Name: ב מחוץ לחוק העתק RNA-מבוססי לוציפראז העיתונאי שיטת המחקר בקרת תרגום ב Poxvirus-תאים נגועים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: למדו שיטת מחקר מבוססת RNA ללוציפראז לבחינת ויסות תרגום בתאים נגועים בפוקסווירוס. השיטה מאפשרת ניתוח אפקטים של אזורים 5'UTR ו-3'UTR על תרגום mRNA ומסייעת בפיתוח אסטרטגיות טיפוליות נגד זיהומים ויראליים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

הפרויקט מומן על ידי המכון הלאומי לבריאות (AI128406 www.nih.gov) ל ZY ו בחלק על ידי מרכז המחקר של סרטן ג'ונסון (http://cancer.k-state.edu) בצורה של הסטודנט לתואר ראשון בקיץ לPD.

1. הכנת תבנית ה-DNA על ידי PCR עבור תמלול והפריה חוץ גופית
<ol><li>כדי להכין את תבנית הדנ א. של ה-PCR, עיצוב התחל כאשר עיצוב התחל לשקול מאפיינים קריטיים כמו באורך פריימר, ריפוי טמפרטורה (Tm), GC תוכן, 3 ' לסיים עם G או C וכו '. הערה: דנו בפרטים בספרות. הזאת25,26,27</li>
	<li>עיצוב התחל לייצר אמפליקון PCR המכיל את האלמנטים הבאים 5 ' כדי 3 ' כיוון: T7-יזם, פולי (א) מנהיג, גחלילית ללוציפראז orf ו פולי (a) הזנב המכונה להלן T7_12A-fluc. עיצוב התחל (קדימה ואחורה) כדי להקיף את כל הרכיבים הנוספים שאינם נמצאים ב-DNA של התבנית (איור 2A). הערה: הרצף של כל הרכיבים ניתן למצוא בטבלה 1.
</li>
	<li>כלול מספר נוקלאוטידים נוספים בפריימר קדימה (5 '-3 ')28, ואחריו T7-יזם, פולי (A) מנהיג או הרצוי 5 '-הרצף utr ו 20 נוקלאוטידים, להתאים מבוסס על Tm, המתאים לקצה 5 ' של הגן של העיתונאי ORF. ודאו שהאזור המקביל בתחל זהה לחוט התחושה (+ סטרנד) של הגן. הערה: עבור ארוך 5 '-UTR, לסנתז שני שברי DNA: אחד עם T7 יזם ואחריו 5 '-UTR ושנית עם הגן של העיתונאי ORF. הצטרפו לשני הקטעים הללו באמצעות הרחבה החופפת PCR29.</li>
	<li>עיצוב הפוך לאחור (5 '-3 ') כדי לכלול את הזנב פולי (A) ו כ 20 נוקלאוטידים, להתאים בהתבסס על Tm, המתאים לסוף 3 ' של הגן של העיתונאי orf. להבטיח את האזור המתאים בתחל זהה החוט האנטי תחושה (-סטרנד) של הגן ו מסגרת לעצור קודון הוא נוכח לפני פולי (א) זנב. הערה: האורך הרצוי של A ב פולי (א) מנהיג או פולי (א) הזנב ניתן להתאים אישית את התחל. לדוגמה, כדי להוסיף 50 A בזנב פולי (A), ההילוך האחורי צריך להיות כרוך 50 של. באופן דומה, כדי להוסיף 20 א ' s במנהיג פולי (א), התחל הקדמי צריך להיות כרוך 20 A.</li>
	<li>עבור שליטה פנימית, עיצוב מערכת אחרת של תחל המכיל את האלמנטים הבאים 5 ' כדי 3 ' כיוון: T7 יזם, אקראי 5 '-utr קידוד רצף המכיל את הרצף kozak, renilla ללוציפראז orf ו פולי (א) הזנב התייחס להלן כמו T7_ . קוז'אק-רילוק</li>
