Name: תרגום הריבוכמה אהדה לטיהור (מלכודת) לבידוד רנ א מתאי האנדותל בvivo (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: למד שיטה לטיהור רנא מקושר לריבוזומים מתאי אנדותל בעכברים באמצעות תיוג EGFP גנטי. טכניקה זו מאפשרת ניתוח תעתיקי לחקר מנגנוני אנגיוגנזה וביולוגיה כלייתית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודתו של ד ר רן נתמכת על ידי איגוד הלב האמריקני (13SDG14800019; BR), קרן התקווה של אן (FP00011709; BR), האגודה האמריקנית לסרטן (86-004-26; מרכז הסרטן MCW ל BR), ואת המכון הלאומי לבריאות (HL136423; BR); ירדן פאלמר נתמך על ידי 2018 MCW CTSI 500 תוכנית ההתמחות כוכבים; פ. מורן נתמך על ידי מענק להכשרת מחקר מוסדיים מ-NHLBI (5T35 HL072483-34).

עבור ניסויים בבעלי חיים, כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים והשימוש במכללה הרפואית של ויסקונסין.
1. הכן ריאגנטים
<ol><li>הכנת מאגר לפירוק לריכוזים של 10 מ"מ HEPES, pH 7.4, 150 mM KCl, 5 מ"מ MgCl2, 0.5 מ"מ dtt, 100 Mg/mL cycloheximide מעכבי פרוטאז, ו רקומביננטי RNase מעכבי לריכוזים כפי שמתואר להלן.<ol>
<li>הוסף ריאגנטים הבאים כדי 500 מ ל של RNase-חופשי מים מוכי: 1.19 g של HEPES, 5.59 g של KCl, 0.24 g של MgCl2, 35 MG של dtt, 0.5 mL של cycloheximide ו naoh לפי הצורך עד pH 7.4, edta-מעכבי פרוטאז חינם (מיני לוח אחד לכל 10 mL) ו-RNase מעכבי (1 0 μL/mL).</li>
		<li>חנות במקרר של 4 ° c עד חודש אחד.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להכין הרבה מלח גבוה polysome מאגר לשטוף לריכוזים של 10 מ"מ HEPES, pH 7.4, 350 mM KCl, 5 מ"מ MgCl2, 1% vol/vol CA-630, 0.5 MM dtt, ו 100 Mg/mL cycloheximide.<ol>
<li>הוסף ריאגנטים הבאים כדי 500 mL של RNase-חינם מים מאוהים: 1.19 g של HEPES, 13.05 g של KCl, 0.24 g של MgCl2, 5 מ ל של nonionic, ללא הסרת כביסה, 5 של 7.7 mg צינורות של dtt, ו 0.5 mL של cycloheximide ו naoh לפי הצורך עד pH 7.4</li>
		<li>חנות במקרר של 4 ° c עד חודש אחד.</li>
	</ol>
</li>
	<li>אגד נוגדן אנטי-GFP לחרוזים מגנטיים של חלבון G לפני תחילת הניסוי.<ol>
<li>הוסף 10 מ"ג של נוגדן anti-GFP מדולל ב 200 mL של PBS ל-G חרוזי חלבון.</li>
		<li>מודטה עם סיום הסיבוב בסוף 10 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>הניחו את החרוזים על מתלה מגנטי והסירו את הסופרנטאנט.</li>
		<li>השהה את החרוזים ב-200 mL של PBS ואחסן במקרר של 4 ° c עד שבוע אחד.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הכינו את הקרח קר PBS עם 100 mg/mL cycloheximide.<ol>
<li>להוסיף נפח 1 של פתרון cycloheximide (100 mg/mL) כדי 99 כרכים של קרח קר PBS.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. לבודד לlyse הרקמות הרצויות
<ol><li>המתת חסד על ידי הזרקת IP של קטמין (500 mg/ק"ג/משקל הגוף) ו xylazine (10 מ"ג/ק"ג/משקל הגוף) ולבודד את הרקמות הרצויות (כלומר, הלב, הריאות). המשך מיד לשלב הבא.</li>
	<li>מניחים את הרקמות הרצויות לתוך 500 mL של הקרח קר PBS עם 100 mg/mL לבין.</li>
	<li>האוהב רקמות לתוך הבולם הנייד עם מנוע מונחה מוטורי או הומוגניצר זכוכית בעלת סיווג קטן. אם באמצעות מנוע הומוגניצר ממונע, להגביל את המגון לפחות 1 דקה בתדר נמוך (< 15000 Hz) כדי למנוע את ה-RNA דנטורציה.</li>
	<li>להשעות את הגלולה תא ב 200 mL של מאגר לליזה ידי ליטוף ולצייר מחדש את המאגר מספר פעמים. עוד המגון להתאים הבולם התא עם 10 משיכות הומוגניצר זכוכית בעלת סיווג קטן או עבור 15 שניות בתדר נמוך (< 15000 Hz) ב הומוגניצר מנוע מונחה.</li>
	<li>צנטריפוגה הומוטים עבור 10 דקות ב 2,000 x g ב 4 ° c כדי גרעיני גלולה ופסולת תא גדול, ולשמור על supernatant.</li>
	<li>הוסף nonionic, ללא הדדקות ניקוי כדי 1% vol/vol ו DHPC ל 30 מ"מ כדי supernatant. מודקון על הקרח עבור 5 דקות.</li>
	<li>צנטריפוגה ליפוסט עבור 10 דקות ב 16,000 x g כדי החומר גלולה מסיסים. העבר ושמור 15% של ליפוסט ברור כקלט עבור שלבים עתידיים.</li>
</ol>3. בודד מכלולי ריבוחלק/mRNA
<ol><li>הוסף 50 mL של חרוזים מאוגד נוגדן לתא-ליפוסט supernatant ו-דגירה התערובת ב 4 ° צ' עם סיבוב מעבר לקצה עבור 30 דקות. זה המקום שבו נוגדנים anti-GFP יהיה לאגד את הריבוזומים GFP מתויג, המאפשר לנו לבודד את ה-RNA מן הריבוזומים אלה.</li>
	<li>לאסוף חרוזים על מתלה מגנטי ולשטוף 5 פעמים עם רב מלח polysome מאגר לשטוף.<ol>
<li>לצייר ולמחוק נוזל פעם חרוזים נאספו בצד של הצינור. ואז לנקות את הצנרת 200 מ ל של מאגר כביסה של המלח גבוהה מספר פעמים. חזור על שלב זה 5 פעמים והשמט את כל המאגר לאחר החזרה הסופית. המשך מיד לשלב הבא.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. לבודד את mRNA
<ol><li>מניחים חרוזים במאגר RLT. השלבים הבאים נלקחים ישירות מפרוטוקול מיני ערכת RNeasy ולא הורחב בכל דרך. התראה: RLT מאגר מכיל מלחי גואנידין; אין לערבב עם אקונומיקה.</li>
	<li>צנטריפוגה למטה עבור 3 דקות במהירות מלאה 13,000 rpm או 16,000 g ב 4 ° c. הסר בזהירות את סופרנטאנט של 350 mL על ידי ליטוף ולהעביר אותו צינור microfuge חדש. השתמש רק על הסופרנט (ליפוסט) בשלבים הבאים.</li>
	<li>הוסף נפח שווה של 70% אתנול לתוך צינור microfuge.</li>
	<li>העבר עד 700 mL של המדגם, כולל מזרז שעשוי להיווצר, לטור ספין הממוקם בצינור אוסף של 2 מ ל. סגור את המכסה בעדינות ואת צנטריפוגה עבור 15 s ב ≥ 8,000 x g כדי לשטוף את קרום טור ספין. התעלם מהזרימה.</li>
	<li>הוסף 350 mL של מאגר RW1 לעמודת הספין. סגור את המכסה בעדינות ואת צנטריפוגה עבור 15 s ב ≥ 8,000 x g כדי לשטוף את קרום טור ספין. השמט את הזרימה והשתמש שוב בשפופרת האוסף בשלב הבא. התראה: מאגר RW1 מכיל מלחי גואנידין; אין לערבב עם אקונומיקה.</li>
	<li>הוסף 350 mL של מאגר RW1 לעמודת הספין. סגור את המכסה בעדינות ואת צנטריפוגה עבור 15 s ב ≥ 8,000 x g. התעלם מהזרימה.</li>
	<li>הוסף 500 mL של מאגר RPE לעמודת הטווח. סגור את המכסה בעדינות ואת צנטריפוגה עבור 15 s ב ≥ 8,000 x g כדי לשטוף את קרום טור ספין. התעלם מהזרימה.</li>
	<li>הוסף 500 mL של מאגר RPE לעמודת הטווח. סגור את המכסה בעדינות ואת צנטריפוגה עבור 2 דקות ב ≥ 8,000 x g כדי לשטוף את קרום טור ספין. לאחר מכן הסר בזהירות את עמודת הספין מצינור האיסוף, וודא שהעמודה אינה מפנה לזרימה.</li>
	<li>מקם את עמודת הספין בצינור אוסף חדש של 2 מ ל והשמט את השפופרת הישנה עם הזרימה. סגור את המכסה בעדינות וצנטריפוגה במהירות מלאה עבור 1 דקות כדי להסיר מאגר שיורית.</li>
	<li>מקם את עמודת הספין בשפופרת אוסף חדשה של 1.5 mL. הוסף 30-50 מ ל של RNase-מים חינם ישירות קרום טור ספין. סגור את המכסה בעדינות ואת צנטריפוגה עבור 1 דקות ב ≥ 8,000 x g כדי ELUTE RNA.</li>
	<li>אם צפוי תשואה RNA הוא > 30 מ"ג, חזור על שלב 4.10 עם עוד 30-50 mL של מים חינם RNase, או באמצעות elute משלב 4.10 (אם הוא גבוה [RNA] נדרש). שימוש חוזר בצינור הגבייה משלב 4.10.</li>
	<li>השתמש ב-RNA מטוהרים עבור ניתוח במורד הזרם כולל RNA-רצפי או בזמן אמת כמותי PCR או לאחסן RNA מומס RNase-H ללא תשלום2O ב-80 ° c עבור עד 1 שנה.</li>
</ol>

