Name: לימוד זיהום הצפנה ברקמה תלת-ממדית-מערכות תרבות מיקרואיד של האדם הנגזר על ידי מיקרו-הזרקה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 31 s
Description: למד שיטות לזיהוי Cryptosporidium parvum באורגנואידים אנושיים תלת-ממדיים באמצעות מיקרו-הזרקה וצביעה אימונית. פרוטוקולים אלה מאפשרים חקר אינטראקציות מארח-מיקרוב במחלות זיהומיות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו אסירי תודה לדבורה א. שפר מבית הספר של בעלי חיים ומדעי ביורפואי השוואתי, המכללה לחקלאות ומדעי החיים, אוניברסיטת אריזונה, טוסון, AZ, ארה ב על שסייע לנו עם ייצור וניתוח הoocyst. כמו כן, אנו מודים לגבי מיקרוסקופ ומרכז ההדמיה ו-d. d Mullendore באוניברסיטת וושינגטון לקראת הכנה והדמיה של ציסטות מבודדות של אורגנואיד.
D.D. הוא המקבל של מענק בני מארגון הולנד למחקר מדעי (NWO-ALW, 016.171.015). I.H. הוא המקבל של מענק בני מארגון הולנד למחקר מדעי (NWO-ALW, 863.14.002) ונתמך על ידי מלגות מארי קירי מהוועדה האירופית (הצעה 330571 FP7-אנשים-2012-IIF). המחקר המוביל לתוצאות אלה קיבל מימון ממועצת המחקר האירופית תחת הסכם מתקדם המענק של ERC no. 67013 ו-NIH NIAIH תחת R21 AT009174 כדי RMO. עבודה זו היא חלק ממכון Oncode, אשר ממומן חלקית על ידי האגודה ההולנדית לסרטן ומומן על ידי מענק של האגודה ההולנדית לסרטן.

<ol><li>Checkley, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+the+global+burden%2C+novel+diagnostics%2C+therapeutics%2C+and+vaccine+targets+for+Cryptosporidium%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">A review of the global burden, novel diagnostics, therapeutics, and vaccine targets for Cryptosporidium.</a> The Lancet Infectious Diseases. 15 (1), 85-94 (2015).</li>
<li>Bones, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Past+and+future+trends+of+Cryptosporidium+in+vitro+research%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Past and future trends of Cryptosporidium in vitro research.</a> Experimental Parasitology. 196, 28-37 (2018).</li>
<li>Muller, J., Hemphill, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+culture+systems+for+the+study+of+apicomplexan+parasites+in+farm+animals%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+for+Parasitology%22%5BJournal%5D)">In vitro culture systems for the study of apicomplexan parasites in farm animals.</a> International Journal for Parasitology. 43 (2), 115-124 (2013).</li>
<li>Karanis, P., Aldeyarbi, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+Cryptosporidium+in+vitro+culture%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+for+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Evolution of Cryptosporidium in vitro culture.</a> International Journal for Parasitology. 41 (12), 1231-1242 (2011).</li>
<li>Morada, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+culture+of+Cryptosporidium+parvum+using+hollow+fiber+technology%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+for+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Continuous culture of Cryptosporidium parvum using hollow fiber technology.</a> International Journal for Parasitology. 46 (1), 21-29 (2016).</li>
<li>DeCicco RePass, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+Bioengineered+Three-Dimensional+Human+Intestinal+Model+for+Long-Term+Infection+of+Cryptosporidium+parvum%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Novel Bioengineered Three-Dimensional Human Intestinal Model for Long-Term Infection of Cryptosporidium parvum.</a> Infection and Immunity. 85 (3), (2017).</li>
<li>Miller, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cell+culture+platform+for+Cryptosporidium+that+enables+long-term+cultivation+and+new+tools+for+the+systematic+investigation+of+its+biology%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+for+Parasitology%22%5BJournal%5D)">A cell culture platform for Cryptosporidium that enables long-term cultivation and new tools for the systematic investigation of its biology.</a> International Journal for Parasitology. 48 (3-4), 197-201 (2018).</li>