	<li>בצינור ה-PCR, מוסיפים את הריאגנטים בסדר הבא: dnase מים בחינם, 2x באיכות גבוהה dna פולימראז, התחל, ורצף אישר ללוציפראז תבנית DNA (שולחן 2). הערה: יש לכוונן כמויות של רכיבים בודדים בתערובת בהתאם לעוצמת התגובה.</li>
	<li>השתמש במחזור ה-PCR הסטנדרטי 3-שלב (דנטורציה, ריפוי, הארכה) כדי ליצור תבנית DNA כפי שמוצג בטבלה 3. הערה: הטמפרטורה ריפוי X ° צ' תלוי התחל להגדיר לשמש זמן הארכה T min תלוי ב-PCR אמפליקון גודל ו-DNA פולימראז בשימוש.</li>
	<li>לזהות את מוצר ה-PCR על ידי הפעלת 5-10% מתגובת ה-PCR ב-1% הצמח Tris-אצטט-EDTA (טה) ג'ל (המכיל 0.1 μg/ml אתידיום ברומיד) יחד עם תקן מולקולרי זמין מבחינה מולקולרית משקל. דמיינו את הג תחת מאייר UV כדי לקבוע את הגודל של מוצר ה-PCR.</li>
	<li>לאחר קביעת הגודל הנכון של מוצר ה-PCR, ~ 1.7 kb עבור T7_12A-Fluc ו-~ 1.0 kb עבור T7_Kozak-Rluc, לטהר אותו באמצעות ערכת טיהור מסחרית של PCR. Elute ה-DNA באמצעות 100 μL החכירה מים חינם (איור 2B).</li>
	<li>פעם מטוהר, לבדוק את הריכוז של ה-DNA באמצעות ספקטרוסקופיה ולקבוע את A260/A280 יחס (~ 1.8-2.0 הוא מקובל).</li>
	<li>החנות DNA מטוהרים ב-20 ° c או להשתמש בתמלול מבחנה באופן מיידי.</li>
</ol>2. יצירת mRNA על ידי תמלול מחוץ לחומרים
<ol><li>
סנתז RNA ממוצר ה-PCR, באמצעות ערכת שעתוק מחוץ למערכת (איור 3 א). הערה: T7_12A-fluc ו-T7_Kozak-rluc תבניות DNA משמשות לסנתז 12A-Fluc ו-Kozak-Rluc mRNAs, בהתאמה.<ol>
<li>כדי לעשות זאת, לקחת שפופרת מיקרוצנטריפוגה ולהוסיף את הריאגנטים בסדר הבא: DNase-RNase מים ללא תשלום, מאגר NTP ערבוב, כובע אנלוגי, תבנית PCR המוצר, T7-RNA פולימראז שילוב (שולחן 4). הערה: מערכות הגבלה אחרות יכול לשמש גם כדי כובע RNA ברצף לאחר שעתוק מחוץ לתחום ההוראה של היצרן.</li>
		<li>מערבבים ביסודיות ומודגרות ב 37 ° c עבור 2 h.</li>
		<li>המשך לטיהור של רנ א מסונתז באמצעות ערכת טיהור RNA.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הפעל מטוהרים RNA ב 1.5% agarose Tris-borate-EDTA (להיות) ג'ל (מכיל 0.5 μg/mL אתידיום ברומיד) כדי לבדוק את RNA. דמיינו את הג תחת מאייר אולטרא סגול (איור 3B).</li>
	<li>בדוק את הריכוז של ה-RNA באמצעות ספקטרוסקופיה ולקבוע A260/A280 יחס (~ 1.8-2.0 הוא מקובל).</li>
	<li>הורדה של ה-RNA הטהור והחנות ב-80 ° c.</li>
</ol>3. העברה של mRNA לתאים
<ol><li>זרע חלה תאים בצלחת 24-הבאר (כדי להיות כ. ~ 80-90% confluent ביום המחרת) ו דגירה לילה בחממה ב 37 ° צ' עם 5% CO2.</li>
	<li>להדביק תאי הלה עם וירוס vaccinia (VACV) בריבוי של זיהום (ממוי) של 5 או לשמור על תאי הלה נגוע להשוואה. הערה: מע הוא מספר החלקיקים הנגיפי הדבקים לכל תא.</li>
	<li>מו של X = {[(מספר התאים * X)/וירוס Titer] * 1000} μl של וירוס למדיום 1 mL.</li>
