Name: שיטת בדיקת מעטפת חלבון-RNA כריכת חיידקים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 2 s
Description: למדו שיטה לכימות אפיניות קישור חלבוני RNA בתאי חיידקים חיים באמצעות מבחן דיווח גנטי. השיטה מספקת תובנות קריטיות לגבי אינטראקציות חלבון-RNA בתנאי סביבה תאית טבעיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

פרויקט זה קיבל מימון מתוכנית ה-I-CORE של ועדת התכנון והתקצוב והקרן הישראלית למדעים (גרנט No. 152/11), מארי קירי שילוב מחדש של המענק לא. PCIG11-GA-2012-321675, ומאופק האיחוד האירופי 2020 תוכנית מחקר וחדשנות תחת הסכם מענק מס ' 664918-MRG-דקדוק.

1. הכנת המערכת
<ol><li>תכנון הפלמידים באתר
	<ol>
<li>עצב את קלטת אתר האיגוד כמתואר באיור 1. כל minigene מכיל את החלקים הבאים (5 ' עד 3 '): הגבלת האתר, ∼ 40 בסיסים של 5 ' סוף של kanamycin ' גן ההתנגדות, פנקייק-Ara מקדם, ריבוחלק באתר מחייב (RBS), אוג של הגן mCherry, מרווח (δ), אתר כריכת RBP, 80 בסיסים של 5 ' סוף של הגן של מג. ואתר הגבלת אפאלי הערה: כדי להגדיל את שיעור ההצלחה של המנה, עצב שלוש קלטות של האתר המחייב עבור כל אתר מחייב, עם מרווחים הכוללים לפחות אחד, שניים ושלושה בסיסים. לקבלת הנחיות נוספות, ראה סעיף תוצאות מייצגות.</li>
	</ol></li>
	<li>שיבוט של משטח כריכה
	<ol>
<li>הזמן את הקלטות של אתר האיגוד כמו DNA כפול תקוע (dsDNA) minigenes. כל minigene הוא ∼ 500 bp ארוך ומכיל אתר הגבלה של איקל ואתר הגבלה ApaLI ב 5 ' ו 3 ' מסתיים, בהתאמה (ראה שלב 1.1.1). הערה: בניסוי זה, מיני גנים עם חצי של הגן kanamycin הורו להקל על ההקרנה עבור מושבות חיוביות. עם זאת, מכלול גיבסון17 מתאים גם כאן, ובמקרה זה את האתר הכריכה ניתן להזמין כמו שני קצר יותר משלימים בודדים-DNA oligos.</li>
		<li>יש לעכל את שני הגנים הקטנים ואת וקטור היעד באמצעות הפרוטוקול, והעמודה מטהראת התדר19.</li>
		<li>ליגייט המיניגנים מתעכל לעמוד השדרה של האיגוד המכיל את שאר הגן של העיתונאי mCherry, שליחות קטלנית, ואת התנגדות kanamycin '20.</li>
		<li>הפוך את הפתרון הTOP10 לתוך es, coli קולי תאים21.</li>
		<li>זהה transformants חיוביות באמצעות רצף שםשל Sanger.<ol>
<li>עיצוב פריימר 100 בסיסים במעלה הזרם לאזור העניין (ראה לוח 1 עבור רצפים פריימר).</li>
			<li>. מיניכין כמה מושבות בקטריאלי22</li>
			<li>להכין 5 μL של פתרון 5 מ"מ של פריימר ו 10 μL של ה-DNA ב 80 ng/μL ריכוז.</li>
			<li>שילחו את שני הפתרונות למתקן נוח.</li>
		</ol>
</li>
		<li>חנות הפלסטיק מטוהרים ב-20 ° c, וזנים חיידקיים כמו גליצרול מניות24, הן בפורמט 96-גם. ה-DNA לאחר מכן ישמש לטרנספורמציה לתוך E. coli TOP10 תאים המכילים אחד ארבעה היתוך-rbp פלמידים (ראה שלב 1.3.5).</li>
	</ol></li>
	<li>תכנון ובניית פלסמיד RBP הערה: חומצת אמינו רצפי נוקלאוטיד של חלבונים מעיל המשמשים במחקר זה מפורטים בטבלה 2.<ol>
<li>הזמן את רצף rbp הנדרש חסר קודון לעצור כמו מותאם אישית dsdna minigene חסר הפסקת קודון עם אתרי הגבלה בקצוות (איור 1).</li>
		<li>שיבוט rbp נבדק חסר לעצור קודון מיד במורד של יזם inducible ובמעלה של חלבון פלורסנט חסר קודון להתחיל (איור 1), בדומה לשלבים 1.2.2-1.2.4. ודא כי במרכז RBP מכיל גנים שונים עמידות לאנטיביוטיקה מאשר האיגוד באתר הקשירה.</li>
		<li>זהה transformants חיובי באמצעות רצף שלבים, בדומה לשלב 1.2.5 (ראה לוח 1 עבור רצפים פריימר).</li>
		<li>לבחור טרנספורנט חיובי אחד ולהפוך אותו כימית מוסמך25. חנות כמו גליצנול מטוהרים פלמידים ב-20 ° צ' וגליצרול מלאי של זנים חיידקיים24 ב-80 ° c ב 96-טוב צלחות.</li>
		<li>הפוך את הפלמידים באתר האיגוד (משלב 1.2.6) המאוחסנים 96-היטב צלחות לתוך תאים חיידקיים כימית מוסמך כבר מכיל RBP-mCerulean פלמיד21. כדי לחסוך זמן, במקום להתאים את התאים על מנות פטרי, לוחית אותם באמצעות שמונה ערוצים של מצנאו על לוחות 8-ליין המכילים לוריא-ברטני (LB)26 אגר עם אנטיביוטיקה רלוונטיים (Kan ו Amp). . המושבות אמורות להופיע ב -16 שעות</li>
		<li>בחר מושבה אחת עבור כל טרנספורנט כפול ולצמוח לילה במדיום LB עם אנטיביוטיקה הרלוונטיים (קאן ו Amp) ולאחסן כמו גליצרול מניות24 ב-80 ° c ב 96-טוב צלחות.</li>
	</ol></li>
</ol>2. התקנת ניסוי
הערה: הפרוטוקול המוצג כאן בוצע באמצעות מערכת רובוטית עם טיפול נוזלי בשילוב עם אינקובטור וקורא צלחת. כל מדידה בוצעה עבור 24 ריכוזי סליל, עם שני כפילויות עבור כל מאמץ + הסליל שילוב. באמצעות מערכת רובוטית זו, נתונים עבור 16 זנים ליום עם 24 ריכוזי סליל נאסף. עם זאת, אם התקן כזה אינו זמין, או אם יש פחות ניסויים נחוצים, ניתן לעשות זאת בקלות באמצעות מולטי-פיפטה של 8 ערוצים והתאמת הפרוטוקול בהתאם. לדוגמה, תוצאות ראשוניות של ארבעה זנים ליום עם 12 ריכוזי סליל וארבעה נקודות זמן נרכשו באופן זה.
<ol><li>היכונו, מראש, 1 L של מאגר ביולוגי (BA) על ידי ערבוב 0.5 g של טריטונים, 0.3 מ ל של גליצרול, 5.8 g של נרוג, 50 mL של 1 M MgSO4, 1 מ ל של מלוחים 10x פוספט באגירה (PBS) מאגר pH 7.4, ו-950 mL של מים כפולים מזוקקים סינון באמצעות אוטוקלב או סטרילי מאגר ה-BA.</li>
	<li>לגדל את זנים הטרנספורקנטים כפולה ב 37 ° צ' ו 250 rpm לרעוד 1.5 mL ליברות עם אנטיביוטיקה המתאימה (kanamycin בריכוז הסופי של 25 μg/mL ו אמפיצילין בריכוז הסופי של ה100 μg/mL), בשנת 48 לוחות, במשך תקופה של 18 h (לילה).</li>