<li>Sachs, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expanding+human+airway+organoids+for+disease+modelling%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Long-term expanding human airway organoids for disease modelling.</a> bioRxiv. , https://www.biorxiv.org/content/early/2018/05/09/318444 (2018).</li>
<li>Dutta, D., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+culture+systems+to+study+host-pathogen+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Organoid culture systems to study host-pathogen interactions.</a> Current Opinion in Immunology. 48, 15-22 (2017).</li>
<li>Heo, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+Cryptosporidium+infection+in+human+small+intestinal+and+lung+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Modelling Cryptosporidium infection in human small intestinal and lung organoids.</a> Nature Microbiology. 3 (7), 814-823 (2018).</li>
<li>Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease+Modeling+in+Stem+Cell-Derived+3D+Organoid+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Disease Modeling in Stem Cell-Derived 3D Organoid Systems.</a> Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).</li>
<li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+Development+and+Disease+with+Organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling Development and Disease with Organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon%2C+adenoma%2C+adenocarcinoma%2C+and+Barrett%27s+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li>
<li>O'Hara, S. P., Chen, X. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+biology+of+Cryptosporidium+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+and+Infection%22%5BJournal%5D)">The cell biology of Cryptosporidium infection.</a> Microbes and Infection. 13 (8-9), 721-730 (2011).</li>
<li>Lendner, M., Daugschies, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryptosporidium+infections%3A+molecular+advances%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitology%22%5BJournal%5D)">Cryptosporidium infections: molecular advances.</a> Parasitology. 141 (11), 1511-1532 (2014).</li>
<li>Feng, H., Nie, W., Sheoran, A., Zhang, Q., Tzipori, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bile+acids+enhance+invasiveness+of+Cryptosporidium+spp.+into+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Bile acids enhance invasiveness of Cryptosporidium spp. into cultured cells.</a> Infection and Immunity. 74 (6), 3342-3346 (2006).</li>
<li>O'Connor, R. M., Kim, K., Khan, F., Ward, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+Cpgp40%2F15+in+Toxoplasma+gondii%3A+a+surrogate+system+for+the+study+of+Cryptosporidium+glycoprotein+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Expression of Cpgp40/15 in Toxoplasma gondii: a surrogate system for the study of Cryptosporidium glycoprotein antigens.</a> Infection and Immunity. 71, 6027-6034 (2003).</li>
<li>Wilke, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+Antibodies+to+Intracellular+Stages+of+Cryptosporidium+parvum+Define+Life+Cycle+Progression+In+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22mSphere%22%5BJournal%5D)">Monoclonal Antibodies to Intracellular Stages of Cryptosporidium parvum Define Life Cycle Progression In Vitro.</a> mSphere. 3 (3), (2018).</li>
<li>Vinayak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+modification+of+the+diarrhoeal+pathogen+Cryptosporidium+parvum%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genetic modification of the diarrhoeal pathogen Cryptosporidium parvum.</a> Nature. 523 (7561), 477-480 (2015).</li>
<li>Dijkstra, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+Tumor-Reactive+T+Cells+by+Co-culture+of+Peripheral+Blood+Lymphocytes+and+Tumor+Organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of Tumor-Reactive T Cells by Co-culture of Peripheral Blood Lymphocytes and Tumor Organoids.</a> Cell. 174 (6), 1586-1598 (2018).</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