	<li>
לאחר הצורך לפוסט זיהום (hpi) (בניסוי זה ב 10-12 hpi), transfect mRNA (500 ng הכולל של mRNA לכל טוב של 24-ובכן צלחות) באמצעות מגיב שומנים ליפיד התגובה כפי שמוצג באיור 3C.
	<ol>
<li>עבור אחד טוב של צלחת 24-הבאר, לערבב 480 ng של 12A רצף הנושאת גחלילית לוציפראז (12A-Fluc) mRNA ו 20 ng של הרצף של קוזק הנושאת Renilla לוציפראז (Kozak-Rluc) mrna בצינור מיקרוצנטריפוגה אחד. ב שפופרת מיקרוצנטריפוגה אחרת להוסיף 1.1 μL של מגיב שומנים בשיטת השומנים.</li>
		<li>הוסף 55 μL של מדיום סרום מופחת בשני הצינורות. מערבבים ו דגירה בטמפרטורת החדר עבור 5 דקות.</li>
		<li>לאחר 5 דקות של דגירה, להוסיף 55 μL מגיב שומנים בשיטת השומנים המכילים סרום מופחת בינוני mRNA המכיל צינור.</li>
		<li>מערבבים בעדינות אך ביסודיות, ו-דגירה בטמפרטורת החדר עבור 15 דקות.</li>
		<li>במהלך הדגירה, להסיר את מדיום התרבות התא ולהוסיף 400 μL של בינוני סרום מופחת לכל טוב של לוחיות 24-טוב.</li>
		<li>לאחר הדגירה, להוסיף 100 μL של התערובת ה, ובאופן שווה לאחד הבאר של 24 לוחות היטב.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. מידה הלוציפראז פעילויות
<ol><li>חמש שעות שלאחר שיתוף הפעולה של 12a-fluc ו kozak-rluc mrna, למדוד פעילות לוציפראז באמצעות מערכת שיטת לוציפראז מסוגל לבצע שני כתבת בחני (g., כפול לוציפראז הכתב מערכת).</li>
	<li>הסר את המדיום סרום מופחת ולאחר מכן את התאים על ידי הוספת 150 μl 1x מאגר הליזה, רכיב של ערכת שיטת ללוציפראז.</li>
	<li>לאחר 10 דקות דגירה בטמפרטורת החדר, לאסוף את הליפוסט על ידי העברת התאים ולהעביר לצינור מיקרוצנטריפוגה.</li>
	<li>צנטריפוגה את ליפוסט ב 12,000 x g עבור 10 דקות ב 4 ° צ' כדי פסולת תא גלולה.</li>
	<li>הוסף 30 μL של סופרנטנט באטום לקיר 96 היטב לוחית שיטת לבנים עם תחתית מוצקה.</li>
	<li>למדוד את האור הכפול באמצעות ערכת התכונות לוציפראז ומדידת מהירות קורא לוחית רב במצב.</li>
	<li>בצע את המדידה באמצעות פונקציית קינטיקה (על בסיס כל הטוב) באמצעות ההגדרות המתוארות בטבלה 5. הערה: הקריאה יכולה להילקח גם באמצעות לומימטר ידני. הוסף נפח שווה של ליפוסט ומצע עבור Fluc ב קובט. לחכות 2 s ולמדוד עבור 10 s באמצעות לומימטר. בעקבות מדידה Fluc, במהירות להוציא קובט מלומטר ולהוסיף נפח שווה של המצע עבור Rluc ידנית. שוב, לחכות 2 s ולמדוד עבור 10 s באמצעות לומימטר.</li>
	<li>ייצוא נתוני קריאת האור לתבנית קובץ רצויה.</li>
	<li>קבע את קצב התרגום היחסי מ-12A-Fluc mRNA בתאי הלה נגוע VACV על-ידי חלוקת ערך Fluc על-ידי ערך Rluc השליטה הפנימית. הערה: איור משלים 1 מציג את הניתוח שלב אחר שלב של נתונים גולמיים כדי לקבל פעילות fluc יחסית.</li>
</ol>

