Name: הכנת מח עצם שלם לניתוח המוני Cy, לטיפול בניופיל-תאי השושלת (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-19T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: למדו פרוטוקול לבידוד מח עצם שלם לניתוח ציטומטרי המוני של תאי נויטרופיל קצרי חיים. שיטה זו מאפשרת זיהוי אוכלוסיות נדירות ושימור שלמות התאים לחקר מערכת החיסון.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

היינו רוצים להודות לזרימת LJI הליבה Cy, לקבלת סיוע עם הליך המוני cy, try. עבודה זו נתמכה על ידי NIH מענקים R01HL134236, P01HL136275, ו R01CA202987 (כולם C. C. H) ו ADA7-12-MN-31 (04) (כדי C.C.H. ו-Y. P. Z).

כל הניסויים עקבו אחר ההנחיות המאושרות של מכון לה הויה לטיפול בבעלי חיים ולבריאות ולשימוש בחיות מכרסמים, ואישור לשימוש במכרסמים התקבל ממכון לה הויה לאלרגיה ואימונולוגיה לפי קריטריונים המתוארים ב המדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה ממוסדות הבריאות הלאומיים.
1. בציר עצם העכבר מח (BM)
<ol><li>רכוש עכברים C57BL/6J מספק מסחרי. להאכיל את הדיאטה הרגילה צ'או מכרסם ובית בכלובים מיקרובודדים במתקן ללא פתוגן.</li>
	<li>השימוש עכברים זכר, 6-10 שבועות של גיל, לצורך ניסיוני. המתת חסד על ידי CO2 אינהלציה ואחריו פריקה צוואר הרחם.</li>
	<li>מניחים את העכבר על משטח כירורגי סטרילי עם צד הבטן למעלה. לחטא את העור של הבטן ואזור הגפיים על ידי ריסוס 70% אתנול. . כדי לחתוך את חלל הבטן פתוח</li>
	<li>להסיר את העור כדי לחשוף את הגפיים. השתמש זוג מלקחיים ההלבשה בוטה-עצה כדי להחזיק את השוקה העכבר ממש מתחת לקרסול. השתמש זוג אחר של מלקחיים ההלבשה מעוקל לייצב את השוקה מתחת מלקחיים ההלבשה בוטה-עצה. לשבור את השוקה ולחשוף את העצם על ידי לקרוע את השריר עם מלקחיים ההלבשה בוטה-עצה. הערה: השוקה מחובר באופן רופף למפרק הברך, ניתן לבחור בקלות באמצעות מלקחיים ההלבשה בוטה-עצה.</li>
	<li>. הניחו את השוקה בתא הקירור בערוץ 1</li>
	<li>הבא, להזיז את מלקחיים מעוקל ייצוב כלפי מטה לעצם הירך. החלק את מלקחיים ההלבשה הקהה מתחת למפרק הברך והחזק את פיקת הברך. . על ידי משיכת הברך בעדינות לחשוף את עצם הירך באמצעות העתקה. של השריר המחובר לפיקת הברך להחזיק את עצם הירך החשופה על ידי מלקחיים ההלבשה מעוקל לחתוך את עצם הירך מהחלק התחתון של העצם באמצעות ניתוח מספריים כירורגי.</li>
	<li>. הניחו את עצם הירך בקור 1 x</li>
	<li>פונץ ' חור בצינור 0.5 מ"ל מיקרוצנטריפוגה עם 18 גרם מחט.</li>
	<li>מניחים הן השוקה ואת עצם הירך לתוך אותו שפופרת מיקרוצנטריפוגה 0.5 mL עם הקצה הפתוח של העצמות פונה כלפי מטה אל החור.</li>
	<li>מניחים את צינור 0.5 mL המכיל הן שוקה ועצם הירך לתוך שפופרת מיקרוצנטריפוגה 1.7 mL.</li>
	<li>ספין הצינורות כפול שכבתית המכיל הן שוקה ועצם הירך ב 5,510 x g עבור 30 s ב מיקרו צנטריפוגה.</li>
	<li>ודא כי ה-BM מופק מהעצמות ומצנמת בתחתית הצינור. לזרוק את הצינור 0.5 mL המכיל את העצמות מקודש. מוניטור העכבר מוכן לשלבים הבאים. הערה: מוניטור האדם נקצרו במשאבים קליניים כמתואר בעבר11.</li>
</ol>2. כתמי תאים BM עבור CyTOF
<ol><li>השהה מחדש את ה-BM ב-1 mL במאגר הליזה של תא דם אדום (RBC). עבור מוניטור האדם, השהה מחדש את כל ה-BM בנפח 10x של מאגר הליזה 1 x של תא דם אדום (RBC). מודטה למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר (RT).</li>
	<li>סובב את השפופרת ב 350 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c. עבור מוניטור האדם, חזור על שלב 2.1 ו 2.2 לפני שתמשיך שלב 2.3.</li>
	<li>. ומשאירים את הגלולה ללא שובלת השהה מחדש את הגלולה עם 1 מ ל של הערוץ הקר 1x. לסנן את הגלולה לתוך 15 מ ל שפופרת חרוטי דרך מסננת תא 70 יקרומטר. התאים BM כעת מבודדים לחלוטין לתוך הצינור מן השריר ופסולת העצם. שטוף את התאים על-ידי הוספת 9 מ ל של ה-PBS הקרה 1x לתוך השפופרת.</li>
	<li>סובב את שפופרת 15 mL ב 350 x g עבור 5min ב 4 ° c.</li>
	<li>ומשהה מחדש את תאי ה-BM עם 10 mL קר PBS. . קח הרבה תאים לספירה ספירת תאים באמצעות הומוציטומטר.</li>
	<li>מחבר 5 x 106 תאים BM לתוך צינור חדש 15 מ"ל עבור cytof כתמים.</li>
	<li>סובב את 15 מעלות הצינור mL ב 350 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c.</li>
	<li>בזהירות מכתים את supernatant ולהשעות מחדש את התאים BM עם 125 ננומטר Cisplatin טינית 1 מ ל של CyTOF כתמים מאגר כמדד כדאיות עבור המדגם. דגירה עבור 5 דקות ב RT.</li>
	<li>לאחר הדגירה, להוסיף 4 מ ל של CyTOF מכתים מאגר לצינור. סובב את השפופרת ב 350 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c. עבור מוניטור האדם, להוסיף 10% סרום AB האנושי לתוך מאגר הצביעת CyTOF.</li>
	<li>בזהירות להפיח את supernatant ולהשעות מחדש את התאים BM עם 50 μL של פתרון חסימת הקולטן Fc. המשך 10 דקות ב -4 ° c. דלג על שלב זה עבור מוניטור האדם.</li>
	<li>הוסף 50 μL של קוקטייל ביתי CyTOF הנוגדן5 למדגם כך נפח כתמים הכולל הוא 100 μl. . פיפטה עדינה לערבב המשך 30 דקות ב-4 ° c. הנפח הסופי של קוקטייל הנוגדן הוא 100 μL עבור שני העכבר BM ו-BM האדם דגימות.</li>
	<li>הוסף 2 מ ל של CyTOF צביעת מאגר לכל צינור אחרי הדגירה כדי לשטוף את התאים, לסובב את הצינור ב 350 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c.</li>
	<li>חזור על שלב 2.12 עבור מספר כולל של שתי שטיפות.</li>
	<li>להכין פתרון חדש 1.6% פורמלדהיד מ 16% מניות. לדלל חלק 1 של פורמלדהיד מניות עם 9 חלקים של 1x PBS.</li>
	<li>הדבק בזהירות את הסופרנטאנט והשהה מחדש את הגלולה עם 1 mL טריים 1.6% הפתרון הפא. דגירה עבור 15 דקות ב RT.</li>
	<li>סובב את השפופרת ב 800 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c.</li>
	<li>הדבק בזהירות את supernatant ולהשעות מחדש את הגלולה תא עם 125 ננומטר הפתרון האינטרקלציה 1 mL לתקן/מאגר פרם.</li>
	<li>מודאת המדגם בתמיסה הבין לילה ב -4 ° c.</li>
</ol>3. הכן תאים עבור CyTOF רכישה
<ol><li>בעדינות מערבולת ובתאי ספין ב 800 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c.</li>
	<li>לשטוף את התאים על ידי הוספת 2 מ ל של CyTOF כתמים מאגר, התאים ספין ב 800 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c ולהסיר את supernatant על ידי השאיפה.</li>
	<li>השהה תאים מחדש ב-1 מ ל של diH2O. שריין נפח קטן (כ 10 μl) מכל צינור כדי לספור תאים.</li>
	<li>לסובב את התאים ב 800 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c.</li>
	<li>חזור על שלב 3.3 ו-3.4.</li>
	<li>ולהשאיר את התאים. בתוך הגלולה תאי ה-BM מוכנים כעת לתלייה לריכוז של 1 x 106 תאים/mL עבור רכישת cytof.</li>
</ol>