	<li>
בבוקר, בצע את ההכנות הבאות.
	<ol>
<li>. לוחית השראה בצלחת נקייה 96-באר, להכין בארות עם מדיום חצי עני (SPM) המורכב של 95% BA ו 5% LB26 בחממה ב 37 ° c. מספר הבארות מקביל למספר הרצוי של ריכוזי הסליל. הוסף C4-HSL לבארות בצלחת הסליל שיכיל את הריכוז הגבוה ביותר הסליל (218 nM).</li>
		<li>תכנת את הרובוט כדי לדלל בינונית באופן סדרתי מכל אחד הבארות ריכוז הגבוהה ביותר 23 ריכוזים נמוכים החל מ 0 כדי 218 ננומטר. נפח של דילול כל הסליל צריך להספיק עבור כל הזנים (כולל כפילויות).</li>
		<li>בעוד הדילול הסליל הם להיות מוכנים, חם 180 μL של SPM בחממה ב 37 ° c, ב 96-טוב צלחות.</li>
		<li>לדלל את הזנים לילה משלב 2.2 על ידי פקטור של 100 על ידי דילול סדרתי: הראשון לדלל על ידי גורם של 10 על ידי ערבוב 100 μL של חיידקים עם 900 μL של SPM ב 48-טוב צלחות, ולאחר מכן לדלל שוב על ידי גורם של 10 על ידי נקיטת 20 μL מהפתרון מדולל לתוך 180 μL של מקדם-התחממות-מחמם, ב 96-טוב צלחות מתאים למדידות פלורסנט.</li>
		<li>הוסף את הסליל מדולל מן הצלחת הסליל אל 96-היטב צלחות עם זנים מדולל בהתאם לריכוזים הסופי.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לנער את 96-היטב צלחות ב 37 ° צ' עבור 6 h, תוך נטילת מדידות של צפיפות אופטית ב 595 nm (OD595), mcherry (560 nm/612 nm) ו mCerulean (460 nm/510 nm) הזריחה דרך קורא צלחת כל 30 דקות. למטרות נורמליזציה, מדידת הצמיחה של SMP ללא תאים שנוספו.</li>
</ol>3. ניתוח תוצאות ראשוניות
<ol><li>לכל יום של ניסוי, בחר מרווח זמן של גידול לוגריתמי לפי עקומות הגדילה הנמדדות, בין שלב הצמיחה הליניארי לבין הנייח (T0, tfinal). קח כ 6-8 נקודות זמן, תוך השמטת המידות הראשונות והאחרונות כדי למנוע שגיאה הנגזרת מחוסר דיוק בזיהוי הגדילה האקספוננציאלי (ראה איור 2A, הלוח העליון). הערה: להשליך זנים הצגת עקומות גדילה נורמלי או זנים שבו לא ניתן לזהות את שלב הגדילה לוגריתמי ולחזור על הניסוי.</li>
	<li>
לחשב את הזריחה המנורמלת הממוצעת של mCerulean ושיעור הייצור של mCherry, מהנתונים הגולמיים של mCerulean ו-הקרינה הפלואורסצנטית עבור כל ריכוז הסליל (איור 2A).
	<ol>
<li>חשב mCerulean מנורמל כדלקמן: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/59611/59611eq1.jpg"> כאשר blank (mCerulean) הוא הרמה הmCerulean [a.u.] עבור בינונית בלבד, blank (OD) היא הדחיסות האופטית עבור בינונית בלבד, ו-mCerulean ו-OD הם ערכי הדחיסות האופטית והאופטים של mCerulean, בהתאמה.</li>
		<li>ממוצע mCerulean על נקודות זמן שונות (איור 2B, שני לוחות העליון) כדלקמן: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/59611/59611eq2.jpg"> כאשרTime נקודות הוא מספר נקודות הזמן של הנתונים שנלקחו בחשבון, T0 הוא הזמן שבו מתחיל שלב הגידול האקספוננציאלי, ו-tfinal הוא הזמן בו מסתיים שלב הגידול האקספוננציאלי.</li>
		<li>חשב את שיעור הייצור של mCherry (איור 2B, שני הפאנלים התחתונים) כדלקמן: <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/59611/59611eq3.jpg"> כאשר mCherry (t) היא רמת mCherry [a.u.] בזמן t, OD הוא ערך הצפיפות האופטית, T0 הוא הזמן שבו שלב הגידול האקספוננציאלי מתחיל, ו-t הסופי הוא הזמן שבו שלב הגידול האקספוננציאלי מסתיים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לבסוף, התווה את שיעור הייצור של mCherry כפונקציה של mCerulean, יצירת עקומות של תגובת מינון כפונקציה של היתוך RBP-mCerulean פיוז'ן (איור 2C). חלקות כאלה מייצגות ייצור של גן העיתונאי כפונקציה של נוכחות RBP בתא.</li>
</ol>4. מינון פונקציה התאמה התאמת שגרתית KRbp חילוץ
<ol><li>תחת ההנחה כי הריבוכמה שיעור התרגום עם מאוגד RBP הוא קבוע, לדגמן את שיעור הייצור mCherry כדלקמן (ראה איור 2D, הקו הירוק): <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/59611/59611eq4.jpg"> כאשר [x] הוא הmCerulean הממוצע המנורמל מחושב על פי Eq .2, שיעור ייצור mCherry הוא הערך המחושב על פי Eq .3, KRbp הוא הזיקה קשירה היחסי [a.u.], k לא מאוגד הוא הריבוכמה קצב של תרגום עם RBP לא מאוגד, n הוא הגורם הקופרקטיביות, ו-C הוא הזריחה הבסיסית [a.u.]. C, n, Kלא מאוגד, ו Krbp נמצאים על ידי התאמת נתוני שיעור הייצור Mcherry למודל (Eq. 4).</li>
	<li>באמצעות תוכנה לניתוח נתונים, לנהל הליך הולם על מגרשים המתארים שיעור ייצור mCherry כפונקציה של הממוצע mCerulean (שלב 3.3), ולחלץ את הפרמטרים להתאים בהתאם לנוסחה Eq .4. הערה: רק תוצאות מתאימים עם R2 &gt; 0.6 נלקחים בחשבון. עבור אלה מתאימים, KRbp שגיאה היא בעיקר בטווח של 0.5% כדי 20% של ערכי Krbp , עבור מרווח ביטחון 0.67, בעוד אלה עם שגיאה krbp גבוהה יותר ניתן לאמת גם על ידי עין.</li>
	<li>לנרמל ערכי KRbp לפי הערך המקסימלי המתאים של הממוצע mCerulean עבור כל פונקציה תגובה מינון. <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/59611/59611eq5.jpg"> כאשר KRbp ב [a.u.] הוא הערך שחולצו מתוך הליך המדידה Eq. 4, ומקסימום (בממוצע mCerulean) הוא האות המקסימלי mCerulean הממוצע [a. u] שנצפו את המתח הנוכחי. הערה: הנורמליזציה מאפשרת השוואה נכונה של ההשפעה התקינה על פני זנים על-ידי ביטול התלות ברמות הביטוי המקסימלי RBP בפרט.</li>
</ol>