<ol><li>Crick, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Symposia+of+the+Society+for+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">On protein synthesis.</a> Symposia of the Society for Experimental Biology. 12, 138-163 (1958).</li>
<li>Crick, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+Dogma+of+Molecular+Biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Central Dogma of Molecular Biology.</a> Nature. 227, 561-563 (1970).</li>
<li>Sonenberg, N., Hinnebusch, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+Translation+Initiation+in+Eukaryotes%3A+Mechanisms+and+Biological+Targets%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Regulation of Translation Initiation in Eukaryotes: Mechanisms and Biological Targets.</a> Cell. 136, 731-745 (2009).</li>
<li>Spriggs, K. A., Bushell, M., Willis, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+Regulation+of+Gene+Expression+during+Conditions+of+Cell+Stress%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Translational Regulation of Gene Expression during Conditions of Cell Stress.</a> Molecular Cell. 40, 228-237 (2010).</li>
<li>Shchelkunov, S. N., Marennikova, S. S., Moyer, R. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aShchelkunov%2C+SN+%22Orthopoxviruses+Pathogenic+for+Humans%22">Orthopoxviruses Pathogenic for Humans</a>. , Springer US. (2005).</li>
<li>Gale, M., Tan, S. L., Katze, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+Control+of+Viral+Gene+Expression+in+Eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+Molecular+Biology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Translational Control of Viral Gene Expression in Eukaryotes.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 64, 239-280 (2000).</li>
<li>Walsh, D., Mathews, M. B., Mohr, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tinkering+with+Translation%3A+Protein+Synthesis+in+Virus-Infected+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Tinkering with Translation: Protein Synthesis in Virus-Infected Cells.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5, a012351(2013).</li>
<li>Cao, S., Dhungel, P., Yang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Going+against+the+Tide%3A+Selective+Cellular+Protein+Synthesis+during+Virally+Induced+Host+Shutoff%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Going against the Tide: Selective Cellular Protein Synthesis during Virally Induced Host Shutoff.</a> Journal of Virology. 91, e00071-e00017 (2017).</li>
<li>Pelletier, J., Kaplan, G., Racaniello, V. R., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cap-independent+translation+of+poliovirus+mRNA+is+conferred+by+sequence+elements+within+the+5%E2%80%99+noncoding+region%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cap-independent translation of poliovirus mRNA is conferred by sequence elements within the 5’ noncoding region.</a> Molecular and Cellular Biology. 8, 1103-1112 (1988).</li>
<li>Pelletier, J., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Internal+initiation+of+translation+of+eukaryotic+mRNA+directed+by+a+sequence+derived+from+poliovirus+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Internal initiation of translation of eukaryotic mRNA directed by a sequence derived from poliovirus RNA.</a> Nature. 334, 320-325 (1988).</li>
<li>Guo, L., Allen, E., Miller, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+a+cap-independent+translation+element+that+functions+in+either+the+3%E2%80%B2+or+the+5%E2%80%B2+untranslated+region%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Structure and function of a cap-independent translation element that functions in either the 3′ or the 5′ untranslated region.</a> RNA. 6, 1808-1820 (2000).</li>
<li>Simon, A. E., Miller, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3%E2%80%B2+Cap-Independent+Translation+Enhancers+of+Plant+Viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">3′ Cap-Independent Translation Enhancers of Plant Viruses.</a> Annual Review of Microbiology. 67, 21-42 (2013).</li>
<li>Marom, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+poly%28A%29+binding+proteins+mediate+internal+translational+initiation+by+a+plant+viral+IRES%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biology%22%5BJournal%5D)">Diverse poly(A) binding proteins mediate internal translational initiation by a plant viral IRES.</a> RNA Biology. 6, 446-454 (2009).</li>
<li>Liu, B., Qian, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+reprogramming+in+cellular+stress+response%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Review.+RNA%22%5BJournal%5D)">Translational reprogramming in cellular stress response.</a> Wiley Interdisciplinary Review. RNA. 5, 301-305 (2014).</li>
<li>Ahn, B. Y., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capped+poly%28A%29+leaders+of+variable+lengths+at+the+5%E2%80%99+ends+of+vaccinia+virus+late+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Capped poly(A) leaders of variable lengths at the 5’ ends of vaccinia virus late mRNAs.</a> Journal of Virology. 63, 226-232 (1989).</li>
<li>Ahn, B. Y., Jones, E. V., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+vaccinia+virus+gene+encoding+an+18-kilodalton+subunit+of+RNA+polymerase+and+demonstration+of+a+5%E2%80%99+poly%28A%29+leader+on+its+early+transcript%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Identification of the vaccinia virus gene encoding an 18-kilodalton subunit of RNA polymerase and demonstration of a 5’ poly(A) leader on its early transcript.</a> Journal of Virology. 64, 3019-3024 (1990).</li>
<li>Schwer, B., Visca, P., Vos, J. C., Stunnenberg, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discontinuous+transcription+or+RNA+processing+of+vaccinia+virus+late+messengers+results+in+a+5%E2%80%B2+poly%28A%29+leader%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Discontinuous transcription or RNA processing of vaccinia virus late messengers results in a 5′ poly(A) leader.</a> Cell. 50, 163-169 (1987).</li>
<li>Yang, Z., Martens, C. A., Bruno, D. P., Porcella, S. F., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pervasive+initiation+and+3%E2%80%B2+end+formation+of+poxvirus+post-replicative+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Pervasive initiation and 3′ end formation of poxvirus post-replicative RNAs.</a> Journal of Biological Chemistry. 287, 31050-31060 (2012).</li>