תרבות של הצפנת הצפנה טפילים במעי ואורגנואידים הנשימה מספק מודל מדויק ללמוד אינטראקציות מארח טפיל10 אבל יש גם יישומים רבים אחרים. לדוגמה, השיטות הנוכחיות של בחירת והפצת הצפנה מהונדסים גנטית טפילים דורשים מעבר בעכברים19 אשר אינו מאפשר בידוד של טפילים כי יש שינויים חיוניים עבור זיהום vivo. תרבות אורגאידית של קריפטוספורידיום מספקת חלופה לפרוצדורה זו. עם זאת, ציינו כי הספוראוזוטים האלקטרו-מגנטים מאוחדים וחוסמים את המיקרופיפטה. לצורך בחירת טפילים מהונדס...

התפתחות של תרופות או חיסונים לטיפול ומניעה של הדבקת הצפנה היתה מעכבת היעדר מערכות מבחנה אשר לחקות בדיוק את המצב vivo בבני אדם1,2. רבים מהמערכות הזמינות כעת רק לאפשר זיהום לטווח קצר (< 5 ימים) או לא לתמוך במחזור החיים המלא של הטפיל3,4. מערכות אחרות המאפשרות התפתחות מלאה של הטפיל מבוססים על קווי תאים מונצח או תאים סרטניים שאינם בנאמנות המצב הפיזיולוגי של בני אדם5,6,7 . אורגנואידים או ' מיני איברי ' הם 3D רקמות נגזרות מבנים אשר גדלים במטריצה מתוך החילוץ שנוספו עם רקמות שונות מסוימים הצמיחה גורמים. אורגנואידים פותחו מאיברים שונים ורקמות. הם יציבים מבחינה גנטית ומוארכים את רוב התפקודים של אברי המוצא שלהם, ויכולים להישמר בתרבות לפרקי זמן ארוכים. פיתחנו שיטה לזיהום המעי האנושי והריאות אורגנואידים עם Cryptosporidium המספקת מודל מדויק של מבחנה למחקר של אינטראקציות מארח טפיל רלוונטי מעיים והצפנת הנשימה8 ,9,10,11,12,13. בניגוד לדגמים אחרים של תרבות שפורסמו, מערכת האורגנואיד מייצגת אינטראקציות טפיל מארח של החיים האמיתיים, מאפשרת השלמת מחזור החיים כך שכל השלבים של מחזור החיים הטפיל ניתן ללמוד, ושומר על התפשטות הטפיל עד 28 ימים10.
Cryptosporidium parvum הוא טפיל apicom, אשר מדביק את האפיתל של הנשימה ומעיים שדות, גרימת מחלה diarrheal ממושכת. השלב הסביבתי עמיד הוא oocyst, נמצא מזון מזוהם מים14. לאחר שבלע או שאפה, את הריזוטו ומשחרר ארבעה sporozoites כי לצרף לתאי אפיתל. Sporozoites להחליק על תאים מארחים ולעסוק קולטנים תא מארח, אבל הטפיל לא לפלוש באופן מלא לתא, והוא מופיע כדי לגרום לתא המארח להפרץ15. הטפיל, שהופנמו בתוך תא פנימי, אך ממוכך, נשאר על פני השטח הרשמי של התא, ומשכפל בתוך החללים הפרזיטואטיים. הוא עובר שני סיבובים של רבייה לא-מינית – תהליך הנקרא merogony. במהלך המראווני, הסוג שאני מפתח מפתחים אשר מכילים שמונה merozoites המשוחררים לפלוש לתאים חדשים. אלה merozoites לפלוש תאים חדשים כדי להתפתח סוג II meronts המכיל ארבעה merozoites. Merozoites אלה, כאשר הם משתחררים, להדביק תאים ולהתפתח מאקרוגמונטים ומיקרוגמבטים. מיקרוגיים משתחררים ומדשן את המקגיים המייצרים זיטים שבוגרים לתוך ציסטות. בוגרת האוציסטות משתחררים לאחר מכן לתוך לומן. האוציסטות הן דקות-חומה אשר מיד מייבאות להדביק את האפיתל, או מוקף חומה עבה אשר משתחררים לתוך הסביבה כדי להדביק את המארח הבא14. כל שלבי הצפנת מחזור החיים זוהו במערכת התרבות האורגאידית שפותחה בעבר על ידי הקבוצה שלנו10.
מאז בנאמנות האדם אורגנואידים שכפול רקמות האדם9,11,13, ותמיכה בכל השלבים replicative הצפנה10, הם מערכת התרבות האידיאלית רקמה ללמוד קריפטוספטורידיום ביולוגיה ואינטראקציות מארחים-טפיל. כאן אנו מתארים את ההליכים לזיהום אורגנואידים עם שני ציסטות קריפטוגנטים ו-הצפנה , ובידוד החדש אאוציסטות המיוצר במערכת זו תרבות רקמה.