<ol><li>Cerretti, D. P., Mattheakis, L. C., Kearney, K. R., Vu, L., Nomura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+regulation+of+the+spc+operon+in+Escherichia+coli.+Identification+and+structural+analysis+of+the+target+site+for+S8+repressor+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Translational regulation of the spc operon in Escherichia coli. Identification and structural analysis of the target site for S8 repressor protein.</a> Journal of Molecular Biology. 204 (2), 309-329 (1988).</li>
<li>Babitzke, P., Baker, C. S., Romeo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+translation+initiation+by+RNA+binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Regulation of translation initiation by RNA binding proteins.</a> Annual Review of Microbiology. 63, 27-44 (2009).</li>
<li>Van Assche, E., Van Puyvelde, S., Vanderleyden, J., Steenackers, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-binding+proteins+involved+in+post-transcriptional+regulation+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">RNA-binding proteins involved in post-transcriptional regulation in bacteria.</a> Frontiers in Microbiology. 6, 141(2015).</li>
<li>Chappell, J., Watters, K. E., Takahashi, M. K., Lucks, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+renaissance+in+RNA+synthetic+biology%3A+new+mechanisms%2C+applications+and+tools+for+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">A renaissance in RNA synthetic biology: new mechanisms, applications and tools for the future.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 28, 47-56 (2015).</li>
<li>Wagner, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-molecule-based+regulation+of+RNA-delivered+circuits+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Small-molecule-based regulation of RNA-delivered circuits in mammalian cells.</a> Nature Chemical Biology. 14 (11), 1043(2018).</li>
<li>Bendak, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+method+for+assessing+the+RNA-binding+potential+of+a+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">A rapid method for assessing the RNA-binding potential of a protein.</a> Nucleic Acids Research. 40 (14), e105(2012).</li>
<li>Strein, C., Alleaume, A. -M., Rothbauer, U., Hentze, M. W., Castello, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+assay+for+RNA-binding+proteins+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">A versatile assay for RNA-binding proteins in living cells.</a> RNA. 20 (5), 721-731 (2014).</li>
<li>Ule, J., Jensen, K. B., Ruggiu, M., Mele, A., Ule, A., Darnell, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CLIP+identifies+Nova-regulated+RNA+networks+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">CLIP identifies Nova-regulated RNA networks in the brain.</a> Science. 302 (5648), 1212-1215 (2003).</li>
<li>Lee, F. C. Y., Ule, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+CLIP+Technologies+for+Studies+of+Protein-RNA+Interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Advances in CLIP Technologies for Studies of Protein-RNA Interactions.</a> Molecular Cell. 69 (3), 354-369 (2018).</li>
<li>Katz, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+Vivo+Binding+Assay+for+RNA-Binding+Proteins+Based+on+Repression+of+a+Reporter+Gene%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">An in Vivo Binding Assay for RNA-Binding Proteins Based on Repression of a Reporter Gene.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (12), 2765-2774 (2018).</li>
<li>Watters, K. E., Yu, A. M., Strobel, E. J., Settle, A. H., Lucks, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+RNA+structures+in+vitro+and+in+vivo+with+selective+2%E2%80%99-hydroxyl+acylation+analyzed+by+primer+extension+sequencing+%28SHAPE-Seq%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Characterizing RNA structures in vitro and in vivo with selective 2’-hydroxyl acylation analyzed by primer extension sequencing (SHAPE-Seq).</a> Methods. 103, 34-48 (2016).</li>
<li>Saito, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+translational+regulation+by+an+L7Ae-kink-turn+RNP+switch%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Synthetic translational regulation by an L7Ae-kink-turn RNP switch.</a> Nature Chemical Biology. 6 (1), 71-78 (2010).</li>
<li>Gott, J. M., Wilhelm, L. J., Uhlenbeck, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+binding+properties+of+the+coat+protein+from+bacteriophage+GA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">RNA binding properties of the coat protein from bacteriophage GA.</a> Nucleic Acids Research. 19 (23), 6499-6503 (1991).</li>
<li>Peabody, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA+binding+site+of+bacteriophage+MS2+coat+protein%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">The RNA binding site of bacteriophage MS2 coat protein.</a> The EMBO Journal. 12 (2), 595-600 (1993).</li>
<li>Lim, F., Peabody, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+recognition+site+of+PP7+coat+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">RNA recognition site of PP7 coat protein.</a> Nucleic Acids Research. 30 (19), 4138-4144 (2002).</li>
<li>Lim, F., Spingola, M., Peabody, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA-binding+Site+of+Bacteriophage+Q%CE%B2+Coat+Protein%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The RNA-binding Site of Bacteriophage Qβ Coat Protein.</a> Journal of Biological Chemistry. 271 (50), 31839-31845 (1996).</li>
<li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li>
<li>NEB. Optimizing Restriction Endonuclease Reactions. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://international.neb.com/tools-and-resources/usage-guidelines/optimizing-restriction-endonuclease-reactions">https://international.neb.com/tools-and-resources/usage-guidelines/optimizing-restriction-endonuclease-reactions</a> (2018).</li>
<li>Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System Protocol. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://worldwide.promega.com/resources/protocols/technical-bulletins/101/wizard-sv-gel-and-pcr-cleanup-system-protocol/">https://worldwide.promega.com/resources/protocols/technical-bulletins/101/wizard-sv-gel-and-pcr-cleanup-system-protocol/</a> (2018).</li>