<ol><li>Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clonogenic+common+myeloid+progenitor+that+gives+rise+to+all+myeloid+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages.</a> Nature. 404, 193-197 (2000).</li>
<li>Iwasaki, H., Akashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid+lineage+commitment+from+the+hematopoietic+stem+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Myeloid lineage commitment from the hematopoietic stem cell.</a> Immunity. 26, 726-740 (2007).</li>
<li>Manz, M. G., Miyamoto, T., Akashi, K., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+isolation+of+human+clonogenic+common+myeloid+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Prospective isolation of human clonogenic common myeloid progenitors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 99, 11872-11877 (2002).</li>
<li>Becher, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-dimensional+analysis+of+the+murine+myeloid+cell+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">High-dimensional analysis of the murine myeloid cell system.</a> Nature Immunology. 15, 1181-1189 (2014).</li>
<li>Bendall, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+mass+cytometry+of+differential+immune+and+drug+responses+across+a+human+hematopoietic+continuum%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Single-cell mass cytometry of differential immune and drug responses across a human hematopoietic continuum.</a> Science. 332, 687-696 (2011).</li>
<li>Samusik, N., Good, Z., Spitzer, M. H., Davis, K. L., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+mapping+of+phenotype+space+with+single-cell+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Automated mapping of phenotype space with single-cell data.</a> Nature Methods. 13, 493-496 (2016).</li>
<li>Zhu, Y. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+an+Early+Unipotent+Neutrophil+Progenitor+with+Pro-tumoral+Activity+in+Mouse+and+Human+Bone+Marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Identification of an Early Unipotent Neutrophil Progenitor with Pro-tumoral Activity in Mouse and Human Bone Marrow.</a> Cell Reports. 24, 2329-2341 (2018).</li>
<li>Van der Maaten, L. J. P., Hinton, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+High-Dimensional+Data+Using+t-SNE%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Machine+Learning+Research%22%5BJournal%5D)">Visualizing High-Dimensional Data Using t-SNE.</a> Journal of Machine Learning Research. 9, 2579-2605 (2008).</li>
<li>Amir, E. A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((viSNE+enables+visualization+of+high+dimensional+single-cell+data+and+reveals+phenotypic+heterogeneity+of+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">viSNE enables visualization of high dimensional single-cell data and reveals phenotypic heterogeneity of leukemia.</a> Nature Biotechnology. 31, 545-552 (2013).</li>
<li>van der Maaten, L., Hinton, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+data+using+t-SNE%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Machine+Learning+Research%22%5BJournal%5D)">Visualizing data using t-SNE.</a> Journal of Machine Learning Research. 9 (85), 2579-2065 (2008).</li>
<li>Cloos, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+Protocol+to+Sample+and+Process+Bone+Marrow+for+Measuring+Measurable+Residual+Disease+and+Leukemic+Stem+Cells+in+Acute+Myeloid+Leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiment%22%5BJournal%5D)">Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia.</a> Journal of Visualized Experiment. 133, 56386(2018).</li>
<li>Bendall, S. C., Nolan, G. P., Roederer, M., Chattopadhyay, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+deep+profiler%E2%80%99s+guide+to+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">A deep profiler’s guide to cytometry.</a> Trends in Immunology. 33, 323-332 (2012).</li>
<li>Ley, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils%3A+New+insights+and+open+questions%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Immunology%22%5BJournal%5D)">Neutrophils: New insights and open questions.</a> Science Immunology. 3 (30), 4579(2018).</li>
<li>Ng, L. G., Ostuni, R., Hidalgo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of neutrophils.</a> Nature Reviews in Immunology. , (2019).</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