<table><tbody><tr><td>תמצית ממברנת הבסיס (מטריצה חוץ-תאית)</td><td>amsbio</td><td>3533-010-02</td><td><חזק>&nbsp; נוגדן </חזק></td></tr><tr><td>Crypt-a-Glo (נוגדן ספציפי ל-Oocyst)</td><td>Waterborne, Inc</td><td>A400FLR-1X</td><td>ריכוז סופי = השתמש ב-2-3 טיפות/שקופית</td></tr><tr><td>Crypto-Grab IgM מצופה חרוזים מגנטיים</td><td>Waterborne, Inc</td><td>IMS400-20</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>מתלה Dynamag 15</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>12301D</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>מתלה Dynamag 2</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>12321D</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>EMD Millipore&nbsp; מסנני ממברנה פוליקרבונט איזופור- 3&micro; מ</td><td>EMD-Millipore</td><td>TSTP02500</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>צבע ירוק מהיר</td><td>SIGMA</td><td>F7252-5G&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Femtojet 4i Microinjector</td><td>Eppendorf</td><td>5252000013</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>נימי זכוכית בקוטר 1 מ"מ</td><td>WPI</td><td>TW100F-4</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>מטריג'ל (מטריצה חוץ-תאית)</td><td>קורנינג</td><td>356237</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>צינור מיקרופוגה 1.5 מ"ל</td><td>Eppendorf</td><td>T9661-1000EA</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>טיפים למיקרו-מעמיס</td><td>Eppendorf</td><td>612-7933</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>חולץ מיקרופיפטה P-97</td><td>מכשיר תריס</td><td>P-97</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>סרום חמור רגיל</td><td>Bio-Rad</td><td>C06SB</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Penstrep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>נתרן היפוקלוריט (השתמש ב-5%)</td><td>קלורוקס</td><td>50371478</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>מגלשות סופר סטיק</td><td>Waterborne, Inc</td><td>S100-3</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Swinnex-25 47 מ"מ מחזיק מסנן פוליקרבונט</td><td>EMD-Millipore</td><td>SX0002500</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>חומצה טאורוכולית נתרן מלח הידרט</td><td>SIGMA</td><td>T4009-5G</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Merck</td><td>8221840500</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>חומר הרכבה Vectashield</td><td>Vector Labs</td><td>H-1000</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>וורטקס ג'יני 2</td><td>תעשיות מדעיות, בע"מ</td><td>SI0236</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td><חזק>Adv+++ (DMEM+Penstrep+Glutamax+Hepes)</חזק></td><td><חזק>&nbsp; </חזק></td><td><חזק>&nbsp; </חזק></td><td><חזק>סכום סופי</חזק></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>12634-010</td><td>500 מ"ל</td></tr><tr><td>Penstrep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>5 מ"ל מלאי ב-500 מ"ל DMEM</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050038</td><td>5 מ"ל מלאי ב-500 מ"ל DMEM</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Gibco</td><td>15630056</td><td>5 מ"ל מלאי ב-500 מ"ל DMEM</td></tr><tr><td><חזק> מדיית אורגנואיד במעי (אמצעי הרחבה)</חזק></td><td><חזק>&nbsp; </חזק></td><td><חזק>&nbsp; </חזק></td><td><חזק>ריכוז סופי</חזק></td></tr><tr><td>A83-01</td><td>טוקריס</td><td>2939-50 מ"ג</td><td>0.5 ומיקרו; M</td></tr><tr><td>Adv+++</td><td>&nbsp;</td><td>&nbsp;</td><td>ליצור עד 100 מ"ל</td></tr><tr><td>B27</td><td>Invitrogen</td><td>17504044</td><td>1x</td></tr><tr><td>EGF</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td>50 ng/mL</td></tr><tr><td>Gastrin</td><td>Tocris</td><td>3006-1mg</td><td>10 nM</td></tr><tr><td>NAC</td><td>Sigma</td><td>A9125-25G</td><td>1.25 mM</td></tr><tr><td>NIC</td><td>Sigma</td><td>N0636-100G</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>Noggin CM</td><td>בבית*</td><td>&nbsp;</td><td>10%</td></tr><tr><td>מעכב P38 (SB202190)</td><td>Sigma</td><td>S7076-25 מ"ג</td><td>10 ומיקרו; M</td></tr><tr><td>PGE2</td><td>Tocris</td><td>2296/10</td><td>10 