<li>NEB. Ligation Protocol with T4 DNA Ligase (M0202). , Available from:
 <a target="_blank" href="https://international.neb.com/protocols/0001/01/01/dna-ligation-with-t4-dna-ligase-m0202">https://international.neb.com/protocols/0001/01/01/dna-ligation-with-t4-dna-ligase-m0202</a> (2018).</li>
<li>Routine Cloning Using Top10 Competent Cells - US. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/protocols/cloning/competent-cells-protocol/routine-cloning-using-top10-competent-cells.html">https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/protocols/cloning/competent-cells-protocol/routine-cloning-using-top10-competent-cells.html</a> (2018).</li>
<li>NucleoSpin Plasmid - plasmid Miniprep kit. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.mn-net.com/ProductsBioanalysis/DNAandRNApurification/PlasmidDNApurificationeasyfastreliable/NucleoSpinPlasmidplasmidMiniprepkit/tabid/1379/language/en-US/Default.aspx">https://www.mn-net.com/ProductsBioanalysis/DNAandRNApurification/PlasmidDNApurificationeasyfastreliable/NucleoSpinPlasmidplasmidMiniprepkit/tabid/1379/language/en-US/Default.aspx</a> (2018).</li>
<li>Sanger, F., Coulson, A. R., Barrell, B. G., Smith, A. J. H., Roe, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+in+single-stranded+bacteriophage+as+an+aid+to+rapid+DNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cloning in single-stranded bacteriophage as an aid to rapid DNA sequencing.</a> Journal of Molecular Biology. 143 (2), 161-178 (1980).</li>
<li>Addgene. Protocol - How to Create a Bacterial Glycerol Stock. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.addgene.org/protocols/create-glycerol-stock/">https://www.addgene.org/protocols/create-glycerol-stock/</a> (2018).</li>
<li>NEB. Making your own chemically competent cells. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://international.neb.com/protocols/2012/06/21/making-your-own-chemically-competent-cells">https://international.neb.com/protocols/2012/06/21/making-your-own-chemically-competent-cells</a> (2018).</li>
<li>Luria-Bertani (LB) Medium Preparation · Benchling. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://benchling.com/protocols/gdD7XI0J/luria-bertani-lb-medium-preparation">https://benchling.com/protocols/gdD7XI0J/luria-bertani-lb-medium-preparation</a> (2018).</li>
<li>Delebecque, C. J., Silver, P. A., Lindner, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designing+and+using+RNA+scaffolds+to+assemble+proteins+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Designing and using RNA scaffolds to assemble proteins in vivo.</a> Nature Protocols. 7 (10), 1797-1807 (2012).</li>
<li>Hocine, S., Raymond, P., Zenklusen, D., Chao, J. A., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+analysis+of+gene+expression+using+two-color+RNA+labeling+in+live+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-molecule analysis of gene expression using two-color RNA labeling in live yeast.</a> Nature Methods. 10 (2), 119-121 (2013).</li>
<li>Espah Borujeni, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+quantification+of+translation+inhibition+by+mRNA+structures+that+overlap+with+the+ribosomal+footprint+in+N-terminal+coding+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Precise quantification of translation inhibition by mRNA structures that overlap with the ribosomal footprint in N-terminal coding sequences.</a> Nucleic Acids Research. 45 (9), 5437-5448 (2017).</li>
<li>Ding, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+genome-wide+profiling+of+RNA+secondary+structure+reveals+novel+regulatory+features%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vivo genome-wide profiling of RNA secondary structure reveals novel regulatory features.</a> Nature. 505, (2013).</li>
<li>Rouskin, S., Zubradt, M., Washietl, S., Kellis, M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+probing+of+RNA+structure+reveals+active+unfolding+of+mRNA+structures+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genome-wide probing of RNA structure reveals active unfolding of mRNA structures in vivo.</a> Nature. 505 (7485), 701-705 (2014).</li>
<li>Lucks, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+RNA+structure+characterization+with+selective+2%E2%80%99-hydroxyl+acylation+analyzed+by+primer+extension+sequencing+%28SHAPE-Seq%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Multiplexed RNA structure characterization with selective 2’-hydroxyl acylation analyzed by primer extension sequencing (SHAPE-Seq).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (27), 11063-11068 (2011).</li>
<li>Spitale, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+imprints+in+vivo+decode+RNA+regulatory+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural imprints in vivo decode RNA regulatory mechanisms.</a> Nature. 519 (7544), 486(2015).</li>
<li>Watters, K. E., Abbott, T. R., Lucks, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+characterization+of+cellular+RNA+structure+and+function+with+in-cell+SHAPE-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Simultaneous characterization of cellular RNA structure and function with in-cell SHAPE-Seq.</a> Nucleic Acids Research. 44 (2), e12(2016).</li>
<li>Flynn, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome-wide+interrogation+of+RNA+secondary+structure+in+living+cells+with+icSHAPE%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Transcriptome-wide interrogation of RNA secondary structure in living cells with icSHAPE.</a> Nature Protocols. 11 (2), 273-290 (2016).</li>
<li>Bernardi, A., Spahr, P. -F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleotide+Sequence+at+the+Binding+Site+for+Coat+Protein+on+RNA+of+Bacteriophage+R17%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Nucleotide Sequence at the Binding Site for Coat Protein on RNA of Bacteriophage R17.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 69 (10), 3033-3037 (1972).</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