בעשורים האחרונים, זרימה המבוססת על קרינה פלואורסצנטנסה שימש כשיטה העיקרית ללמוד ליננים הסלולר ו טרוגניות1,2,3. למרות הזרימה cy, try סיפק נתונים רב מימדי, שיטה זו מוגבלת על ידי בחירות של פרמטרים חפיפה ספקטרלית. כדי להתגבר על החולשות של הזרימה cy, לנצל את היתרונות של Cyתוף, אשר משתמשת באיזוטופים מתכת כבדים במקום fluorophores כדי לתייג נוגדנים המבטלת את הוצלב בין ערוצי גלאי או פלואורסצנטית אוטומטי של התאים, ולכן, יכול למדוד רבים פר...

בעשורים האחרונים, שיטות cy, לנסות כבר כלי רב עוצמה כדי לחקור את המערכת המטטית ב BM. שיטות אלו כוללות שימוש בזרימה פלואורסצנטית המופעל באמצעות נוגדנים והשיטה החדשה של Cyתוף באמצעות מתכת כבדה בעלת תוויות. הם הובילו לתגליות של סוגי תאים רבים בדגימה ביולוגית הטרוגנית על-ידי זיהוי פרופילי הביטוי הייחודי שלהם משטח הסמן. הגבירו את הספקטרום חופפים זה משויך עם ערוצים יותר מוביל הנתונים הגבוהים יותר חוסר דיוק בזרם המופעל על ידי הקרינה ביישומים cy, לנסות. לכן, תאים לא רצויים מוסרים באופן שגרתי כדי להעשיר אוכלוסיות תאים של עניין של זרימה המופעל על ידי הזרם הפלואורסצנטית הפעלה cy, לנסות. לדוגמה, Ly6G (או Gr-1) ו-CD11b נחשבים לסמנים בוגרים של תאים מיאלואידים ו-Ly6G+ (או gr-1+) ו-CD11b+ תאים מוסרים באופן שגרתי מדגימות BM באמצעות ערכות העשרה מגנטיות לפני שהוא מנתח את הניתוח cytometry של גזע המטפאות ותאים מחולל שדות (hspcs) או על-ידי שילוב סמנים אלה בערוץ הקוקטייל אחד מזבלה1,2,3. דוגמה נוספת היא כי נויטרופילים הם הוסר באופן שגרתי מן הדגימה דם אנושי כדי להעשיר את הדם ההיקפית תאים מונפנקות (PBMC) למחקרים אימונולוגיים. מח עצם שלם מבודד מעכבר או בן אדם, עם זאת, הוא נחקר לעתים נדירות ללא פגע לניתוח cy, try.
לאחרונה, cytof הפך לכלי מהפכני לחקור את מערכת המטפאות4,5,6. עם CyTOF, הנוגדנים המתויגים בתווית מוחלפים בנוגדנים כבדים המסומנים בכתב. שיטה זו מאפשרת את המדידה של מעל 40 סמנים בו ללא החשש של חפיפת ספקטרום. הוא איפשר ניתוח של דגימה ביולוגית שלמה ללא שלבי המחסור מחסור או ערוץ dump. לכן, אנו יכולים להציג את המערכת המטטית באופן מקיף עם מימדי התוכן הגבוה מתוך מגרשים קונבנציונליים דו-מימדית של הזרימה. אוכלוסיות תאים שהושמטו בעבר במהלך תהליך של דלדול או מחסור יכול כעת להיות מובא לאור עם נתונים מימדים גבוהים שנוצרו על ידי cytof4,5. עיצבנו פאנל נוגדן המודד בו 39 פרמטרים במערכת המטפאות עם דגש על מיניאיד מיאלואידית7. לעומת הזרימה המקובלת cy, לנסות נתונים, פרשנות והדמיה של הנתונים חסר תקדים של תא יחיד מימדי שנוצר על ידי Cyתוף הוא מאתגר. מדענים חישוביים פיתחו טכניקות הפחתה ממדיות להדמיה של ערכות נתונים ממדיות גבוהות. במאמר זה, השתמשנו באלגוריתם, ויסבנה, שעושה שימוש בטכניקת הטבעה מבוזרת של סטוכסטי שכנים (t-SNE) כדי לנתח את הנתונים של CyTOF ולהציג את התוצאה הגבוהה ביותר במפה דו-ממדית תוך שימור המבנה הגבוה . הנתונים8,9,10 בחלקה tSNE, תאים דומים מקובצים לקבוצות ממשנה והצבע משמש להדגשת התכונה של התאים. לדוגמה, באיור 1 התאים המייאלואידים מופצים לקבוצות משנה של תאים בהתבסס על קווי הדמיון של דפוסי הביטוי שלהם של 33 פני השטח הנובעות מציתוף (איור 1)4. כאן חקרנו מח עצם העכבר עם שלנו דיווחו בעבר 39-סמן CyTOF הפאנל על ידי ניתוח ויסבנה7. בדיקת ובדיקה של הנתונים שלנו CyTOF חשף אוכלוסיית תאים בלתי מזוהה שהראה הן HSPC (CD117+) ו נויטרופילים (Ly6G+) מאפיינים (איור 2)7.
לסיכום, אנו מציגים פרוטוקול לעיבוד מח עצם טרי שלם עבור ניתוח CyTOF. במאמר זה, השתמשנו מח עצם העכבר כדוגמה, בעוד פרוטוקול זה יכול לשמש גם כדי לעבד את דגימות מח העצם האנושית. הפרטים הספציפיים לדגימות מח העצם האנושי גם כן מפורטים בפרוטוקול. היתרון של פרוטוקול זה הוא שהוא מכיל פרטים כגון זמן דגירה הטמפרטורה שהיו ממוטבת לשמר את התאים נויטרופילים השושלת במוח העצם כדי לאפשר חקירה על מח עצם שלם שלם. פרוטוקול זה עשוי להיות גם שונה בקלות עבור הפעלת קרינה פלואורסצנטית יישומים המופעל.

