ביופסיה של האדם בלסטוציסטה וויטריפיקציה

הן ביופסיה blastocyst ו vitrification היו מהפכה בהפריה חוץ גופית, הפריה חוץ גופית, המאפשר עוברים מכל רחבי העולם לבצע בדיקות גנטיות טרום השתלה על עוברים אנושיים עם סיכון מינימלי לעובר. ביופסיה של טרופיקטודרמה אפשרה אחזור של כשבעה תאים מעובר בוגר, ובכך אפשרה ניתוח גנטי חזק במורד הזרם. יתר על כן, לא הוכחה כל השפעה, עד כה, לגישה זו.

היעילות הקלינית של זרימת עבודה זו מאפשרת לחולים עם תנאים מונוגניים וכל אותם חולים עם סיכון מוגבר של מומים כרומוזומליים בתוך blastocyst שלהם ליהנות בדיקות גנטיות טרום תפללה. יש עדיין מקום לשיפור האסטרטגיות הנוכחיות של בחירת עוברים. לדוגמה, פרופיל miRNomic ופרוטומי מייצג אפשרויות מסקרנות להשלמת בדיקות גנטיות של טרום-נתיל בביופסיה אחת של טרופיקטרום.

מפעילים לא מנוסים לעתים קרובות נאבקים עם פתיחה וחדירה של zona pellucida. זה רק עניין של מיקוד. הלסטוציסט, מטרת הלייזר והפיגט צריכים להיות באותו מישור מוקד.

לאחר תיוג צלחת הביופסיה עם פרטי המטופל, עם סמן קבוע, לא רעיל, מספר כל טיפה 10 מיקרוליטר של מדיום HEPES-buffered עם העובר ומחזור ID.באמצעות צינור הפשטה 300 מיקרומטר, להעביר blastocyst קיימא, מורחב לחלוטין לירידה הראשונה של צלחת ביופסיה לשטוף את הירידה כדי להסיר את מדיום התרבות העודף, לפני העברת blastocyst לתוך הירידה השנייה בצלחת. מניחים את המנה תחת מיקרוסקופ הפוך, ומאימים את הביופסיה עם מדיום מהירידה השלישית של צלחת הביופסיה. תחת הגדלה של פי 20, כוון את הפלסטוציסט כדי לקבל תצוגה ברורה של מסת התא הפנימי בשעה שבע, ולאבטח את העובר על פיפטה המחזיקה.

התמקדו בזונה פלוצ'ידה כך שגם הפיפס וגם הפלסט נמצאים באותו מישור מוקד. עבור אל מטרת הלייזר, ולמקם את מצביע הלייזר על zona pellucida בצד הנגדי של מסת התא הפנימי. לקדוח את zona pellucida עם שניים עד שלושה פולסים לייזר, בעדינות ללחוץ על פיפטה ביופסיה נגד pellucida zona כדי לאפשר בינוני להיות פוצץ דרך הפרצה כדי לנתק את תאי trophectoderm מפני השטח הפנימיים.

כאשר ה- trophectoderm מנותק, הזן דרך החור ושופע שבעה עד שמונה תאי טרופיה לתוך פיפטה ביופסיה עם יניקה עדינה. בעת החלת יניקה מתונה כדי למתוח את תאי היעד, להזיז מעט את פיפטה ביופסיה לאחור ולכוון את הלייזר לכיוון החלק הדק ביותר של התאים שאפתן. אש שניים עד חמישה פולסים לייזר בצמתים בין התאים כדי להפריד את תאי היעד מגוף העובר.

כאשר שבר ה-trophectoderm הופרד מהבסטוציסט, שחרר את הרסיס לאותה טיפת ביופסיה הרחק מהמסרח כדי למנוע את הרסיס מלהיות נשאב בחזרה לתוך פיפטה הביופסיה. שחררו את ה-blastocyst מהפיגט המחזיק, והעלו מיד את שתי הפיפסות כדי למנוע מהרסיס להידבק לפיפסטים. לאחר מכן תדמיין את הקטע הביופסי למטרות בקרת איכות.

כאשר כל blastocysts כבר ביופסיה כפי שהוכח רק, להעביר את צלחת הביופסיה בחזרה מכסה המנוע לזרימה למינאר ולתייג את צלחת תרבות שלאחר ביופסיה עם מזהה הזוג וכל טיפה עם העובר ומזהה מחזור. בנוכחות עד, לשטוף את blastocyst במדיום הפריה חוץ גופית נקייה ולהזיז את blastocyst לירידה המקבילה שלה בצלחת שלאחר הביופסיה. לאחר מכן מניחים את המנה שלאחר הביופסיה על 37 מעלות צלזיוס, 6% פחמן דו חמצני, ו 5% אינקובטור חמצן.

בנוכחות העד ובתוך מכסה המנוע לזרימה למינארית בטמפרטורת החדר, סמן את צינורות PCR עם סמן קבוע ולא רעיל. סמן את המכסה של צלחת תרבות צינורות 60 x 15 מילימטר עם מזהי העובר ביופסיה, ולהוסיף שתי טיפות 10 מיקרוליטר של פתרון שטיפת ביופסיה לצלחת. ראש צינור הפשטה 140 מיקרומטר עם פתרון שטיפת ביופסיה מהטיפה השנייה של צלחת צינורות תחת מיקרוסקופ סטריאו לדמיין את שברי trophectoderm.