<ol><li>Heiman, M., Kulicke, R., Fenster, R. J., Greengard, P., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type-specific+mRNA+purification+by+translating+ribosome+affinity+purification+%28TRAP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Cell type-specific mRNA purification by translating ribosome affinity purification (TRAP).</a> Nature Protocols. 9, 1282-1291 (2014).</li>
<li>Zhou, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interrogating+translational+efficiency+and+lineage-specific+transcriptomes+using+ribosome+affinity+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Interrogating translational efficiency and lineage-specific transcriptomes using ribosome affinity purification.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 15395-15400 (2013).</li>
<li>Best, B., Moran, P., Ren, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGF%2FPKD-1+signaling+mediates+arteriogenic+gene+expression+and+angiogenic+responses+in+reversible+human+microvascular+endothelial+cells+with+extended+lifespan%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">VEGF/PKD-1 signaling mediates arteriogenic gene expression and angiogenic responses in reversible human microvascular endothelial cells with extended lifespan.</a> Molecular and Cellular Biochemistry. 446, 199-207 (2018).</li>
<li>Ren, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LPA%2FPKD-1-FoxO1+Signaling+Axis+Mediates+Endothelial+Cell+CD36+Transcriptional+Repression+and+Proangiogenic+and+Proarteriogenic+Reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosclerosis+Thrombosis%2C+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">LPA/PKD-1-FoxO1 Signaling Axis Mediates Endothelial Cell CD36 Transcriptional Repression and Proangiogenic and Proarteriogenic Reprogramming.</a> Arteriosclerosclerosis Thrombosis, Vascular Biology. 36, 1197-1208 (2016).</li>
<li>Ren, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+Kinase+D1+Signaling+in+Angiogenic+Gene+Expression+and+VEGF-Mediated+Angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Protein Kinase D1 Signaling in Angiogenic Gene Expression and VEGF-Mediated Angiogenesis.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 37(2016).</li>
<li>Ren, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FoxO1+transcriptional+activities+in+VEGF+expression+and+beyond%3A+a+key+regulator+in+functional+angiogenesis%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">FoxO1 transcriptional activities in VEGF expression and beyond: a key regulator in functional angiogenesis?</a> Journal of Pathology. 245, 255-257 (2018).</li>
<li>Hupe, M., Li, M. X., Gertow Gillner, K., Adams, R. H., Stenman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+TRAP-sequencing+technology+with+a+versatile+conditional+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Evaluation of TRAP-sequencing technology with a versatile conditional mouse model.</a> Nucleic Acids Research. 42, e14(2014).</li>
<li>Dong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diet-induced+obesity+links+to+ER+positive+breast+cancer+progression+via+LPA%2FPKD-1-CD36+signaling-mediated+microvascular+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Diet-induced obesity links to ER positive breast cancer progression via LPA/PKD-1-CD36 signaling-mediated microvascular remodeling.</a> Oncotarget. 8, 22550-22562 (2017).</li>
<li>Ren, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ERK1%2F2-Akt1+crosstalk+regulates+arteriogenesis+in+mice+and+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">ERK1/2-Akt1 crosstalk regulates arteriogenesis in mice and zebrafish.</a> Journal of Clinical Investigation. 120, 1217-1228 (2010).</li>
<li>Skuli, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+HIF-2alpha+regulates+murine+pathological+angiogenesis+and+revascularization+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Endothelial HIF-2alpha regulates murine pathological angiogenesis and revascularization processes.</a> Journal of Clinical Investigation. 122, 1427-1443 (2012).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין להם ניגוד אינטרסים.

אנגיוגנזה הוא תהליך רב-שלבים מורכב, בו תמלול וביטוי של גנים בעלי מפרט EC-אנגיוגנטי ממלאים תפקיד חיוני ב-EC בידול ו-אנגיוגנטי מתכנות3,4. כדי להתגבר על המחסומים מן הגיוון הסלולר והמורכבות האדריכלית להבנת טוב יותר את התפקוד של מערכת כלי הדם של היונקים ברמה המולקולרית ב-vivo, יצרנו את העכברים הספציפיים ל-EC, המלווים בcd36-EC ספציפי , EC-ספציפי pkd-1 מחסור או הכללית cd36 מחסור באמצעות מודל רב תכליתי מלכודת העכבר או egfp-השמנה שנוצר במעבדה פ...