<li>Dhungel, P., Cao, S., Yang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+5%E2%80%99-poly%28A%29+leader+of+poxvirus+mRNA+confers+a+translational+advantage+that+can+be+achieved+in+cells+with+impaired+cap-dependent+translation%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">The 5’-poly(A) leader of poxvirus mRNA confers a translational advantage that can be achieved in cells with impaired cap-dependent translation.</a> PLOS Pathogens. 13, e1006602(2017).</li>
<li>Jha, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trans-kingdom+mimicry+underlies+ribosome+customization+by+a+poxvirus+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Trans-kingdom mimicry underlies ribosome customization by a poxvirus kinase.</a> Nature. 546, 651-655 (2017).</li>
<li>Dai, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+Profiling+Reveals+Translational+Upregulation+of+Cellular+Oxidative+Phosphorylation+mRNAs+during+Vaccinia+Virus-Induced+Host+Shutoff%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Ribosome Profiling Reveals Translational Upregulation of Cellular Oxidative Phosphorylation mRNAs during Vaccinia Virus-Induced Host Shutoff.</a> Journal of Virology. 91, e01858-e01816 (2017).</li>
<li>De Silva, F. S., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin-independent+plasmid+replication+occurs+in+vaccinia+virus+cytoplasmic+factories+and+requires+all+five+known+poxvirus+replication+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Origin-independent plasmid replication occurs in vaccinia virus cytoplasmic factories and requires all five known poxvirus replication factors.</a> Journal of Virology. 2, 23(2005).</li>
<li>Yang, Z., Bruno, D. P., Martens, C. A., Porcella, S. F., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+high-resolution+analysis+of+vaccinia+virus+and+host+cell+transcriptomes+by+deep+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Simultaneous high-resolution analysis of vaccinia virus and host cell transcriptomes by deep RNA sequencing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107, 11513-11518 (2010).</li>
<li>Yang, Z., Bruno, D. P., Martens, C. A., Porcella, S. F., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-Wide+Analysis+of+the+5%E2%80%B2+and+3%E2%80%B2+Ends+of+Vaccinia+Virus+Early+mRNAs+Delineates+Regulatory+Sequences+of+Annotated+and+Anomalous+Transcripts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Genome-Wide Analysis of the 5′ and 3′ Ends of Vaccinia Virus Early mRNAs Delineates Regulatory Sequences of Annotated and Anomalous Transcripts.</a> Journal of Virology. 85, 5897-5909 (2011).</li>
<li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymerase+Chain+Reaction%3A+Basic+Protocol+Plus+Troubleshooting+and+Optimization+Strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2012).</li>
<li>Dieffenbach, C. W., Lowe, T. M., Dveksler, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((General+concepts+for+PCR+primer+design%5BTitle%5D)+AND+%22PCR+Methods+and+Applications%22%5BJournal%5D)">General concepts for PCR primer design.</a> PCR Methods and Applications. 3, S30-S37 (1993).</li>
<li>Innis, M. A., Gelfand, D. H., Sninsky, J. J., White, T. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aInnis%2C+MA+%22PCR+Protocols%3A+A+Guide+to+Methods+and+Applications%22">PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications</a>. , Academic Press. (2012).</li>
<li>Baklanov, M. M., Golikova, L. N., Malygin, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+on+DNA+Transcription+of+Nucleotide+Sequences+Upstream+to+T7+Promoter%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Effect on DNA Transcription of Nucleotide Sequences Upstream to T7 Promoter.</a> Nucleic Acids Research. 24, 3659-3660 (1996).</li>
<li>Thornton, J. A. Splicing by Overlap Extension PCR to Obtain Hybrid DNA Products. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aThornton%2C+JA+%22The+Genetic+Manipulation+of+Staphylococci%3A+Methods+and+Protocols%22">The Genetic Manipulation of Staphylococci: Methods and Protocols</a>. , Humana Press. New York. 43-49 (2017).</li>
<li>Akichika, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cap-specific+terminal+N6-methylation+of+RNA+by+an+RNA+polymerase+II%E2%80%93associated+methyltransferase%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cap-specific terminal N6-methylation of RNA by an RNA polymerase II–associated methyltransferase.</a> Science. , (2018).</li>
<li>Sun, H., Zhang, M., Li, K., Bai, D., Yi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cap-specific%2C+terminal+N6-methylation+by+a+mammalian+m6Am+methyltransferase%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Cap-specific, terminal N6-methylation by a mammalian m6Am methyltransferase.</a> Cell Research. 1, (2018).</li>
<li>Boulias, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+m6Am+methyltransferase+PCIF1+reveals+the+location+and+functions+of+m6Am+in+the+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Identification of the m6Am methyltransferase PCIF1 reveals the location and functions of m6Am in the transcriptome.</a> bioRxiv. , 485862(2018).</li>
<li>Dominissini, D., Rechavi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N4-acetylation+of+Cytidine+in+mRNA+by+NAT10+Regulates+Stability+and+Translation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">N4-acetylation of Cytidine in mRNA by NAT10 Regulates Stability and Translation.</a> Cell. 175, 1725-1727 (2018).</li>
<li>Wei, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+m6A%2C+m6Am%2C+and+m1A+Demethylation+Mediated+by+FTO+in+the+Cell+Nucleus+and+Cytoplasm%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Differential m6A, m6Am, and m1A Demethylation Mediated by FTO in the Cell Nucleus and Cytoplasm.</a> Molecular Cell. 71, 973-985 (2018).</li>
<li>Fu, Y., Dominissini, D., Rechavi, G., He, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+regulation+mediated+through+reversible+m6A+RNA+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Gene expression regulation mediated through reversible m6A RNA methylation.</a> Nature Reviews Genetics. 15, 293-306 (2014).</li>
</ol>