<table><tbody><tr><td><נוגדנים חזקים>CyTOF (עכבר)</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>נגד עכבר CD45 (שיבוט 30-F11) -89Y</td><td>Fluidigm</td><td>Cat# 3089005B</td><td></td></tr><tr><td>אנטי-אנושי/עכבר CD45R/B220 (שיבוט RA36B2)-176Yb</td><td>Fluidigm</td><td>Cat# 3176002B</td><td></td></tr><tr><td>נגד עכבר CD105 (שיבוט MJ7/18)-מטוהר</td><td>Biolegend</td><td>Cat# 120402; RRID:AB_961070</td><td></td></tr><tr><td>נגד עכבר CD115 (CSF-1R) (שיבוט AFS98) - מטוהר</td><td>Biolegend</td><td>Cat# 135502; RRID:AB_1937293</td><td></td></tr><tr><td>נגד עכבר CD117/c-kit (שיבוט 2B8)-166Er</td><td>Fluidigm</td><td>Cat# 3166004B</td><td></td></tr><tr><td>נגד עכבר CD11a (שיבוט M17/4)-מטוהר</td><td>Biolegend</td><td>Cat# 101101; RRID:AB_312774</td><td></td></tr><tr><td>נגד עכבר CD11b (שיבוט M1/70)-148Nd</td><td>Fluidigm</td><td>Cat# 3148003B</td><td></td></tr><tr><td>נגד עכבר CD11c (שיבוט N418)-142Nd</td><td>Fluidigm</td><td>Cat# 3142003B</td><td></td></tr><tr><td>נגד עכבר CD127 (IL-7R&alpha;) (שיבוט A7R34)-MaxPar Ready</td><td>Biolegend</td><td>Cat# 133919; RRID:AB_2565433</td><td></td></tr><tr><td>נגד עכבר CD150 (שיבוט TC1512F12.2)-167Er</td><td>Fluidigm</td><td>Cat# 3167004B</td><td></td></tr><tr><td>נגד עכבר CD16.2 (Fc&gamma; RIV) (שיבוט 9E9) - מטוהר</td><td>Biolegend</td><td>Cat# 149502; RRID:AB_2565302</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD162 (Clone 4RA10 (RUO))-מטוהר</td><td>BD Biosciences</td><td>Cat# 557787; RRID:AB_647340</td><td></td></tr><tr><td>נגד עכבר CD169 (Siglec-1) (שיבוט 3D6.112) - מטוהר</td><td>Biolegend</td><td>Cat# 142402; RRID:AB_10916523</td><td></td></tr><tr><td>נגד עכבר CD182 (CXCR2) (שיבוט SA044G4)-מטוהר</td><td>Biolegend</td><td>Cat# 149302; RRID:AB_2565277</td><td></td></tr><tr><td>נגד עכבר CD183 (שיבוט CXCR3-173)-מטוהר</td><td>Biolegend</td><td>Cat# 126502; RRID:AB_1027635</td><td></td></tr><tr><td>נגד עכבר CD335 (NKp46) (שיבוט 29A1.4)-MaxPar Ready</td><td>Biolegend</td><td>Cat# 137625; RRID:AB_2563744</td><td></td></tr><tr><td>נגד עכבר CD34 (Clone MEC14.7) - מטוהר</td><td>Biolegend</td><td>Cat# 119302; RRID:AB_345280</td><td></td></tr><tr><td>נגד עכבר CD41 (Clone MWReg30)-MaxPar Ready</td><td>Biolegend</td><td>Cat# 133919; RRID:AB_2565433</td><td></td></tr><tr><td>נגד עכבר CD43 (שיבוט S11)-146Nd</td><td>Fluidigm</td><td>Cat# 3146009B</td><td></td></tr><tr><td>נגד עכבר CD48 (שיבוט HM48.1)-156Gd</td><td>Fluidigm</td><td>Cat# 3156012B</td><td></td></tr><tr><td>נגד עכבר CD62L (שיבוט MEL-14)-MaxPar</td><td>Ready ThermoFisher</td><td>Cat# 14-1351-82; RRID:AB_467481</td><td></td></tr><tr><td>נגד עכבר CD71 (Clone RI7217)-מטוהר</td><td>Biolegend</td><td>Cat# 113802; RRID:AB_313563</td><td></td></tr><tr><td>נגד עכבר CD90 (Clone G7) - מטוהר</td><td>Biolegend</td><td>Cat# 105202; RRID:AB_313169</td><td></td></tr><tr><td>נגד עכבר F4/80 (שיבוט BM8)-159Tb</td><td>Fluidigm</td><td>Cat# 3159009B</td><td></td></tr><tr><td>נגד עכבר Fc&epsilon; RI&alpha; (שיבוט MAR-1)-MaxPar Ready</td><td>Biolegend</td><td>Cat# 134321; RRID:AB_2563768</td><td></td></tr><tr><td>נגד עכברים GM-CSF (MP1-22E9 (RUO))-מטוהר</td><td>BD Biosciences</td><td>Cat# 554404; RRID:AB_395370</td><td></td></tr><tr><td>נגד עכבר I-A/I-E (שיבוט M5/114.15.2)-174Yb</td><td>Fluidigm</td><td>Cat# 3174003B</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse Ki67 (Clone B56 (RUO))-מטוהר</td><td>BD Biosciences</td><td>Cat# 