ברקמות מורכבות כגון מוח היונקים, הלב והריאות, הרמות הגבוהות של טרוגניות הסלולר מסבכים את הניתוח של נתוני ביטוי הגנים הנגזרים מדגימות שלמות של רקמות. כדי להתבונן בפרופילי גנים ביטוי סוג תא מסוים ב vivo, מתודולוגיה חדשה פותחה לאחרונה, אשר מאפשר את החקירה של משלים mRNA המתורגם כולו של כל סוג תא מוגדר גנטית. מתודולוגיה זו ידועה בתור הריבוקכמה הזיקה לטיהור (מלכודת) בטכניקה1,2. זהו כלי שימושי לחקור ביולוגיה של תא אנדותל ואנגיוגנזה כאשר משולבים עם גנטית מניפולציה של גנים אחרים הקשורים לאנגיוגנזה בבעלי חיים.
הצגנו את העובדה ש-אנגיוגנטי pkd-1 מאותת ותמלול הCD36 של גנים מבוססי-אנגיוגנטית הם קריטיים עבור תא אנדותל (EC) בידול ואנגיוגנזה פונקציונלי3,4,5,6. כדי לקבוע מנגנונים מולקולריים של אנגיוגנטי ו איתות מטבולית בתמלול הגנים ובידול EC, יצרנו מהונדסים גנטית עכברים מלכודת עם גנים שנמחקו במיוחד אנגיוגנטי על בסיס של טכניקה מלכודת1 , 2. יתר על כן, בחיות המלכודת שלנו, לא רק שיש להם pkd-1 או cd36 gene חוסר בכלי הדם אנדותאליה או מחיקה גלובלית של cd36 gene, אבל חלבון משופר ירוק פלואורסצנטית (egfp) הוא גם מתויג גנטית על . EC מתרגם ריבוזומים המלכודת מאפשרת טיהור של אהדה של הריבוכמה מאוגד-mRNA ישירות מתוך כלי הדם של רקמות ממוקדות, המאפשר ניתוח של ביטוי גנים זיהוי של הטרנססקריפט החדש הקשורים בידול EC ו אנגיוגנזה ישירות תחת התנאים vivo. בנינו בהצלחה RNA ריבוכמה מאוגד מתוך אנדותליה בבעלי חיים אלה מהונדסים גנטית. ה-RNA הטהור יכול לשמש לאפיון נוסף של גנים של אנגיוגנטי או הריוגניים בוויסות הבידול והפונקציות של EC. פרוטוקול זה מספק מדריך צעד אחר צעד כדי ליישם את גישת המלכודת לבידוד של mRNA ב-ECs ישירות ב-vivo.

<table><tbody><tr><td>2100 אלקטרופורזה ביואנלייזר עם ננו-שבבים ופיקו-צ'יפס</td><td>Agilent</td><td>G2939AA, 5067-1511 & 5067-1513</td><td></td></tr><tr><td>מגרדי תאים</td><td>Sarstedt</td><td>83.1832</td><td></td></tr><tr><td>הומוגנייזרים</td><td>מגנט K8855100020</td><td></td><td></td>מדעי פישר</tr><tr><td>(Dynamag-2)</td> <td>Invitrogen</td><td>123-21D</td><td>יהיה תלוי בסולם הטיהור; ניתן לרכז דגימות בצינורות של 1.5 מ"ל DynaMag-2</td></tr><tr><td>מיניצנטריפוגה</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>05-090-100</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000C ספקטרופוטומטר</td><td>תרמו סיינטיפיק&nbsp;</td>צנטריפוגה מקוררת <td>ND-2000C</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td>5430R</td><td>עם רוטור לצינורות מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל</td></tr> צינורות <tr><td>מיקרוצנטריפוגה ללא RNase 1.5 מ"ל</td><td>Applied Biosystems&nbsp;</td><td></td><td></td>AM12450</tr><tr><td>צינורות חרוטיים נטולי Rnase בנפח 50 מ"ל</td><td>Applied Biosystems&nbsp;</td><td></td><td></td>AM12501</tr><tr><td>1000-&mu ללא RNase; l טיפים מסננים</td><td>Rainin</td><td>RT-1000F</td><td></td></tr><tr><td>ללא RNase 200-&mu; l טיפים לסנן</td><td>Rainin&nbsp;</td><td>RT-200F</td><td></td></tr><tr><td>נטול RNase 20-&mu; l טיפים לסנן</td><td>Rainin&nbsp;</td>רוטור <td>RT-20F</td><td></td></tr><tr><td>להומוגניזטורים</td><td>Yamato&nbsp;</td><td>מסובב צינור LT-400D</td><td></td></tr><tr><td>, מותג Labquake</td><td>Thermo Fisher</td><td>13-687-12Q</td><td></td></tr></tbody></table>