ננומטר</td></tr><tr><td>פרימוצין</td><td>InvivoGen</td><td>ant-pm-1</td><td>1 מ"ל/500 מ"ל מדיה</td></tr><tr><td>RSpoI CM</td><td>בבית*</td><td>&nbsp;</td><td>20%</td></tr><tr><td>Wnt3a CM</td><td>בבית*</td><td>&nbsp;</td><td>50%</td></tr><tr><td>בבית* - קווי סלולר יסופקו על פי בקשה</td><td>&nbsp;</td><td>&nbsp;</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td><מדיה>אורגנואיד מעי חזקה-OMD (מדיית התמיינות)</חזק></td><td>&nbsp;</td><td>&nbsp;</td><td>כדי להבדיל אורגנואידים, אורגנואידים מתרחבים במעי הדק גודלו במדיום עשיר ב-Wnt במשך שישה עד שבעה ימים לאחר הפיצול, ולאחר מכן גודלו במדיום התמיינות (נסיגה של Wnt, ניקוטינאמיד, SB202190, במדיום התמיינות (נסיגה של Wnt, ניקוטינאמיד, SB202190, פרוסטגלנדין E2 ממדיום עשיר ב-Wnt או OME)</td></tr><tr><td><חזק>LUNG ORGANOID MEDIA-LOM (מדיה התמיינות)</חזק></td><td><חזק>&nbsp; </חזק></td><td><חזק>&nbsp; </חזק></td><td><חזק>ריכוז סופי</חזק></td></tr><tr><td>Adv+++</td><td>&nbsp;</td><td>&nbsp;</td><td>ליצור עד 100 מ"ל</td></tr><tr><td>ALK-I A83-01</td><td>Tocris</td><td>2939-50mg</td><td>500 nM</td></tr><tr><td>B27</td><td>Invitrogen</td><td>17504044</td><td>0.0763888889</td></tr><tr><td>FGF-10</td><td>Peprotech</td><td>100-26</td><td>100 ng/mL</td></tr><tr><td>FGF-7</td><td>Peprotech</td><td>100-19</td><td>25 ng/mL</td></tr><tr><td>N-Acetylcysteine</td><td>Sigma</td><td>A9125-25G</td><td>1.25 mM</td></tr><tr><td>ניקוטינאמיד</td><td>סיגמא</td><td>N0636-100G</td><td>5 מ"מ</td></tr><tr><td>Noggin UPE</td><td>U-Protein Express</td><td>צור קשר ישירות עם החברה</td><td>10%</td></tr> <tr><td>p38 MAPK-I</td><td>Sigma</td><td>S7076-25 מ"ג</td><td>1 ומיקרו; M</td></tr><tr><td>Primocin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-pm-1</td><td>1:500</td></tr><tr><td>RhoKI Y-27632</td><td>Abmole Bioscience</td><td>M1817_100 מ"ג</td><td>2.5 ומיקרו; m</td></tr><tr><td>Rspo UPE</td><td>U-Protein Express</td><td>צור קשר ישירות עם החברה</td><td>10%</td></tr><tr><td><חזק>מפחית חיץ (להשעיה מחדש של אוציטים וספורוזואיטים להזרקה)</חזק></td><td><חזק>&nbsp; </חזק></td><td><חזק>&nbsp; </חזק></td><td><חזק>ריכוז סופי</חזק></td></tr><tr><td>L-גלוטתיון מופחת</td><td>Sigma</td><td>G4251-10MG</td><td>0.5 &mu; g/&mu; L של OME/OMD/LOM</td></tr><tr><td>Betaine</td><td>Sigma</td><td>61962</td><td>0.5 &mu; g/&mu; L של OME/OMD/LOM</td></tr><tr><td>L-Cysteine</td><td>Sigma</td><td>168149-2.5G</td><td>0.5 &mu; g/&mu; L של OME/OMD/LOM</td></tr><tr><td>חומצה לינולאית</td><td>Sigma</td><td>L1376-10MG</td><td>6.8 &mu; גרם/מ"ל של OME/OMD/LOM</td></tr><tr><td>טאורין</td><td>סיגמא</td><td>T0625-10MG</td><td>0.5 &mu; g/&mu; L של OME/OMD/LOM</td></tr><<tr><td>חזק>מאגר חוסם (לצביעה אימונופלורסנציונית)</חזק></td><td><חזק>&nbsp; </חזק></td><td><חזק>&nbsp; </חזק></td><td><חזק>ריכוז סופי</חזק></td></tr><tr><td>חמור/עז סרום</td><td>Bio-Rad</td><td>C06SB</td><td>2%</td></tr> <tr><td>PBS</td><td>Thermo-Fisher</td><td></td><td>70011044 יוצרים עד 100 מ"ל</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Merck</td><td>P1379</td><td>0.1%</td></tr><tr><td>רשימת הנוגדנים בשימוש </חזק></td><td><חזק>&nbsp; </חזק></td><td><חזק>&nbsp; </חזק></td><td><חזק>&nbsp; </חזק></td></tr><tr><td>Alexa 568 עז נגד ארנב</td><td>Invitrogen</td><td>A-11011</td><td>דילול-1:500; RRID:</td></tr><tr><td>ערכה מקיפה של AB_143157 Crypt-a-Glo - נוגדן עם תווית פלואורסצאין Crypto-Glo</td><td>Waterborne, Inc</td><td>דילול A400FLK- 1:200</td><td></td></tr><tr><td>Crypta-Grab IMS Beads- חרוזים מגנטיים מצופים בנוגדנים חד שבטיים תגובתי</td><td>Waterborne, Inc</td><td>IMS400-20</td><td>דילול-1:500</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1306</td><td>דילול -1:1,000; RRID : AB_2629482</td></tr><tr><td>Phalloidin-Alexa 674</td><td>Invitrogen</td><td>A22287</td><td>דילול -1:1,000; RRID:</td></tr><tr><td>AB_2620155 נוגדן נגד gp15 של ארנב שנוצר על ידי R. M. O' קונור (מחבר שותף).</td><td>על פי בקשה</td> על <td>פי בקשה</td><td>דילול - 1:500</td></tr><tr><td>Sporo-Glo</td><td>Waterborne, Inc</td><td>A600FLR-1X</td><td>דילול - 1:200</td></tr></tbody></table>