השיטה המתוארת במאמר זה מקלה כמותית במדידה vivo של RBP-RNA הזיקה הקשירה בתאים E. coli . הפרוטוקול קל יחסית וניתן להתנהל ללא שימוש במכונות מתוחכמות, וניתוח נתונים הוא פשוט. כמו-כן, התוצאות מיוצרות מיד, ללא הזמן ההמתנה הארוך המשויך לתוצאות רצף הדור הבא (NGS).
מגבלה אחת לשיטה זו היא שזה עובד רק בתאים חיידקיים. עם זאת, המחקר הקודם12 הוכיחה אפקט הדיכוי באמצעות גישה דומה L7AE rbp בתאי היונקים. מגבלה נוספת של השיטה היא שהכנסת אתר האיגוד באזור הייזום של mCherry עלולה לד...

ה-RNA כריכת חלבון (RBP) מבוסס לאחר ההמרה רגולציה, אפיון במיוחד של האינטראקציה בין Rbp ו-RNA, נחקרו בהרחבה בעשורים האחרונים. ישנן מספר דוגמאות של התקנה למטה הטרנסלtional בחיידקים שמקורם rbps עיכוב, או מתחרה ישירות עם, ריבוכמה קשירה1,2,3. בתחום הביולוגיה הסינתטית, האינטראקציות של rbp-RNA מתפתחות ככלי משמעותי לעיצוב המעגלים הגנטיים המבוססים על תמלול4,5. לכן, קיימת עלייה בביקוש לאפיון של אינטראקציות RBP-RNA כגון בהקשר הסלולר.
השיטות הנפוצות ביותר ללימוד אינטראקציות של חלבון-RNA הן שיטת השינוי בשיטת הניידות האלקטרופיניטית (emsa)6, המוגבלת להגדרות חוץ-גופית, ושונות משיכה מספר7, כולל שיטת הקליפ8,9 . בעוד שיטות כאלה לאפשר גילוי של אתרי האיגוד של דה נובו RNA, הם סובלים מחסרונות כגון פרוטוקולים עתירי עבודה ותגובות ברצף יקר והוא עשוי לדרוש נוגדן ספציפי עבור RBP למשוך למטה. בשל האופי הפגיע של RNA לסביבתו, גורמים רבים יכולים להשפיע על אינטראקציות RBP-RNA, תוך שימת דגש על החשיבות של חקירת מחייב RBP-RNA בהקשר הסלולר. לדוגמא, אנחנו ואחרים הדגמנו הבדלים משמעותיים בין מבני RNA בvivo ובתוך מבחנה10,11.
בהתבסס על הגישה של המחקר הקודם12, לאחרונה הפגינו10 כי כאשר ממקמים מעוצב מראש אתרי קשירה עבור capsid rbps מתוך בקטביאז GA13, MS214, PP715, ו Qβ16 ב התרגום האזור של כתבת mRNA, ביטוי העיתונאי הוא מודחק מאוד. אנו מציגים שיטה פשוטה יחסית וכמותית, המבוססת על תופעה זו של דיכוי, כדי למדוד את הזיקה בין RBPs לאתר המקבילשל ה -RNA שלהם ב-vivo.

<table><tbody><tr><td>מלח נתרן Ampicillin</td><td>SIGMA</td><td>A9518</td><td></td></tr><tr><td>מגנזיום גופרתי (MgSO4)</td><td>ALFA AESAR</td><td>33337</td><td></td></tr><tr><td>48 צלחות</td><td>Axygen</td><td>P-5ML-48-C-S</td><td></td></tr><tr><td>צלחות 8 נתיבים</td><td>Axygen</td><td>RESMW8I</td><td></td></tr><tr><td>צלחות 96 בארות</td><td>Axygen</td><td>P-DW-20-C</td><td></td></tr><tr><td>צלחות 96 בארות לקורא צלחות</td><td>Perkin Elmer</td><td>6005029</td><td></td></tr><tr><td>ApaLI</td><td>NEB</td><td>R0507</td><td></td></tr><tr><td>רצפי אתר קשירה</td><td>Gen9 Inc. ו-Twist Bioscience</td><td></td><td>ראה טבלה 1</td></tr><tr><td>E. coli תאי TOP10</td><td>Invitrogen</td><td>C404006</td><td></td></tr><tr><td>Eagl-HF</td><td>NEB</td><td>R3505</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>BIO LAB</td><td>071205</td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td> חממה <td></td><td>אייקונית</td> <td>של TECAN</td></tr><tr><td>Kanamycin solfate</td><td>SIGMA</td><td>K4000</td><td></td></tr><tr><td>KpnI- HF</td><td>NEB</td><td>R0142</td><td></td></tr><tr><td>Ligase</td><td>NEB</td><td>B0202S</td> מערכת רובוטית לטיפול בנוזלים <td></td></tr><tr><td></td><td>TECAN</td><td>EVO 100, MCA 96 ערוצים</td><td></td></tr><tr><td>תוכנת ניתוח Matlab</td><td>Mathworks</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multi-pipette 8 נתיבים</td><td>Axygen</td><td>BR703710</td><td></td></tr><tr><td>N-butanoyl-L-homoserine lactone (C4-HSL)</td> <td>קיימן</td><td>K40982552 019</td><td></td></tr><tr><td>PBS buffer</td><td>תעשיות ביולוגיות</td><td>020235A</td><td></td></tr><tr><td>קורא פלטות</td><td>TECAN</td><td>Infinite F200 PRO</td><td></td></tr><tr><td>Q5 HotStart פולימראז</td><td>NEB</td><td>M0493</td><td></td></tr><tr><td>RBP seqeunces</td><td>Addgene</td><td>27121 & 40650</td><td>ראה טבלה 2</td></tr><tr><td>נתרן כלורי (NaCL)</td><td>BIO LAB</td><td>190305</td><td></td></tr><tr><td>SV ג'ל ומערכת ניקוי PCR</td><td>Promega</td><td>A9281</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>BD</td><td>211705</td><td></td></tr></tbody></table>