תרגום הריבוכמה אהדה לטיהור (מלכודת) לבידוד רנ א מתאי האנדותל בvivo

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

מחקרים רבים הוגבלה להשתמש באספלי הסלולר מבחנה ורקמות שלמות או בידוד של סוגי תאים ספציפיים מבעלי חיים עבור ניתוח מבחנה של טרנס וביטוי גנטי על ידי qPCR ו-RNA רצפי. ביטוי מקיף לניתוח והבעה גנים של סוגי תאים ספציפיים ברקמות מורכבות ואיברים יהיה קריטי להבין מנגנונים סלולריים ומולקולריים שבהם גנים מוסדרים והקשר שלהם עם הומאוסטזיס רקמות ואיבר פונקציות. במאמר זה, אנו מדגימים את המתודולוגיה עבור בידוד של הריבוכמה-RNA מאוגד ישירות בvivo ב אנדותאליה כלי הדם של הריאות בעלי חיים כדוגמה. החומרים וההליכים הספציפיים לעיבוד רקמות ו-RNA טיהור יהיה מתואר, כולל הערכה של איכות RNA ותשואה כמו גם qPCR בזמן אמת עבור גן העורקים העורקי. גישה זו, המכונה תרגום ריבוכמה אהדה (מלכודת) הטכניקה, יכול להיות מנוצל לאפיון של ביטוי גנים וניתוח הטרנססקריפט של סוגי תאים מסוימים ישירות בvivo בכל סוג ספציפי ברקמות מורכבות.

המחקרים הקודמים שלנו4,7 מראים כי CD36 עשוי לתפקד כבורר עבור arteriolar הבדלה והעורקי נימי באמצעות lpa/pkd-1 מסלול איתות. כדי ללמוד אם הציר LPA/PKD-1-CD36 איתות חיוני עבור הריוגנזה ב vivo, הקמנו את הספר שורות המלכודת כי לא רק מחסור בCD36 הכללית או אנדותל ספציפי, CD36 או pkd-1-מחסור, אלא גם לאפשר בידוד סלקטיבי של רנ א מאוגד-RNA מן היצור-מסומן בתאי תאים באמצעות GFP, ושימושיים ככתבת פלורסנט מופעלת-יצורים2.
על-ידי בי...

אנו מציגים גישה כדי לטהר את הריבוכמה מאוגד-mRNA מתאי כלי הדם (ECs) ישירות במוח העכבר, הריאות ורקמות הלב באמצעות התגית הגנטית ספציפית EC של חלבון פלואורסצנטית ירוק משופר (EGFP) ב ריבוזומים בשילוב עם טיהור RNA .

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis ...