המחברים רוצים לא להכריז על עניין פיננסי מתחרה.

כל השלבים ארבע-ליבות הם קריטיים להצלחת המועתק מחוץ לחוק רנ א מבוסס RNA הכתב ללוציפראז. תשומת לב מיוחדת ניתנת לעיצוב פריימר, במיוחד עבור רצף היזם T7. T7 RNA פולימראז מתחיל תעתיק מן הראשון המסומן G (gGG-5'-UTR-AUG-) ב T7 יזם הוסיף לפני רצף 5 '-utr. למרות באתר להתחיל שעתוק (TSS) מתחיל מ-G הראשון בסוף 5 ', להקטין את מספר הפחות מ שלוש באזור T7 יזם ירד את התשואה RNA/פלט מ שעתוק מבחנה. במהלך הניסוי, הבחנו כי ג'ל מטוהרים DNA מוצר לא היה הטוב ביותר עבור שעתוק מבחנה כמו גם תשואה ואיכות של RNA היו נמוכים יותר. הרצנו רק 5-10%...

על פי הדוגמה המרכזית, מידע גנטי זורם מ-DNA ל-RNA ולבסוף חלבון1,2. זרם זה של מידע גנטי מוסדר מאוד ברמות רבות כולל התרגום mrna3,4. פיתוח הכתב הקובע למדידת ביטוי הגנים יקל על ההבנה של מנגנוני הרגולציה המעורבים בתהליך זה. כאן אנו מתארים פרוטוקול ללמוד תרגום mrna באמצעות מחוץ לבית מתורבת מבוסס RNA כתבת ללוציפראז הכתבת בתאים הנגועים poxvirus.
Poxviruses מהווים רבים מאוד מסוכן אדם ופתוגנים בעלי חיים5. כמו כל הווירוסים האחרים, poxviruses להסתמך בלעדית על מכונות תא מארח עבור סינתזה חלבון6,7,8. כדי לסנתז ביעילות חלבונים ויראליים, וירוסים התפתחו אסטרטגיות רבות כדי לחטוף מכונות translational סלולרית כדי לנתב אותו לתרגום mrnas ויראלי7,8. מנגנון אחד המועסקים בדרך כלל על ידי וירוסים הוא להשתמש באלמנטים cis-משחק התעתיקים שלהם. הדוגמאות הבולטות כוללות את האתר הפנימי ריבוכמה כניסה (IRES) ומשפר תרגום עצמאית כובע (לצטט)9,10,11. אלה רכיבי ציסלהפוך את התעתיקים הנגיפי יתרון טרנסלtional על ידי משיכת מכונות translational באמצעות מנגנונים שונים12,13,14. מעל 100 poxvirus mrnas יש מרכיב שמור לגמרי cis-משחק באזור 5 '-untranslated (5 '-utr): 5 '-פולי (א) מנהיג ב 5 ' הקצוות של אלה mrnas15,16. האורכים של אלה 5 '-פולי (א) מנהיגים הם הטרוגנית ומופקים על ידי החלקה של רנ א poxvirus מקודד RNA פולימראז במהלך שעתוק17,18. אנחנו, ואחרים, לאחרונה גילו כי 5 '-פולי (A) מנהיג לקיים יתרון תרגום ל mrna בתאים נגוע vaccinia וירוס (vacv), חבר פרוטוטיפקס של poxviruses19,20.
בשנת מחוץ לחוק העתק RNA המבוסס הכתב ללוציפראז פותחה בתחילה כדי להבין את התפקיד של 5 '-פולי (א) מנהיג ב-mrna תרגום במהלך זיהום poxvirus19,21. למרות בסיס DNA המבוסס העיתונאי ללוציפראז שימוש נרחב, ישנם החסרונות מספר כי יהיה לסבך את פרשנות התוצאה בתאים נגועים poxvirus. ראשון, פלמידים מסוגלים לשכפל בתאים נגועים VACV22. שנית, שעתוק מוזר מתרחש לעתים קרובות בשנת DNA מפלסטיק18,23,24. שלישית, שעתוק מונחה המקדם של VACV מייצר פולי (א)-מנהיג האורכים הטרוגנית ובכך קשה לשלוט באורך המוביל של המנהיג בכמה ניסויים18. A ב מתורבת מבוסס RNA המבוסס העיתונאי ללוציפראז בעיות אלה ופרשנות הנתונים הוא פשוט.
ישנם ארבעה שלבים מרכזיים בשיטה זו: (1) התגובה שרשרת פולימראז (PCR) כדי ליצור את תבנית ה-DNA עבור תמלול של מבחנה; (2) בתמלול מתורבת להפקת mRNA; (3) העברה כדי לספק mRNA לתוך תאים; ו (4) זיהוי של פעילות לוציפראז כאינדיקטור לתרגום (איור 1). ה-PCR אמפליקון מכיל את האלמנטים הבאים ב 5 ' עד 3 כיוון: T7-יזם, פולי (A) מנהיג או המבוקש 5 '-utr רצף, גחלילית ללוציפראז פתח מסגרת קריאה (orf) ואחריו הזנב פולי (A). ה-PCR אמפליקון משמש כתבנית לסנתז mrna על ידי תמלול מחוץ לחומרים באמצעות T7 פולימראז. במהלך שעתוק מחוץ לחומרים מסוימים, כובע מז7גרם או כובע אנלוגי אחר משולב ב-mrna החדש מסונתז. התעתיקים הוכתרים מתגברים לתוך. תאים נגועים או מזוהמים בשואב אבק ליפוסט התא נאסף בזמן הרצוי לאחר החצייה כדי למדוד פעילויות לוציפראז המציינות ייצור חלבון מ mRNA מזוהמים. ניתן להשתמש באפשרות זו כדי ללמוד את התקנת התרגום של הרכיב cis-הנוכחי ב-5 '-utr, 3 '-utr או אזורים אחרים של mrna. יתר על כן, מחוץ למבחנה מבוססת RNA מבוססי שימוש ניתן להשתמש כדי ללמוד מנגנונים שונים של ייזום התרגום כולל חניכה תלוי כובע, חניכה כובע עצמאי, ייזום מחדש וחניכה פנימית כמו IRES.