לימוד זיהום הצפנה ברקמה תלת-ממדית-מערכות תרבות מיקרואיד של האדם הנגזר על ידי מיקרו-הזרקה

Studying Cryptosporidium Infection in 3D Tissue-derived Human Organoid Culture Systems by Microinjection

קריפטוספורידיום parvum הוא אחד הגורמים העיקריים של מחלת diarrheal אנושי. כדי להבין את הפתולוגיה של הטפיל ולפתח תרופות יעילות, מערכת תרבות מבחנה המהווה את התנאים במארח יש צורך. אורגנואידים, הדומה מאוד לרקמות המוצא שלהם, הם אידיאליים ללימוד אינטראקציות מארחים-פרזיאליות. אורגנואידים הם תלת-ממדיים (3D) מבנים מבוססי רקמה הנגזרים מתאי גזע בוגרים וגדלים בתרבות לפרקי זמן ארוכים מבלי לעבור סטייה גנטית או טרנספורמציה. יש להם קוטביות מוגדרת היטב עם משטחי פסגה וגם בזלת צלעות. אורגנואידים יש יישומים שונים בדיקות סמים, ביו בנקאות, ומידול מחלות ומארח-חיידק אינטראקציה לימודים. כאן אנו מציגים פרוטוקול צעד אחר צעד של איך להכין את הנבגים ואת הספוראוזוטים של קריפטוספורידיום לזיהום המעי האנושי אורגנואידים. אנו לאחר מכן להדגים כיצד מיקרוהזרקה ניתן להשתמש כדי להזריק את החיידקים לתוך אורגאיד לומן. ישנן שלוש שיטות עיקריות שבהן ניתן להשתמש באורגנואידים למחקרים מארחים-חיידק-מיקרוהזרקה, הטיה מכנית וציפוי, ועל ידי ביצוע monolayers. מיקרוהזרקה מאפשרת תחזוקה של המבנה התלת-ממדי ומאפשרת שליטה מדויקת באמצעי הטפיל והמגע הישיר הרשמי של החיידקים. אנו מספקים פרטים עבור צמיחה אופטימלית של אורגנואידים עבור הדמיה או הייצור הoocyst. בסופו של דבר, אנו גם להדגים כיצד אאוציסטות שנוצר לאחרונה ניתן מבודד אורגאיד עבור המשך עיבוד וניתוח במורד הזרם.

הפרוטוקולים המוצגים כאן התוצאה היא טיהור יעיל של האוציסטות והספורזוטים (איור 1A) מוכן הזרקת מיקרו. הפרוטוקול בתחנת המשטרה מביא לשחרורו של הספוראוזוטים מ-70%-80% מהציסטות, ולכן חיוני לסנן את שאר הפגזים והצדפים דרך מסנן של 3 יקרומטר. הסינון מביא כמעט 100% לטיהור הספוראוזוט (איור 1B). יתר על כן, תוספת של צבע ירוק מסייע להבטיח הזרקה של כל האורגנואידים ומאפשר ויזואליזציה של אורגנואידים מוזרק לפחות עבור 24 שעות לאחר ההזרקה (איור 2B).
...

אנו מתארים פרוטוקולים כדי להכין זיהומים ולטהר את הנבגים עבור לימוד זיהום של המעי האנושי ואורגאואידים על ידי הקריפטוספורידיום parvum. אנו מדגימים את ההליכים למיקרו הזרקה של טפילים לתוך מעיים אורגנואיד וכתמים של אורגנואידים. לבסוף, אנו מתארים את הבידוד. של ציסטות שנוצרו מהאורגנואידים

Cryptosporidium parvum is one of the major causes of human diarrheal disease. To understand the pathology of the parasite and develop efficient drugs, an ...