היי, אני בן רן, אני פרופסור חבר לכירורגיה והנדסה ביו-רפואית באוניברסיטת אלבמה, בית הספר לרפואה של ברמינגהאם. המעבדה שלנו מתעניינת בתפקוד ביולוגיה של תאי אנדותל אנגיוגנזה אקוגנזה בהקשר של מחלות לב וכלי דם נפוצות אלה וסרטן. אחד המחקרים שלנו מתמקד בוויסות אפיגנטי ותעתיק של טרנסדיפרנטיזציה של תאי אנדותל ואנגיוגנזה.כדי להבין את המנגנונים שעתוק של אנגיוגנזה, הקמנו קווי עכבר מהונדסים מהונדסים, שבו יש לנו לא רק נמחק גנים ספציפיים הקשורים אנגיוגנזה בתאי אנדותל, אבל בדיקה GFP משופרת יהיה מתויג גנטית על ריבוזום של תאים אנדותל ילידים. בדרך זו, אנו יכולים לבודד ולטהר לולאות של RNA שליח הקשורים מתאים אנדותל באברי רקמות שונים ישירות בבעלי חיים מהו מהודרים. לאחר מכן נוכל להשתמש ברנ"א השליח המטוהר לניתוח במורד הזרם של תעתיקים ותמלול.על ידי רצף RNA ו- PCR צונן בזמן אמת. בסרטון זה, התלמידים שלי פטריק מורן וג'ורדן פאלמר וטכנאי המחקר ניקולס ברנקוב ורונג יואן יראה לכם גישה של עכברים מהודקים ושוכם RNA שליח ישירות מן ההיתוך בבעלי החיים מהוססים. Genotyping הוא ראשוני חשוב בפרוטוקול זה כדי להבטיח כי הקרח יש את תג GFP על ריבוזום של תאים אנדותל.מאז כל צעדי בידוד RNAi במורד הזרם להסתמך על נוכחות של ריבוזום מתויג GFP, זה חיוני כדי לקבוע את הגנוטיפ לפני תחילת הניסוי. לפני תחילת בידוד ה-RNA, יש להשלים מספר צעדי הכנה. אלה כוללים הכנת חיץ וקשירת הנוגדן נגד GFP לחרוזי החלבון G dina.המאגרים יכולים להימשך עד חודש בארבע מעלות צלזיוס וחרוזי הנוגדן יכולים להימשך עד שבוע בארבע מעלות צלזיוס. אז קח את המגבלות האלה בחשבון בעת תכנון הניסוי שלך. באמצעות homogenizer מונחה תבונה היא דרך מצוינת להגדיל את תפוקת RNA.הקפד להשתמש בהגדרות ומשך תדר נמוכים יותר כדי להפחית את השפלת ה- RNA. כפי שהוזכר קודם לכן, genotyping הוא צעד ראשוני חשוב בפרוטוקול המשפט. הבטחת כי עכברים אשר RNA הוא להיות מבודד באמצעות טכניקת TRAP הם חיוביים עבור הגן TRAP, לפחות heterozygotes, אבל הומוזיגי באופן אידיאלי עבור הגן TRAP הוא צעד חשוב כי הבטחת תג GFP הוא על ריבוזום הוא חיוני על מנת למשוך למטה באמצעות תגובת נוגדן אנטיגן ואת חמוזי אנטי GFP תוכלו להכין לפני תחילת הניסוי.לבודד את הרקמות הרצויות מהעכבר ולמקם אותו מיד לתוך PBS קר כקרח עם 100 מיקרוגרם לכל פתרון cyclohexamide מיליליטר. זה מבטיח כי התרגום יופסק כי התמלול יהיה תיאור מדויק של העכבר לפני המתת חסד. השתמש homogenizer מונע מנוע כדי הומוגניזציה הרקמה לתוך השעיית תא.הגדרות תזמון ותדירות אידיאליות יצטרכו להיקבע על ידי המעבדה הבודדת בהתבסס על homogenizer מונחה מנוע מסוים אתה תהיה משתמש. שימוש בהגדרת תדירות גבוהה מדי עלול להוביל להשפלת RNA ולשבש את שאר הפרוטוקול. להשעות את גלולת התא בתוך מאגר תזה היית צריך להכין לפני תחילת הניסוי.הקפד הומוגניזציה תערובת זו עוד יותר על מנת להבטיח הומוגניזציה נאותה לפני שתמשיך עם שאר הפרוטוקול. צנטריפוגה הומוגנית במשך 10 דקות ב 2, 000 פעמים G בצנטריפוגה ארבע מעלות צלזיוס. זה יהיה גלולה הגרעינים ופסולת הסלולר גדול אשר עלול להפריע לתגובת immunoprecipitation במורד הזרם.הוסף שומנים DHPC ו CA-630 אל העל-טבעי מן הצעד הקודם צנטריפוגליזציה. שומנים אלה יסייעו להפריד את שלבי החלבון מהרכיבים תאיים האחרים. מניחים את ההשעיה על קרח במשך חמש דקות ומאפשרים לו לשבת.