<table><tbody><tr><td>2X-Q5 Master mix</td><td>New England Biolabs</td><td>M0492</td><td>פולימראז DNA בנאמנות גבוהה בשימוש ב-PCR</td></tr><tr><td>3&acute;-O-Me-m7G(5')ppp(5')G מבנה כובע RNA אנלוגי</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>S1411L</td><td>אנטי כובע הפוך אנלוגי או ARCA</td></tr><tr><td>Corning 96 באר חצי שטח לבן שטוח תחתון פוליסטירן מיקרופלייט</td><td>קורנינג</td><td>3693</td><td>אטום דופן 96 צלחת לבנה היטב עם תחתית</td></tr> <tr><td>מוצקהמערכת בדיקת מדווח לוציפראז כפולה</td><td>Promega</td><td>E1960</td><td>ערכת בדיקת לוציפראז כפולה (DLAK)</td></tr> <tr><td>ערכת E.Z.N.A. ערכת טהור מחזור</td><td>OMEGA BIO-TEK</td><td>D6492</td><td>ערכת טיהור PCR GloMax</td></tr><tr><td>Navigator Microplate Luminometer</td><td>Promega</td><td>GM2010</td><td>המכונה קורא צלחת מולטי-מוד לומינומטר</td></tr><tr><td>HiScribe T7 ערכת סינתזת RNA מהירה בתשואה גבוהה ניו</td><td>אינגלנד Biolabs</td><td>E2050S</td><td>ב ערכת שעתוק מבחנה</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11668019</td><td>מגיב טרנספקציה ליפידים קטיוני</td></tr><tr><td>NanoDrop2000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-2000</td><td>משמש למדידת ריכוז DNA ו-RNA</td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31985070</td><td>מופחתת בסרום</td></tr><tr><td>מדיה Purelink RNA Mini Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12183018A</td><td>ערכת טיהור RNA</td></tr><tr><td>מערכת מכסת Vaccinia</td><td>מערכת מכסת מכסת</td> <td>New England Biolabs</td><td>M2080</td></tr></tbody></table>

ב מחוץ לחוק העתק rna-מבוססי לוציפראז העיתונאי שיטת המחקר בקרת תרגום ב poxvirus-תאים נגועים