באמצעות הליך טיהור ומיקרו-ג'ינג'יט זה של ספורוזויט, ניתן ללמוד למעשה כל חיידק מארח בכל מערכת איברים המופקת מרקמות. באמצעות טכניקה זו, אנו יכולים לשלוט על כמות ספורוזואיטים טהורים מוזרק לתוך לומן אורגנואיד או בצד האפי של האורגנואיד. כדי לטהר את C.parvum sporozoites, להעביר את oocyst לצינור 15 מיליליטר ו להשתמש מחדש את התאים באחת פעמים 10 כדי oocyst השביעי לכל ריכוז בינוני excystation מיליליטר.לאחר 60 עד 90 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, לערבב 14 מיליליטר של פתרון לשטוף מתאים עם oocysts, ומעים את התאים על ידי צנטריפוגה. שאפו את העל-טבעי בזהירות כדי להימנע מאיבוד אוציסטות והתינו מחדש את גלולת הספרוזואיקון ב-3 פעמים 10 עד ל-1-2 מיליליטר של ריכוז DMEM. כדי להסיר את כל oocysts הנותרים ופגזים, מניחים חבית מזרק 10 מיליליטר מצויד ב מכשיר מחזיק מסנן 47 מיליליטר מצויד במסנן פוליקרבונט בגודל נקבובית שלושה מיקרומטר לתוך צינור 15 מיליליטר בארבע מעלות צלזיוס.הוסף 7.5 מיליליטר של ההשעיה ספורוזויט להרכבת המסנן. כאשר הנפח כולו עבר דרך מסננת על ידי כוח הכבידה, לשטוף את כל התאים הנותרים דרך מסננת עם עוד 7.5 מיליליטר של DMEM. כאשר כל הכביסה עברה דרך מסננת, לאסוף את ההשעיה ספורוזואיט מסונן על ידי צנטריפוגה במשך 10 דקות ולתייג את גלולה ב 50 כדי 100 microliters של מדיום תרבות אורגנואידית מתאימה, בתוספת 0.05% צבע ירוק מהיר, ו L-גלוטתיון, betaine, L-cysteine, חומצה לינולאית, ו taurine המכיל חיץכדי microinject את הטפילים לתוך הצד apical של אורגנואיד 3D, תחילה להשתמש מושך micropipette להכין נימים הזרקת זכוכית. השתמש במקלפים כדי לחתוך את קצה נימי לקוטר 9 עד 12 מיקרומטר כדי לאפשר זרימה קלה של sporozoites או oocysts, אם תבחר להזריק oocysts ישירות, ולהשתמש טיפים מיקרו מטעין כדי למלא כל נימי עם צבע ירוק מהיר שכותרתו oocyst או השעיה sporozoite. לאחר מכן, לטעון את נימי הראשון מלא ספורוזויט לתוך microinjector ולהשתמש מיקרוסקופ הפוך בהגדלה 5x ולחץ מתמיד microinject 100 כדי 200 nanoliters של ההשעיה לתוך כל organoid.פרוטוקול excystation תוצאות שחרורו של sporozoites מכ 70 עד 80% של oocysts. לכן, חיוני לסנן את קליפות oocyst הנותרים באמצעות סינון שלושה מיקרומטר. הסר כמעט 100% מהבעיות הבלתי מוסברות.יתר על כן, תוספת של צבע ירוק מסייע להבטיח את הזריקה של כל האורגנואידים, ומאפשר הדמיה של אורגנואידים מוזרק לפחות 24 שעות לאחר ההזרקה. למרות שזו שיטה מתורגל היטב, סריקת מיקרוסקופ אלקטרונים יכול לשמש כדי להבטיח כי תהליך excystation לא לפגוע sporozoites או oocysts. הזרקת כמויות שוות של oocysts לתוך לומן אורגנואיד יכול להיות מאושר חזותית על ידי הדמיה מיקרוסקופית פשוטה.בדיקות immunofluorescence יכול לשמש גם כדי לחקור את סוגי התאים הנגועים Cryptosporidium. לאחר האורגנואידים המובחנים נדבקו במשך חמישה ימים, נוכחותם של sporozoites בתוך oocysts ניתן לאשר על ידי ייבוש חלק של oocysts על שקופית דבק, תיקון oocysts עם מתנול, ושילוב כתמי DAPI עם נוגדן ספציפי oocyst מתאים. לקבלת תוצאות מרביות, יש להשתמש ב-oocysts טריים, להשתמש באותו נימי עבור כל הזריקות ולשנות את המדיה כל יום לאחר ההזרקה.באמצעות טכניקה זו, מעבדות שונות מתחילות כעת להשתמש באורגנואידים כדי לחקור אינטראקציות בין חיידקים מארחים. אנו לומדים commensals, כמו גם פתוגנים אחרים בהגדרות מיקרוקולטורה אורגנואידית דומה. כמו Cryptosporidium הוא טפיל אנושי, חשוב לבצע ניסויים אלה על פי תקנות בטיחות ברמה 2.

studying-cryptosporidium-infection-3d-tissue-derived-human-organoid

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

בסרטון זה אנו מדגימים שיטה במבחנה לטיהור ספורוזואיטים מביציות בעלות דופן עבה של הטפיל הפתוגני Cryptosporidium parvum. הספורוזואיטים המבודדים יכולים לשמש למחקרי זיהום.

בידוד Sporozoite במבחנה מ Cryptosporidium parvum ביציות

סרטון זה מדגים טכניקת מיקרו-הזרקה לפיתוח מודל זיהום אורגנואיד מעיים אנושי. שלב sporozoite זיהומיות של הטפיל Cryptosporidium parvum מוזרק מיקרו לתוך לומן אורגנואידי. עם פלישת תאי האפיתל של האורגנואיד, הוא עובר רבייה א-מינית ומינית כדי להשלים את מחזור חייו ומפיץ את הזיהום.

טכניקה לפיתוח זיהום טפיל באורגנואידים במעיים באמצעות מיקרו-הזרקה

פרוטוקול זה מסביר תרבות העיקרית Lgr5-positve organoid והביצועים הבאים של התמרה retroviral. זה מאפשר ביטוי יתר או מציאה Cre-מושרה של transgene נמסר ומאפשר מחקרים פונקציונליים להתבצע ברומן בorganotypic המבחנה   מערכת מודל.