צנטריפוגה lysate במשך 10 דקות ב 13, 000 פעמים G כדי גלולה כל חומר מסיס. שמור 15% מהליסייט הברור עבור שלבים עתידיים. מוסיפים את חרוזי הנוגדן נגד GFP לתא lysate supernatant ו דגירה את התערובת בארבע מעלות צלזיוס עם סוף מעל סיבוב סוף במשך 30 דקות.כאן הנוגדנים נגד GFP יקשרו את הריבוזום המתויג של GFP, ויאפשרו לנו לבודד עוד יותר את ה-RNA מהריבוזום הזה. לאסוף את חרוזים על המדף המגנטי שלך לשטוף את חרוזים חמש פעמים באמצעות מאגר שטיפת פוליקום מלח גבוה שלך כי אתה מוכן לפני תחילת הבידוד. המשך מיד לשלב הבא שבו ת למקם את חרוזים במאגר RLT.צנטריפוגה lysate במשך שלוש דקות במלוא המהירות בזהירות להסיר את supernatant ולהעביר אותו צינור microfuge חדש. מוסיפים נפח אחד של 70%אתנול ללייט המטוהר ומערבבים מיד על ידי צינורות. המשך מיד לשלב הבא שבו תעביר עד 700 מיקרוליטרים של המדגם, כולל כל משקעים שאולי נוצרו, לעמודת ספין הממוקמת בצינור איסוף של שני מיליליטר.צנטריפוגה lysate במשך 15 שניות יותר מ 8, 000 פעמים G לשטוף את קרום עמוד ספין. בטל את הזרימה ולהמשיך לשלב הבא. הוסף 350 מיקרוליטרים של מאגר RW1 לעמודת הסיבוב.צנטריפוגה במשך 15 שניות יותר מ 8, 000 פעמים G לשטוף את קרום עמוד ספין להשליך את הזרימה דרך. חזור על שלב זה באמצעות 350 מיקרוליטרים אחרים של מאגר RW1 לפני שתמשיך לשלב הבא. הוסף 500 מיקרוליטרים של RPE של מאגר לעמודת הסיבוב.צנטריפוגה במשך 15 שניות יותר מ 8, 000 פעמים G לשטוף את קרום עמוד ספין. השלך את הזרימה והמשך לחזור על שלב זה על-ידי הוספת 500 מיקרוליטרים נוספים של RPE של מאגר לעמודת הסיבוב. הפעם, צנטריפוגה במשך שתי דקות יותר מ 8.000 פעמים G לשטוף את קרום עמוד ספין.השלך את הזרימה דרך והצב את עמודת הספין בצינור איסוף חדש של שני מיליליטר והמשך לצנטריפוגה במהירות מלאה למשך דקה אחת כדי להסיר כל מאגר שיורית שעשוי להיות נוכח בעמודת הספין. השלך את הזרימה דרך והצב את עמוד הסיבוב בצינור איסוף חדש של 1.5 מיליליטר. המשך להוסיף 30 עד 50 microliters של מים חינם RNase ישירות קרום עמוד ספין.צנטריפוגה במשך דקה אחת יותר מ 8, 000 פעמים G כדי לחמק RNA מן קרום עמוד ספין. בשלב זה, ה-RNA שלך מומס במים חופשיים RNase וייתכן שיהיה מאוחסן במינוס 80 מעלות צלזיוס עד שנה. המשך לכמת ולבדוק את טוהר הרנ"א שבודדת באמצעות ספקטרופוטומטר.אתם מחפשים שיא ב 260 ננומטר, שהוא חומצת גרעין, כולל RNA, סופג באופן מקסימלי. הכמות מתוארת בחלק הימני התחתון של התמונה בננוגרם למיקרוליטר. ניתן להסיק איכות על ידי יחס 260 230 המוצג פריט אחד מעל הכמות בחלק הימני התחתון של המסך.הגישה שלנו הראתה תשואות RNA נמוכות, במיוחד כאשר טיהרנו mRNA מרקמות הלב או מרקמות שהוקפאו בעבר. לכן אנחנו צריכים לבחור את התנאים כדי להגדיל את התשואות. עם זאת, התבוננו בעכברים לקויים ספציפיים ל-CD-36 EC, רמת האפרין B2 ו- DLL4 הוגדלה באופן משמעותי הן באנדוטליה של הריאות והן בלב, בהשוואה לבקרה.תוצאות אלה היו עולות בקנה אחד עם מחקרי במבחנה הקודמים שלנו, אשר עולה כי איכות RNA מספיק לניתוח במורד הזרם. התשואה הייתה נמוכה בשל התנאים המחמירים בסביבת העבודה שלנו. כדי להתגבר על מגבלה זו, זה קריטי להקים אזור עבודה חינם RNase לטהר משטחי עבודה וציוד שעלולים לקבל מזוהמים עם RNase ולהחליף כפפות לעתים קרובות על מנת לחלץ RNA איכות ולהגדיל את התשואות.זה גם קריטי למצוא ריכוזים מתאימים של נוגדני GFP במטריצת הזיקה ולהשתמש בריכוזים מתאימים של מעכבי RNase במאגר תריס הרקמה ולהשתמש RNase כלי פלסטיק חינם ריאגנטים עבור מיצוי RNA מן ריבוזום אנדותל של הרקמות הממוקדות.

