ירפא במלואו. להלן עקומות טיפוסיות במרחק כוח מהאינטראקציה המחייבת בין תא T יחיד לתא דנדריטי יחיד במהלך מחזור נסיגה אחד.

העקומה האדומה הקלה היא עקומת ההרחבה, והעיקול האדום הכהה הוא עקומת הנסיגה. הערך המינימלי בעקומה נותן מידה של כוח ההיתוך המרבי בין תא T לתא דנדריטי, ואת האזור מתחת לעקומה מייצג את העבודה הנדרשת כדי להפריד ביניהם. ניתן לפרש את אירועי הקרע החדים והצעדיים כטייסים של קרום שנשלפים מפני השטח של התא בשל הכריכה החזקה בממשק התא-תא ולאחר מכן שבירה דיסקרטית תחת משיכה רציפה.

כאן, איגוד תא T קונבנציונלי לתאים דנדריטיים מוצג באפור, ו איגוד תאי T רגולטורי לתאים דנדריטיים מוצג בכחול. כוחות ההיתוך בין תא T קונבנציונלי לתא T רגולטורי מזהים אנטיגנים פפטיד שהוצגו על ידי תאים מציגי אנטיגן, ואילו תאי T רגולטוריים הם תאי T מדכאים כי לסגור חסינות תאי T קונבנציונליים לקראת סוף התגובה החיסונית. סכמטי זה של תא phagocytic RAW264.7 המסוקרן באופן פלואורסצנטי מראה את התא מתקרב עם עירום אחד, קוטר שישה מיקרון, חרוז פוליסטירן.

עם עיסוק חרוז, ממברנה PIP2 ממוין באתר הקשר, ליד b, אשר לאחר מכן גורם גיוס קרום של moesin, וכתוצאה מכך אירוע phagocytic. בנוסף להליך המתואר כאן, ספקטרוסקופיית כוח חד-תאי מבוסס AFM יכולה לשמש יחד עם הדמיה פלואורסצנטית כדי לחקור את הפעלת התא החיסוני בזמן אמת ברמת התא הבודד. בשילוב טכניקות פלואורסצנטיות, שיטה זו מאפשרת טיפול בתהליכים תאיים מורכבים יותר בזמן אמת, כגון היווצרות סינפסה חיסונית בין תאים דנדריטיים לבין זוג תאי T.