פרוטוקול וידאו של זיהום retroviral ביסודי מעיים Organoid תרבות

בפרוטוקול וידאו זה אנו נותנים הסבר שלב אחר שלב על התמרה לנטי-ויראלית באורגנואידים של אפיתל המעי הראשוני ועל עיבוד וניתוח במורד הזרם של תרביות אלה על ידי RT-PCR כמותית, מיקרו-מערך RNA ואימונוהיסטוכימיה.

פרוטוקול לlentiviral התמרה וניתוח במורד הזרם של המעיים Organoids

תרביות שמקורן בתאי גזע טומנות בחובן פוטנציאל אדיר למידול מחלות זיהומיות. כאן מתוארת תרבית של אורגנואידים בקיבה של עכברים ובני אדם שמקורם בתאי גזע בוגרים. האורגנואידים מוזרקים במיקרו עם פתוגן הקיבה הליקובקטר פילורי.

Organoids כמודל למחלות זיהומיות: התרבות של האדם וOrganoids הקיבה Murine וMicroinjection של הליקובקטר פילורי

פרוטוקול זה מתאר את המדידה של מחסום האפיתל חדירות בטיפול תרופתי בזמן אמת הבאים בהאדם organoids מעיים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ולחיות התא מיקרוסקופ.

בזמן אמת מדידה של מחסום האפיתל חדירות ב Organoids מעיים אנושיים

תא גזע הנגרמת על ידי האדם (היפנוסק)-המעי הנגזר אורגנואידים להציע הזדמנויות מרגש למודל בידור מחלות מבחנה. אנו להדגים את הבידול של hiPSCs לתוך מעיים אורגנואידים (iHOs), גירוי של iHOs אלה עם ציטוקינים, ואת המיקרוהזרקה של סלמונלה typhimurium לתוך לומן ihos, המאפשר לימוד של הפלישה אפיתל על ידי זה פתוגן.

באמצעות תא גזע המושרה האדם Pluriפוטנטי-המעי הנגזר אורגנואידים ללמוד ולשנות את התא אפיתל הגנה מפני סלמונלה ופתוגנים אחרים

כאן אנו מציגים שני פרוטוקולים המאפשרים מידול של אינטראקציות ספציפיות למעיים. מונו-שכבתי מעיים שמקורם באורגנוידים ותרבויות ממשק נוזלי אוויר (ALI) מאפשרות ליצור אפיתליה מובחנת היטב הנגישה הן מצדי הזוהר והן מצד בזולטר, בעוד שאורגנואידים מעיים הפוכים בקוטביות חושפים את הצד האפי שלהם והם נוחים לתפוקה גבוהה.

שיטות תרבות לחקר אינטראקציות ספציפיות לאפיקליות באמצעות מודלים אורגנויד מעיים

הפרוטוקול הנוכחי מתאר הקמת מערכת אורגנואידית של המעי הגס כדי לחקור את הפעילות והתפקוד של תאי גזע המעי הגס במודל נוקאאוט של קלודין-7.

תרבית תלת-ממדית של קריפטות המעי הגס של מורין לחקר תפקוד תאי גזע במעיים ex vivo

אנו מתארים פרוטוקול לבידוד קריפטים של מעי דק מורין ואורגנואידים תלת-ממדיים של תרבית מעיים מהקריפטים. בנוסף, אנו מתארים שיטה ליצירת אורגנואידים מתא גזע יחיד במעי בהיעדר נישה תאית תת-אפיתלית.

תרבית תלת-ממדית של אורגנואידים מקריפטים של מעי מורין ותא גזע יחיד למחקר אורגנואידים

המחקר מציג שיטה לחקר זיהום חיידקי במבחנה באמצעות אורגנואידים במעי שמקורם בתאי גזע ברקמה. הפרוטוקול מתאר כיצד לגדל ולהבחין בין אורגנידים בשני ממדים, להדביק אותם ב-Escherichia coli פולשנית דבקה, ולהעריך קריאות מפתח, כולל פריצת מחסום אפיתליאלי, הדמיית זיהומים ותגובת RNA אפיתליאלית.

תרבית אורגנית דו-ממדית על תמצית פולשת או ממברנת בסיס לחקר אינטראקציות בין מארח לחיידקים

למד שיטות לזיהוי Cryptosporidium parvum באורגנואידים אנושיים תלת-ממדיים באמצעות מיקרו-הזרקה וצביעה אימונית. פרוטוקולים אלה מאפשרים חקר אינטראקציות מארח-מיקרוב במחלות זיהומיות.

לימוד זיהום הצפנה ברקמה תלת-ממדית-מערכות תרבות מיקרואיד של האדם הנגזר על ידי מיקרו-הזרקה

גלה סרטונים נוספים