translating-ribosome-affinity-purification-trap-for-rna-isolation

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

מכשול משמעותי מנתח ביוכימיים של הריבוזומים המכיל המתהווה peptidyl-tRNAs כבר נוכחות של הריבוזומים אחרים דגימות אותו, ריבוזומים לא מעורב בתרגום של רצף ה-mRNA ספציפי להיות מנותח. פיתחנו מתודולוגיה פשוטה כדי לטהר, בלעדי, את הריבוזומים המכיל את המתהווה peptidyl-tRNA של עניין.

בידוד של הריבוזומים תרגום המכילים Peptidyl-tRNAs עבור ניתוח פונקציונלי מבנית

סרטון זה מדגים בדיקת RNA במבחנה נפתחת לזיהוי חלבונים קושרי RNA (RBPs), אשר מקיימים אינטראקציה עם רצפי היסוד העשיר באדנילט-אורידילאט (ARE) ב-mRNA. RBPs המטרה מליזט התא מעורבבים עם בדיקת RNA כדי ליצור קומפלקסים של RNA-חלבון. הקומפלקסים מבודדים באמצעות טיהור זיקה תוך ניצול הזיקה של תווית הדסתיוביוטין של גשושית הרנ"א לחרוז מגנטי המסומן בסטרפטווידין.

RNA-Protein Pull-Down Assay לבידוד חלבונים קושרי RNA באמצעות מיצוי זיקה

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) מסוגל ללכוד תרגום ספציפי לסוג התא של mRNA. כאן אנו מדווחים על פרוטוקול TRAP הראשון המוקדש לבידוד mRNA באוכלוסיות תאים נדירות של עוברי דרוזופילה.