556003; RRID:AB_396287</td><td></td></tr><tr><td>נגד עכבר Ly-6A/E (Sca-1) (שיבוט D7)-169Tm</td><td>Fluidigm</td><td>Cat# 3169015B</td><td></td></tr><tr><td>נגד עכבר Ly6B (שיבוט 7/4)-</td><td>חתול</td> מטוהר <td>חתול# ab53457; RRID:AB_881409</td><td></td></tr><tr><td>נגד עכבר Ly-6G (שיבוט 1A8)-MaxPar Ready</td><td>Biolegend</td><td>Cat# 127637; RRID:AB_2563784</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse NK1.1 (Clone PK136)-165Ho</td><td>Fluidigm</td><td>Cat# 3165018B</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse Siglec-F (Clone E50-2440 (RUO))-Purified</td><td>BD Biosciences</td><td>Cat# 552125; RRID:AB_394340</td><td></td></tr><tr><td>נגד עכבר TCR&beta; (שיבוט H57-597)-143Nd</td><td>Fluidigm</td> <td>(Clone H57-597)-143Nd</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse TER-119/Erythroid Cells (Clone TER-119)-MaxPar Ready</td><td>Biolegend</td><td>Cat# 116241; RRID:AB_2563789</td><td></td></tr><tr><td><חזקים>כימיקלים, פפטידים וחלבונים רקומביננטיים </חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מייצב נוגדנים</td><td>CANDOR Bioscience</td><td>Cat# 130050</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר אלבומין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>Cat# A4503</td><td></td></tr><tr><td>Cisplatin-194Pt</td><td>Fluidigm</td><td>Cat# 201194</td><td></td></tr><tr><td>eBioscience 1x RBC Lysis Buffer</td><td>ThermoFisher</td><td>Cat# 00-4333-57</td><td></td></tr><tr><td>eBioscience Foxp3 / סט חיץ צביעת גורם שעתוק</td><td>ThermoFisher</td><td>Cat# 00-4333-57</td><td></td></tr><tr><td>EQ חרוזי כיול ארבעה אלמנטים</td><td>Fluidigm</td><td>Cat# 201078</td><td></td></tr><tr><td>חומצה אתילנדיאמינטטראצטית (EDTA)</td><td>ThermoFisher</td><td>Cat# AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>Omega Scientific</td><td>Cat# FB-02</td><td></td></tr><tr><td>HyClone Phosphate תמיסת מלח בופר</td><td>GE Lifesciences</td><td>Cat#SH30256.01</td><td></td></tr><tr><td>Intercalator-IR</td><td>Fluidigm</td><td>Cat# 201192B</td><td></td></tr><tr><td>ערכות תיוג נוגדנים MAXPAR</td><td>Fluidigm</td><td>http://www.dvssciences.com/product-catalog-maxpar.php</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# 158127</td><td></td></tr><tr><td>נתרן אזיד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>חתול# S2002</td><td></td></tr><tr><td>טריטון&nbsp; X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# X100</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin EDTA 1x</td><td>Corning</td><td>Cat# 25-053-Cl</td><td></td></tr><tr><td>מודל ניסיוני: אורגניזם/זנים</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>עכבר: C57BL/6J</td> מס' <td>מלאי מעבדת ג'קסון</td><td>: 000664</td><td></td></tr><tr><td>Software Alogrithm</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מנרמל מבוסס חרוזים</td><td>Finck et al., 2013</td><td>https://med.virginia.edu/flow-cytometry-facility/wp-content/uploads/sites/170/2015/10/3_Finck-Rachel_CUGM_May2013.pdf</td><td></td></tr><tr><td>Cytobank Cytobank</td><td></td><td>https://www.cytobank.org/</td><td></td></tr> <tr><td>Cytofkit v1.r.0</td><td>Chen et al., 2016</td><td>https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/cytofkit.html</td><td></td></tr><tr><td>t-SNE</td><td>van der Maaten ו הינטון, 2008</td><td>https://cran.r-project.org/web/packages/Rtsne/index.html</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