שיטת בדיקת מעטפת חלבון-rna כריכת חיידקים

An Assay for Quantifying Protein-RNA Binding in Bacteria

בשלב החניכה של תרגום חלבונים, הריבוחלק נקשר לאזור החניכה של mRNA. אתחול תרגום ניתן לחסום על ידי איגוד של חלבון כריכת RNA (RBP) לאזור החניכה של mRNA, אשר מפריעה עם ריבוכמה הכריכה. בשיטה המוצגת, אנו מנצלים את תופעת החסימה הזאת לכמת את הזיקה המחייב של rbps לאתרים שאינם מחייבים קנצוני שלהם. כדי לעשות זאת, אנו מכניסים אתר מחייב בדיקה באזור החניכה של העיתונאי mRNA ולגרום לביטוי RBP הבדיקה. במקרה של RBP-RNA כריכה, הבחנו דיכוי החתימה של ביטוי הכתב כפונקציה של ריכוז RBP. במקרה של חוסר אהדה או זיקה נמוכה מאוד בין אתר האיגוד ל-RBP, לא נצפתה דיכוי משמעותי. השיטה מבוצעת בתאי חיידקי חיים, ואינה דורשת מכונות יקרות או מתוחכמות. היא שימושית לכימות והשוואה בין הקשרים המחייבים של האיגוד של RBPs שונים הפונקציונליים בחיידקים לקבוצה של אתרי איגוד מעוצבים. שיטה זו עשויה להיות לא מתאימה לאתרי איגוד בעלי מורכבות מבנית גבוהה. זאת בשל האפשרות של דיכוי של חניכה הריבוזומלית על ידי מבנה mRNA מורכב בהעדר RBP, אשר יגרום הביטוי הנמוך ביותר גנים כתבת בסיס, ולכן הדיכוי כתב פחות הנצפה על הכריכה RBP.

השיטה המוצגת מנצלת את התחרות בין RBP לבין הריבוחלק לכריכה למולקולה mRNA (איור 1). תחרות זו משתקפת על ידי הפחתת רמות mCherry כפונקציה של ייצור מוגבר של RBP-mCerulean, בשל ריכוזי הגוברת של הסליל. במקרה של הגדלת mCerulean פלואורסצנטית, ללא שינויים משמעותיים ב-mCherry, חוסר של כריכת RBP הוא להסיק. תוצאות הנציג הן חיובי והן זן שלילי מתוארים באיור 2. באיור 2A, ה-OD, mcherry, ו mCerulean ערוצים מוצגים כפונק...

בשיטה זו, אנו מכמת את הזיקה המחייב של מאגד כריכת RNA (rbps) כדי קנצוני ואתרי כריכה שאינם קנצוני באמצעות שיטה פשוטה, לחיות, העיתונאי בתאי חיידקי. השיטת היסוד מבוססת על דיכוי של גן עיתונאי.

שיטת בדיקת מעטפת חלבון-RNA כריכת חיידקים

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding ...