מלכודת RC, תרגום ריבוזום זיקה טיהור מאוכלוסיות תאים נדירות של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עוברים

כתב יד זה מתאר גישה לבידוד RNPs קוגנטיים נבחרים הנוצרים בתאים אוקריוטיים באמצעות העשרה מכוונת אוליגונוקלאוטידים ספציפית. אנו מדגימים את הישימות של גישה זו על ידי בידוד RNP מקביל הקשור לאזור הרטרו-ויראלי 5' הלא מתורגם המורכב מ-DHX9/RNA הליקאז A.

בידוד של קומפלקסים RNA חלבון מאותו מקור מתאי שימוש Elution oligonucleotide מכוונת

טנדם RNA בידוד שגרה (טיול) עבור שחזור של mRNA בנוי endogenously-חלבון מתחמי מתואר. באופן ספציפי, מתחמי RNA-חלבון תפור ויוו, polyadenylated RNAs מבודדים של תמציות עם חרוזים oligo(dT), mRNAs מסוים נלכדים עם ששונה oligonucleotides antisense RNA. חלבונים מאוגדים mRNAs מזוהים על-ידי ניתוח immunoblot.

הליך בידוד RNA טנדם מבוססי Oligonucleotide לשחזר את מתחמי ה-mRNA האיקריוטים-חלבון

מתרגם הריבוכמה אהדה הזיקה (מלכודת) מאפשר בידוד מהיר ויעיל של סוג תא ספציפי לתרגם mRNA. כאן, אנו מדגימים שיטה המשלבת הזרקת זנב הידרודינמי במודל העכבר של אוכלוסיית הכבד והמלכודת כדי לבחון את פרופיל הביטוי של אכלוס מחדש של hepatocytes.

סוג תא-ביטוי גנים ספציפי ליצירת פרופיל בכבד העכבר

כאן, אנו מתארים את immunoprecipitation של ריבוזומים ו-RNA הקשורים מאוכלוסיות לבחור של בוגרים זכר תאים הנבט באמצעות מערכת ריבוtag. הרבייה אסטרטגי ולimmunoprecipitation התוצאה הנקייה, התוצאות להתרבות להודיע על תא הנבט translatome ולספק תובנה לתוך מנגנונים של פנוטיפים מוטנטים.

ריבותג Immunoprecipitation בתאי הנבט של העכבר הגברי

אנו מציגים טכניקה לייצוב מהיר של מתחמים תרגומיים (ביוסינטזה של חלבונים) עם קשרים צולבים פורמלדהידים בתאי שמרים ויונקים חיים. הגישה מאפשרת לנתח מתווכים ארעיים ואינטראקציות דינמיות של RNA:חלבון. ניתן להשתמש במתחמים המקושרים ביישומים מרובים במורד הזרם, כגון בשיטות פרופיל מבוססות רצף עמוק, מיקרוסקופיה וספקטרומטריית מסה.

קיבוע מהיר ב- Vivo ובידוד מתחמים תרגומיים מתאי אוקריוטיים

אינטראקציות של תרגום משותף ממלאות תפקיד מכריע בשינויים בשרשרת המתהווה, במיקוד, בקיפול ובמסלולי הרכבה. כאן, אנו מתארים פרופיל ריבוזום סלקטיבי, שיטה לניתוח ישיר של in vivo, של אינטראקציות אלה במודל eukaryote Saccharomyces cerevisiae.

זיהוי גלובלי של רשתות אינטראקציה בין תרגומים משותפים על ידי פרופיל ריבוזום סלקטיבי

פרוטוקול זה נועד לבודד mRNA ריבוזומלי ספציפי לסוג התא באמצעות מודל העכבר NuTRAP.

לבודד רנ"א ספציפיים לסוג תא מדגימות רקמות הטרוגניות קפואות ללא מיון תאים

ALIBi (ALIBi) היא שיטה חדשה שמופעלת אופטוגנטית שפותחה לתיוג וטיהור אוכלוסיות תת-תאיות של ריבוזומים לצורך ריצוף וניתוח פרוטאומי במורד הזרם וניתוח פרוטאומי.

בידוד תת-אוכלוסיות ריבוזום תת-תאיות בהתבסס על ביוטינילציה מוגברת במיקום ספציפי לתג פפטיד רקומביננטי - תאורה מוגבלת -

למד שיטה לטיהור רנא מקושר לריבוזומים מתאי אנדותל בעכברים באמצעות תיוג EGFP גנטי. טכניקה זו מאפשרת ניתוח תעתיקי לחקר מנגנוני אנגיוגנזה וביולוגיה כלייתית.

תרגום הריבוכמה אהדה לטיהור (מלכודת) לבידוד רנ א מתאי האנדותל בvivo

גלה סרטונים נוספים