הכנת מח עצם שלם לניתוח המוני cy, לטיפול בניופיל-תאי השושלת

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

במאמר זה, אנו מציגים פרוטוקול כי הוא ממוטב כדי לשמר את התאים נויטרופילים השושלת בתוך מוניטור טרי עבור ניתוח של BM CyTOF שלם. אנו מנוצל מיאלואידית משוחדת 39-נוגדן הפאנל CyTOF להעריך את המערכת המטתית עם דגש על התאים נויטרופילים-השושלת באמצעות פרוטוקול זה. תוצאת הארגון נותחה באמצעות אלגוריתם להפחתת מימדים פתוח, והנתונים הוצגו כדי להדגים את התוצאה של פרוטוקול זה. גילינו אוכלוסיות חדשות של ניופיל-יוחסין. המבוססות על הפרוטוקול הזה פרוטוקול זה של הכנה מסוג חדש של מוניטור מלאה עשוי לשמש 1), ניתוח CyTOF לגלות אוכלוסיות תאים בלתי מזוהה מ-BM שלם, 2), חקירת פגמים מסוג BM עבור חולים עם הפרעות דם כגון לוקמיה, 3), סיוע אופטימיזציה של מופעל על ידי קרינה פלואורסצנטית זרימה cy, לנסות לנצל את מוניטור שלם טרי.

איור 1 מוצג כתוצאה דוגמה מניסויי cytof. בהתוויה זו מתווה את התאים באמצעות מספר ממחטות עכבר שעברו באשכולות לקבוצות ממשנה, בהתבסס על הדמיון של פרופילי הביטוי שלהם מסמן פני השטח, הנמדד על-ידי החלונית ה33 של CyTOF. תאים עם מאפיינים דומים יותר היו מקובצים באופן אוטומטי יחד כגון נויטרופילים, מקרופאגים, או DCs בהתבסס על הביטוי של 33 סמנים בכל תא.
איור 2 מוצג כתוצאה דוגמה עבור הניסוי העכבר BM cytof באמצעות הפרוטוקול המוצג במחקר זה. הפרוטוקול ...

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לעבד מח עצם טרי (BM) מבודד מעכבר או בן אדם עבור cy, מימדי המונית ההמוני (Cy, Try על ידי זמן הטיסה, Cy,) ניתוח של תאי השושלת של נויטרופילים.

הכנת מח עצם שלם לניתוח המוני Cy, לטיפול בניופיל-תאי השושלת

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...