אפיון חלבון מחייב RNA in vivo נשאר אתגר גדול בשל האופי המורכב של RNA ואת הגורמים הרבים המשפיעים על האינטראקציה שלה עם חלבונים. חלבון מחייב RNA או זיקה RBP-RNA נמדד בתוך תאים חיידקיים חיים. מאז הסביבה התאית משפיעה הן על המבנה של RNA והן על איגוד RBP-RNA וכתוצאה מכך, מדידת הזיקה ב- vivo חיונית להבנת אינטראקציות כאלה במערכות טבעיות.סוד ההצלחה הוא בעיצוב הפלסמידים. העיצוב צריך להשתמש במספר גלים של דלתא ולהימנע החדרת קודונים להפסיק מוטציות מסגרות. התחל פרוטוקול זה על-ידי עיצוב קלטת אתר האיגוד.כל גן מיני מכיל אתר הגבלת EagI, 40 בסיסים מחמשת הקצה העיקרי של גן ההתנגדות לקאנאמיצין, מקדם pLac/Ara, אתר כריכת הריבוזום, AUG של הגן mCherry, מרחב, אתר כריכת RBP, 80 בסיסים מחמשת החלקים הראשונים של הגן mCherry, ואתר הגבלת ApaLI. כדי להגדיל את שיעור ההצלחה של ההתראה, תכנן שלוש קלטות אתר מחייבות עבור כל אתר איגוד עם רווחים המורכבים לפחות מבסיס אחד, שניים ושלושה בסיסים. לעכל פעמיים הן את הגנים מיני ואת וקטור היעד עם EagI HF ו ApaLI לפני ביצוע טיהור עמודה של העיכול.Ligate הגנים מיני מתעכל עמוד השדרה של האתר מחייב המכיל את שאר הגן כתב mCherry, שליחות קטלנית ותנאם עמידות kanamycin. לאחר מכן להפוך את פתרון קשירה לתוך Escherichia coli העליון 10 תאים. לאחר זיהוי שנאים חיוביים באמצעות רצף סנגר, לאחסן פלסמידים מטוהרים בפורמט 96 גם במינוס 20 מעלות צלזיוס.גם לאחסן את הזנים חיידקי כמו מניות גליצרול בפורמט 96 גם במינוס 80 מעלות צלזיוס. סדר מותאם אישית את רצף RBP הנדרש חסר קודון עצירה כגן מיני DNA כפול תקוע עם אתרי הגבלה בקצוות. הפוך את הפלסמידים המוכנים לתאי חיידקים מוכשרים מבחינה כימית שכבר מכילים פלסמיד RBP mCerulean.כדי לחסוך זמן, צלחת התאים באמצעות צינור שמונה ערוצים על שמונה לוחות נתיב המכילים לוריא-ברתאני אגר עם אנטיביוטיקה רלוונטית. מושבות אמורות להופיע בעוד 16 שעות ב-37 מעלות צלזיוס. בחר מושבה אחת עבור כל טרנספורמנט כפול ולהעביר 48 צלחות באר המכיל 1.5 מיליליטר של LB עם אנטיביוטיקה מתאימה.לגדל את התאים על פני תקופה של 18 שעות ב 37 מעלות צלזיוס רועד ב 250 סל"ד. לאחסן את הלילה כמו מניות גליצרול במינוס 80 מעלות צלזיוס ב 96 צלחות באר. בבוקר, לתכנת את הרובוט לחמם 180 microliters של בינוני חצי נקבוביות או SPM ב 96 צלחות גם.תכנת את הרובוט להכין את צלחת התמריצים. בצלחת נקייה של 96 בארות, הכינו בארות עם SPM המורכב מ-95% BA ו-5%LB. מספר בארות מתאים למספר הרצוי של ריכוזי inducer.הוסף C4-HSL ל בארות בצלחת inducer שיכיל את ריכוז inducer הגבוה ביותר. לאחר מכן, לתכנת את הרובוט כדי לדלל באופן סדרתי בינוני מכל בארות הריכוז הגבוה ביותר לתוך 23 ריכוזים נמוכים יותר החל אפס עד 218 nanomolar. הנפח של כל דילול מעורר צריך להיות מספיק עבור כל הזנים.כדי לדלל את זנים לילה, לתכנת את הרובוט לדלל על ידי גורם של 10 על ידי ערבוב 20 microliters של חיידקים עם 180 microliters של SPM ב 48 צלחות היטב. ואז לדלל שוב על ידי גורם של 10 על ידי לקיחת 20 microliters מהתספורת מדולל לתוך צלחת המתח מוכן מראש מתאים למדידת פלואורסצנט. עכשיו לתכנת את הרובוט להוסיף את inducer מדולל מן צלחת inducer כדי 96 צלחות גם עם זנים מדוללים על פי הריכוזים הסופיים.לנער את 96 צלחות באר ב 37 מעלות צלזיוס במשך שש שעות. במהלך תקופה זו, לקחת מדידות של צפיפות אופטית או OD ב 595 ננומטר, כמו גם mCherry ו mCerulean פלואורסצנטיות באמצעות קורא צלחת כל 30 דקות. למטרות נורמליזציה, למדוד צמיחה של SPM ללא תאים שנוספו.מוצגות כאן עלילות תלת מימדיות למתח חיובי. העלילות מתארות רמות OD גולמיות, פלואורסצנטיות אקרולית ו פלואורסצנטיות mCherry כפונקציה של זמן וריכוז מעורר. רמות ביטוי מצב יציב mCerulean חושבו עבור כל ריכוז inducer עבור זנים חיוביים ושליליים.קצב הייצור של mCherry חושב גם עבור כל ריכוז גורם עבור זנים חיוביים ושליליים. m אחוזי ייצור התווה כפונקציה של פלואורסצנטיות mCerulean ממוצע מעל שני כפילויות ביולוגיות עבור שני זנים. ההתאמה KRBP באמצעות הנוסחה המתאימה מוצגת עבור המתח החיובי המציג תגובת איגוד ספציפית.עבור הזן השלילי, לא מופק ערך KRBP. עקומות תגובה מינון מנורמל נקבעו עבור 30 זנים שונים המבוססים על שני RBPs כמו 10 אתרי איגוד במקומות שונים. שלושה סוגים של תגובות נצפו, זיקה גבוהה, זיקה נמוכה, ואין זיקה.מוצגות כאן תוצאות KRBP כמותיות עבור שני RBPs, חלבון מעיל MS2 וחלבון מעיל PP7 עם 10 קלטות אתר מחייבות שונות. עקומות תגובה מינון עבור חלבון מעיל MS2 עם אתר מחייב מוטציה בארבעה מקומות שונים מוצגים כאן כדי להדגים את ההשפעה של ריווח מוטנטים על ייצור mCherry. הרצף של אתר האיגוד שעבר מוטציה שנבדק מוצג.חשוב להשתמש בטכניקה מבנית כגון צורה המבקשים לחקור כימית את המבנה של קומפלקס החלבון-RNA ולהמחיש אילו אזורי mRNA מושפעים מחייב RNA. לאחרונה, השתמשנו בטכניקה זו באופן תפוקה גבוהה כדי למדוד בו זמנית את הזיקה של RBPs ל 10, 000 אתרי איגוד.

an-assay-for-quantifying-protein-rna-binding-in-bacteria

Research

JoVE Journal

Genetics

גנטיקה

סרטון זה מדגים את פעולת הנימים הרדיאלית הדיפרנציאלית של בדיקת ליגנד - טכניקה לסינון שיטתי בתפוקה גבוהה של נוקלאוטיד תוך-תאי חלבונים קושרי שליח שני. טכניקה זו מאפשרת קשירה ישירה של השליחים לחלבון המטרה בעל ביטוי יתר בליזט התא – תוך עקיפת הצורך בטיהור חלבונים.