שחרר בעדינות תמיסת כביסה ביופסית על שבר ה- trophectoderm, וטען את השבר לתוך פיפטה החשפנות. מעבירים את השבר לטיפה השנייה של תווי שטיפת ביופסיה, ושוטפי בזהירות את הרקמה פעמיים עד שלוש פעמים. להעביר את שבר trophectoderm לתחתית צינור PCR שכותרתו כראוי עם פתרון טעינה, דואג להימנע מנגיעה בקירות הצינור עם קצה פיפטה הפשטה.

כאשר כל השברים נוספו לצינורות שלהם, לסובב את כל הצינורות בצנטריפוגה מיני במשך כמה שניות כדי לעים את השברים. לאחר מכן לאחסן את הדגימות במינוס 20 מעלות צלזיוס עד שהם נשלחים למעבדה הגנטית המפנה לבדיקה. בתוך 30 דקות של ביופסיה של טרופיקטודרמה, סמן צלחת vitrification עם פרטי המטופל ואת תעודות הזהות של blastocysts כי יש vitrified.

באמצעות cryolabels עמיד בטמפרטורה קרה מיוחדת, תווית vitrification תומך עם שם המטופל ואת שם המשפחה, מזהה זוג, זיהוי של העובר כי יהיה טעון על זה, ואת התאריך של ההליך. בטמפרטורת החדר, לוותר על 300 microliters של פתרון שיווי משקל עבור כל blastocyst כי יהיה vitrified, בנוכחות עד, להשתמש פיפטה חשפנות 300 מיקרומטר כדי להעביר את blastocyst לתוך נפח אחד של פתרון שיווי משקל. השאירו את הפיצוץ בתסרון שיווי המשקל למשך 13 עד 15 דקות.

לאחר הצטמקות ראשונית של הנפח, תישמר התרחבות הדרגתית. בסוף שיווי המשקל, להוסיף 300 microliters של פתרון vitrification ל הבאר השנייה של צלחת vitrification ולהעביר את blastocyst המורחבת לחלוטין לפתרון vitrification במשך דקה אחת. בסוף הדגירה, לשטוף את blastocyst כדי לדלל את פתרון שיווי המשקל, בנוכחות עד, לטעון את blastocyst על תמיכה vitrification.

הסר את עודף של פתרון vitrification. סרט עדין של פתרון צריך להקיף את blastocyst. לצלול את התמיכה vitrification לתוך חנקן נוזלי, במרץ להזיז את התמיכה כדי להפחית את הסיכון של היווצרות בועה קרוב לדגימה.

לאחר מכן מניחים את מכסה המגן על התמיכה בעוד התמיכה vitrification עדיין שקוע חנקן נוזלי. מתוך 1, 544 הליכי ביופסיה trophectoderm שנערכו במהלך תקופה זו שנתיים נציג, בין אחד לארבעה blastocysts היו ביופסיה לכל הליך במשך בין שלוש ל 22 דקות לכל הליך. בחלקות אלה, התזמון הממוצע של הביופסיה עבור כל מפעיל לאורך שלבי המחקר מוצגים, עם ערך כולל ממוצע של 8.24 דקות.

זה מועיל לרכוש תמונה של כל שבר biopsied למטרות בקרת איכות כדי להעריך אם הגורם לאבחונים חד משמעיים היה בלתי ניתן לערעור למימד ו / או לאיכות של השבר, לצנרת, או כמה בעיות בעיבוד המדגם במעבדה הגנטית. במחקר זה, 572 בלסטוציסטים euploid התחממו לעבור העברת עובר לאחר אבחנה של euploidy. כל הפלסטוציסטים התרחבו תוך 30 דקות, כאשר 2.4% מהפלסטוציסטים לא התרחבו מחדש בין 31 ל-90 דקות ו-4.9% לא התרחבו מחדש מעבר ל-90 דקות מיום המלחמה מחדש.

במיוחד עבור איכות ירודה ו / או יום שבעה blastocysts, העיתוי בין ביופסיה vitrification נראה חיוני כדי להשיג התרחבות מחדש לאחר ההתחממות. יש לדאוג להתמקד לפני פתיחת zona pellucida בעת חשיפת הצומת בין תא trophectoderm וירי, ולדאוג גם כדי למנוע התפשטות מחדש blastocyst לפני vitrification. קיימות שתי גישות נוספות לביופסיה של בלסטוציסט, שתיהן כרוכות בפתיחה של פלוצ'ידה והמתנה לקשת ספונטנית של תאי הטרופיקטודרמה.

גישות אלה קלות יותר אך דורשות יותר מניפולציות וגוזלות זמן רב יותר. היעילות של זרימת עבודה זו מאפשרת יישום של טכנולוגיות מולקולריות בהפריה חוץ גופית על מנת לנסות לבחור את blastocyst עם הסיכוי הגבוה ביותר להשתיל לפני העברת העובר. זכור לא להשתמש בכל מכשיר או פתרון שעלול להיות רעיל לעוברים ולמנוע זיהום DNA באמצעות חומרים ללא DNA.