פרוטוקול ציטומטריה המונית זה משמר את שלמות מח העצם כולו, ומאפשר להציל את המידע שאבד במהלך הכנת מדגם קונבנציונלי לניתוח של תאים שנחקרו. פרוטוקול בידוד מח עצם מהיר ובלתי מאמץ זה מאפשר רכישה של אוכלוסיות תאי מיאלואידים קצרי מועד, כגון תת-קבוצות נדירות של שושלת נויטרופילים. שימוש בציטומטריה המונית כדי לזהות בעבר תחת תאים חיסוניים מוערכים כגון תאים נויטרופילים-שושלת עשוי להיות השלכות רחבות על מגוון רחב של מחלות.פרוטוקול זה משמר את שלמות התאים המיאלואידיים קצרי החיים הקיימים במח העצם ונוזלים להיות מיושמים בקלות על סוגי רקמות אחרים כגון הגידול המוצק. פישטנו את הפרוטוקול כדי להפוך אותו ידידותי למשתמש ככל האפשר, אבל כמו בכל המחקרים הביולוגיים זה עשוי להזדקק לכמה ריצות תרגול כדי לנהל. כאשר אתה עושה את זה בפעם הראשונה, אתה יכול לקבל את כל reagents שלך מוכן הראשון ולאחר מכן בקפדנות בצע את הפרוטוקול.אם אתה נתקל בבעיות כלשהן, באפשרותך להתחבר ל- CyTOForum ולדבר עם משתמשי CyTOF אחרים שיכולים לסייע בפתרון בעיות. להכנת מדגם ביולוגי, טריקים פשוטים יכולים לעשות הבדל עצום עם התוצאה הסופית. הדגמה חזותית היא הרבה יותר קלה עבור משתמש חדש לתפוס את הפרוטוקול.אם אתה עושה את זה בפעם הראשונה, אתה יכול לקבל את reagents שלך מוכן הראשון ולאחר מכן בקפדנות בצע את הפרוטוקול. לקציר מח עצם, מניחים עכבר C57 שחור בן שישה עד עשרה שבועות בתמונת השופע על כרית כירורגית סטרילית ולהשתמש 70% אתנול כדי לעקר את הבטן ואת הגפיים האחוריות. השתמש בזוג מספריים כירורגיים לנתח כדי לפתוח את חלל הבטן ולהסיר את העור כדי לחשוף את הגפיים האחוריות.באמצעות זוג מעצורי ההלבשה קהה הטה, להחזיק את השוקה העכבר ממש מתחת לקרסול ולהשתמש זוג מעצורי ההלבשה מעוקל לייצב את השוקה מתחת מעצורי ההלבשה קהה הטה. השתמש מאלץ ההלבשה קהה הטה לשבור את השוקה ולהסיר את השריר כדי לחשוף את העצם. לפני הנחת השוקה ב- PBS קר, להזיז את מטלפסי ההלבשה המעוקלים המייצבים אל עצם הירך ולהחליק את מעצורי ההלבשה קהה קצה מתחת למפרק הברך להחזיק את פיקת הברך.בעדינות למשוך את כדי לסלק את פיקת הברך ולהסיר את השריר מן פיקת הברך כדי לחשוף את עצם הירך. החזק את עצם הירך החשופה על ידי מעצורי ההלבשה המעוקלים ולהשתמש במספריים כירורגיים כדי לחתוך את עצם הירך מתחתית העצם. ואז למקם את עצם הירך ב- PBS.לאחר מכן, השתמש במחט 18 מד כדי לנקר חור בצינור מיקרו צנטריפוגה 0.5 מיליליטר ולמקום את שתי העצמות בצינור עם הקצוות הפתוחים של העצמות פונה כלפי מטה לתוך החור. מניחים את הצינור 0.5 מיליליטר לתוך צינור מיקרו צנטריפוגה 1.7 מיליליטר ולסובב את הצינורות שכבתי כפול בצנטריפוגה מיקרו. בסוף הצנטריפוגה, לאשר כי מח העצם כבר מופק לתחתית הצינור.כדי להכתים את תאי מח העצם עבור ציטומטריה המונית, להשעות מחדש את מח העצם במיליליטר אחד של חיץ תריס תא דם אדום במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. בסוף הדגירה, לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה מחדש להשעות את גלולה במיליליטר אחד של PBS קר. לסנן את התאים דרך מסננת 70 מיקרומטר לתוך צינור חרוט 15 מיליליטר ולשטוף את התאים עם תשעה מיליליטר של PBS טרי, קר.להשעות מחדש את גלולת תא מח העצם ב 10 מיליליטר של PBS טרי, קר לספירה ולהעביר חמש פעמים 10 כדי aliquot התא השישי לתוך צינור חדש 15 מיליליטר. לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה מחדש להשעות את התאים במיליליטר אחד של חיץ הכתמת ציטומטריה המונית, בתוספת 125 ציספלטין ננומולרי. לאחר חמש דקות בטמפרטורת החדר, לשטוף את התאים בארבעה מיליליטר של חיץ ציטומטריה מסה טרי.להשעות מחדש את גלולה ב 50 microliters של פתרון חסימת קולטן FC. לאחר 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס, מוסיפים 50 מיקרוליטרים של קוקטייל הנוגדנים המעניין את התאים ומערבבים בעדינות. הטמפרטורה בשלבי דגירה שונים חשובה מאוד בשימור הכדאיות של תאי מח העצם.לאחר 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס, לשטוף את התאים פעמיים בשני מיליליטר של חיץ ציטומטריה מסה טרי לכל לשטוף לפני השעיית התאים במיליליטר אחד של פורמלדהיד מוכן טרי 1.6% במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. בסוף הדגירה, לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה מחדש להשעות את גלולה במיליליטר אחד של חיץ סלם קבוע בתוספת 125 פתרון אינטרקלציה ננומולרי עבור דגירה לילה בארבע מעלות צלזיוס. לפני ניתוח התאים על ידי ציטומטריה המונית, בעדינות מערבולת צנטריפוגה ההשעיה התא לפני שטיפת התאים בשני מיליליטר של חיץ כתמים ציטומטריה מסה טרי.לאחר מכן, לשטוף את התאים פעמיים במיליליטר אחד של מים מזוקקים לכל לשטוף, בזהירות שאף את supernatant לאחר לשטוף השני לפני השעיית התאים באחת פעמים 10 לתאים השישי למיליליטר של ריכוז חיץ ציטומטריה המונית לניתוח ציטומטריה המונית. בעלילה זו של הטבעה של שכן סטוכסטי מבוזר T, התאים על פני רקמות עכבר מרובות היו מקובצים בתת-קבוצות בהתבסס על הדמיון של פרופילי ביטוי סמן פני השטח שלהם כפי שנמדדו על-ידי לוח ציטומטריה של מסה של 33 פרמטרים. תאים בעלי מאפיינים דומים יותר קובצו יחד באופן אוטומטי בהתבסס על הביטוי של סמנים אלה בכל תא.בשיטה זו, שלמות מח העצם כולו נשמרה, מה שהוביל לגילוי אוכלוסיית תאים שלא הייתה ידועה קודם לכן, המבטאת בו זמנית נויטרופילים ותאי ההמוטופיטיים וסמני משטח חתימה של תאי ההמה. אוכלוסיית תאים זו, שהושמטה בעבר במחקרי אבי מיאלואידים, עקב דלדול תאים חיובי Ly6G, מציגה תבנית ברורה של ביטוי סמן פני השטח. חשוב מכך, נתונים אלה הובילו לגילוי תת-קבוצה קטנה של אשכול התאים החיובי Ly6G שאינו מבטא Ly6G, אך היה מקובץ בשיתוף פעולה הדוק לתאים החיוביים של CD117 Ly6G, מה שמרמז על הדמיון בין תאים אלה לשושלת הנויטרופילים בהתבסס על הביטוי של 33 סמני פני השטח המשמשים בניסוי ציטומיה המוני זה.לאחר מכן ניתן היה לבנות לוח מיון תאים המופעל על ידי 13 צבעים, המאפשר בידוד של הצייטומיטורים הנויטרופילים על ידי ציטומטריית זרימה לצורך בדיקות תפקודיות במורד הזרם. חשוב לבצע את הליך בידוד מח העצם מהר ככל האפשר ולשמור על התאים בארבע מעלות צלזיוס במהלך הליך הכתם.

preparation-whole-bone-marrow-for-mass-cytometry-analysis-neutrophil

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

סרטון זה מתאר פרוטוקול מפורט לבידוד מח עצם שלם טרי מגפיו האחוריות של העכבר כדי לחקור פגמים שלמים ב- BM עבור חולים עם הפרעות דם כגון לוקמיה.