פעולה נימית רדיאלית דיפרנציאלית של בדיקת ליגנד: טכניקה בעלת תפוקה גבוהה לזיהוי נוקלאוטיד חיידקי חלבונים תוך-תאיים קושרי שליח שני

סרטון זה מדגים בדיקת in vivo בחיידקים כדי לחקור את האינטראקציה של חלבונים קושרי RNA (RBPs) עם RNA. תאי החיידק מותמרים באמצעות שני מבני פלסמיד – פלסמיד באתר קשירה המקודד mRNA המכיל גן כתב פלואורסצנטי במורד הזרם של אתר קשירת RBP – בעוד פלסמיד RBP מבטא את חלבוני RBP תחת שליטתו של משרה. עם עלייה בתיווך המושרה בייצור RBP, ה-RBPs נקשרים ל-mRNA, וכתוצאה מכך דיכוי תרגומי של הכתב באמצעות עיכוב של קשירת ריבוזום.

כתב בדיקת דיכוי גנים לחקר רגולציה תרגומית של גן מטרה

סרטון זה מדגים בדיקת RNA במבחנה נפתחת לזיהוי חלבונים קושרי RNA (RBPs), אשר מקיימים אינטראקציה עם רצפי היסוד העשיר באדנילט-אורידילאט (ARE) ב-mRNA. RBPs המטרה מליזט התא מעורבבים עם בדיקת RNA כדי ליצור קומפלקסים של RNA-חלבון. הקומפלקסים מבודדים באמצעות טיהור זיקה תוך ניצול הזיקה של תווית הדסתיוביוטין של גשושית הרנ"א לחרוז מגנטי המסומן בסטרפטווידין.

RNA-Protein Pull-Down Assay לבידוד חלבונים קושרי RNA באמצעות מיצוי זיקה

בסרטון זה, אנו מתארים את האבולוציה השיטתית של ליגנדות בשיטת העשרה מעריכית (SELEX) כדי לזהות רצפים ספציפיים קושרי RNA עבור חלבון מטרה מעניין. החלבון מודגר עם מאגר גדול של רצפי RNA אקראיים, ורצפי הרנ"א קושרי החלבון מבודדים, מוגברים ב-PCR ומרוצפים כדי לזהות את אתרי קשירת החלבונים שלהם.

בדיקת קשירת מבחנה מבוססת SELEX לזיהוי אינטראקציות RNA-חלבון

חבילה של מבחני colorimetric מתוארת לחלבון במהירות הבחנה, רנ"א, דנ"א, וסוכרים מחדש ducing בדגימות biomolecular פוטנציאלי הטרוגניות.

מבחני colorimetric מהירים לאופן איכותי להבחין RNA ו-DNA בדגימות biomolecular

פיתחנו assay כמותיים-DNA מחייבת, המבוסס על ELISA למדוד אינטראקציות עם גורם שעתוק ה-DNA. סגוליות גבוהה לחלבון Runx2 הושג עם oligonucleotide DNA לזיהוי קונסנסוס ונוגדנים חד שבטיים ספציפיים. איתור Colorimetric עם תגובת מצע נוגדנים בשילוב אנזים היה פיקוח בזמן אמת.

כמותי Assay לחקר חלבון: אינטראקציות-DNA, רגולטורים גלו תעתיק של ביטוי גנים, ולזהות חומרים אנטי סרטניים רומן

כאן, אנו מציגים פרוטוקולים לסינון ואפיון מהיר של אנזימים לפעילות אנטי-מיקרוביאלית. בדיקת דיפוזיה של מיקרו-שקופיות ובדיקת שחרור הצבע משתמשות במצעי חיידקי מטרה להערכת פעילות אנזימטית איכותית וכמותית.

מבחנים איכותיים וכמוני עבור זיהוי ואפיון של antimicrobials החלבון

חלבונים שקושרים רצפי RNA ספציפיים ממלאים תפקידים חיוניים בביטוי הגנים. אפיון מפורט של אתרים אלה מחייב חיוני להבנת הכונה. . הנה, מתואר בגישה צעד אחר צעד עבור מוטגנזה מכוונת רוויה מהאתרים מחייב חלבון ב RNA. גישה זו היא רלוונטית עבור כל האתרים מחייב חלבון ה-RNA.

בגישה מוטגנזה מכוונת רוויה הרומן: אפיון צעד בודד של חלבון תקינה מחייב אתרים ב- RNA באמצעות Phosphorothioates

הפעולה הרדיאלית הרדיאלית של Ligand Assay (DRaCALA) יכולה לשמש לזיהוי חלבונים קטנים מחייבים ליגנד של אורגניזם באמצעות ספריית ORFeome.

זיהוי החלבונים המחייבים של ליגנדים קטנים עם הפעולה הרדיאלית הרדיאלית הדיפרנציאלית של ליגנד אסאי (DRaCALA)

כאן, אנו מתארים שיטה לביטוי משותף חיידקי של חלבונים מתויגים באופן דיפרנציאלי באמצעות קבוצה של וקטורים תואמים, ואחריה טכניקות משיכה קונבנציונליות לחקר קומפלקסים חלבוניים שאינם יכולים להרכיב במבחנה.

בדיקת משיכה בשילוב עם ביטוי משותף בתאי חיידקים ככלי חסכוני בזמן לבדיקת אינטראקציות חלבון-חלבון מאתגרות

כאן, אנו מציגים שיטה מותאמת במבחנה לחשיפה, כימות ואימות של אינטראקטורים חלבוניים של רצפי RNA ספציפיים, תוך שימוש בתמצית חלבון כוללת מתאים אנושיים, חרוזי סטרפטווידין המצופים ב-RNA ביוטינילציה וניתוח ספקטרומטריית מסות.

ניתוח כמותי אופטימלי של חלבונים קושרי RNA באמצעות RNA קצר ביוטינילציה

למדו שיטה לכימות אפיניות קישור חלבוני RNA בתאי חיידקים חיים באמצעות מבחן דיווח גנטי. השיטה מספקת תובנות קריטיות לגבי אינטראקציות חלבון-RNA בתנאי סביבה תאית טבעיים.

שיטת בדיקת מעטפת חלבון-RNA כריכת חיידקים

גלה סרטונים נוספים