קציר מח עצם מגפה אחורית של עכבר

אנו מתארים פרוטוקול לבידוד וטיהור של נויטרופילים ממח עצם בעכבר על ידי צנטריפוגה שיפוע הצפיפות ותיוג באמצעות צבעי CellTracker נויטרופילים. זה מייצג שיטה פשוטה, מהירה, לשחזור וחסכוני להשגת מספר גדול של נויטרופילים למחקרים תפקודיים במורד הזרם או ניסויי העברה ומעקב מאמצים.

בידוד, טיהור וסימון של נויטרופילים מח עצם עכבר ללימודים פונקציונליים וניסויי העברת מאמצת

אנו מדווחים פרוטוקול באמצעות תא קרינת מיון מופעל לבודד תאי דנדריטים plasmacytoid (PDC) עם טוהר גבוה ממח העצם של עכברי זאבת נוטה ללימודי תפקודיים של PDC.

מיון תא מופעל קרינה עבור טיהור של תאי דנדריטים Plasmacytoid ממח עצם העכבר

כאן אנו מספקים שיטה לזיהוי ובידוד מספר גדול של GM-CSF מונע התאים מיאלואידית באמצעות מיון תא במהירות גבוהה. ניתן לזהות חמש אוכלוסיות נפרדות (אבות מיאלואידית נפוצות גרנולוציט/מקרופאג אבות, ומונוציטים, נגזר מונוציט מקרופאגים, נגזר מונוציט DCs) מבוסס על הביטוי Ly6C ו- CD115.

דור מספר גדול של תאים מיאלואידים אבות ו מבשרי תא דנדריטי ממח העצם מאתר באמצעות תא הרומן מיון אסטרטגיה

האבחנה MDS קשה בהיעדר קריטריון מורפולוגי או ציטוגנטיקה אינפורמטיבי. MFC יכול לעזור לעדן את תהליך האבחון של MDS. כדי להיות שימושי עבור הקלינית, הניתוח MFC חייבת להתבסס על פרמטרים מספיקה ירידה לפרטים ורגישות, נתונים צריכים להיות לשחזור בין המפעילים השונים.

Cytometry זרימה מונחה מסד הנתונים להערכה של התבגרות התא מיאלואידית מח עצם

נדגים כיצד לזהות ולבודד 6 קבוצות משנה של אבות מיאלואידית ממח העצם מאתר באמצעות שילוב של מגנטי קרינה פלואורסצנטית מיון (מקינטוש ו- FACS). פרוטוקול זה יכול לשמש in vitro לקשרי תרבות מבחני (תרבויות methylcellulose או נוזל), ויוו המאמצת העברת הניסויים של RNA/חלבון ניתוחים.

זיהוי ובידוד של Oligopotent, ביצע לשושלת אבות מיאלואידית ממח העצם העכבר

כאן, אנו מתארים פרוטוקול פשוט לבידוד והכתמה של תאי מח עצם מורין לפנוטיפ תאי גזע המופויטיים ותאי אב יחד עם תאי גזע אנדותל ומזנכימליים תומכים. כמו כן נכללת שיטה להעשרת תאים הממוקמים באזורי אנדוסטל ומח עצם מרכזי.

ניתוח ציטומטריית זרימה של תאי גזע ותאי אב המטופויטיים של מח עצם מורין ותאי נישה סטרומליים

אנו מתארים פרוטוקולים הדרגתיים המודדים את הנשימה המיטוכונדריאלית של נויטרופילים עכבריים ואנושיים ותאי HL60 באמצעות מנתח שטף חוץ-תאי מטבולי.

מדידה בזמן אמת של הפרופיל הביו-אנרגטי המיטוכונדריאלי של נויטרופילים

ההצלחה של תעתיק חד-תאי/חד-גרעיני ומולטי-אומיקה תלויה במידה רבה באיכות התאים/גרעינים. לכן, בידוד תאים/גרעינים מרקמה וטיהורם חייבים להיות סטנדרטיים ביותר. פרוטוקול זה מתאר את הכנת הגרעינים מהמוח וממח העצם לבדיקת מולטיום-גרעינים חד-גרעיניים במורד הזרם.

הכנה איכותית של גרעיני מוח ומח עצם לבדיקות מולטיום של גרעינים בודדים

כאן מוצג פרוטוקול מפורט לבידוד ואפיון אוכלוסיות מיקרו-סביבתיות של מח עצם ממודלים של תסמונות מיאלודיספלסטיות ולוקמיה מיאלואידית חריפה. טכניקה זו מזהה שינויים בנישת מח העצם הלא המטופויטית, כולל תאי האנדותל והסטרומה המזנכימליים, עם התקדמות המחלה.

זיהוי אוכלוסיות מיקרו-סביבתיות של מח עצם בתסמונת מיאלודיספלסטית ובלוקמיה מיאלואידית חריפה

כתב יד זה מתאר פרוטוקול להכנת ספריית ATAC-seq של נויטרופילים ממח עצם עכבר, במטרה להבטיח כדאיות אופטימלית של נויטרופילים ואיכות ספרייה גבוהה. הוא מציע הוראות שלב אחר שלב על הכנת BMC, מיון אימונומגנטי ובניית ספרייה, ומשמש כמדריך רב ערך, במיוחד עבור מצטרפים חדשים לחקר נויטרופילים.

הכנת ספריית ATAC-Seq של נויטרופילים שמקורם במח עצם עכברים

למדו פרוטוקול לבידוד מח עצם שלם לניתוח ציטומטרי המוני של תאי נויטרופיל קצרי חיים. שיטה זו מאפשרת זיהוי אוכלוסיות נדירות ושימור שלמות התאים לחקר מערכת החיסון.

הכנת מח עצם שלם לניתוח המוני Cy, לטיפול בניופיל-תאי השושלת

גלה סרטונים נוספים