In Vitro Transcribed RNA-based Luciferase Reporter Assay to Study Translation Regulation in Poxvirus-infected Cells

כל poxvirus משוכפל לאחר שכפול ה-DNA נגיפי יש שימור אבולוציונית, לא בתבניות 5 '-פולי (A) מנהיג 5 '-UTR. כדי לנתח את התפקיד של 5 '-פולי (A) מנהיג ב-mrna תרגום במהלך זיהום poxvirus פיתחנו בתוך מתורבת מבוסס RNA הכתב ללוציפראז הכתבת. כתבת זו מהווה כוללת של ארבעה צעדי ליבה: (1) ה-PCR כדי להגביר את תבנית הדנ א לתמלול של מבחנה; (2) בתמלול מבחנה כדי ליצור mRNA באמצעות T7 RNA פולימראז; (3) העברה בכדי להחדיר מחוץ לגופית mRNA לתוך תאים; (4) זיהוי של פעילות לוציפראז כאינדיקטור לתרגום. ה-RNA המבוסס על כתבת לוציפראז המתוארת תיאר כאן בעיות של שכפול פלשבאמצע בתאים נגועים poxvirus ושעתוק מסתורית מן הפלביניים. פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לקבוע את רגולציה של התרגום על ידי cis-אלמנטס ב-mrna כולל 5 '-utr ו-3 '-utr במערכות שאינן תאים נגועים poxvirus. יתר על כן, מצבים שונים של חניכה התרגום כמו כובע תלוי, כובע עצמאי, חניכה מחדש, וחניכה פנימית ניתן לחקור באמצעות שיטה זו.

ארבעת השלבים של בשנת מתורבת מועתק RNA מבוססי כתבת לוציפראז: ה-PCR כדי ליצור תבנית DNA עבור תמלול שעתוק, בתמלול חוץ גופית כדי ליצור mRNA, העברה mRNA, ו לוציפראז מדידה, ניתן לראות בתרשים סכימטי ( איור 1). עיצוב התחל עבור שתי תבניות ה-DNA (fluc ו rluc) ואת הערכה הכללית של הארכה סככה מומחש התרשים (איור 2a). לאחר ה-PCR, המוצר הנכון PCR התגלה על ידי אלקטרופורזה בג של טאי-ג'ל (איור 2B). לאחר מכן, מוצר ה-PCR...

אנו מציגים פרוטוקול ללמוד את התקנת תרגום mRNA ב-poxvirus תאים נגועים באמצעות מבחנה מבוסס RNA המבוסס לוציפראז כתבת הכתב. ניתן להשתמש באותו שיטת לימוד בקרת תרגום על ידי cis-אלמנטס של mrna, כולל 5 '-אזור בלתי מתורגם (utr) ו-3 '-utr. ניתן גם לבדוק מצבי שונה של ייזום תרגום באמצעות שיטה זו.

ב מחוץ לחוק העתק RNA-מבוססי לוציפראז העיתונאי שיטת המחקר בקרת תרגום ב Poxvirus-תאים נגועים

Every poxvirus mRNA transcribed after viral DNA replication has an evolutionarily conserved, non-templated 5&#39;-poly(A) leader in the 5&#39;-UTR. To ...

הפרוטוקול שלנו עבור לוציפראז מבוסס RNA מועתק במבחנה מסייע ללמוד ויסות תרגום בתאים נגועים בנגיף אבעבועות רוח. בנוסף, אורך מותאם אישית של פולי(A)ליטר מאפשר ללמוד את השפעותיו הרגולטוריות על התרגום. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת את המחקר של ויסות תרגום על ידי אלמנטים Cis כגון 5'UTR ו 3'UTR ב mRNA וספקטרום רחב של חניכת תרגום.הויטרו מועתק RNA מבוסס RNA assay עשוי להיות מותאם לשלב שינוי כובע ושינויים אחרים המשמשים כדי לבדוק את ההשפעה על התרגום. כדי להתחיל, תכנן פריימרים קדימה ואחלווה כדי ליצור אמפייקון PCR המכיל את הרכיבים הבאים ב- 5'עד 3'כיוון:T7-Promoter, פולי(A)ליטר, Firefly Luciferase ORF בזנב פולי(A) המכונה T7_12A-Fluc, כוללים מספר נוקלאוטידים נוספים פריימר קדימה ואחריו T7-Promoter פולי(A)ליטר או רצף רצוי 5'UTR וכ 20 נוקלאוטידים המתאימים לקצה 5 של ORF של הגן הכתב. התאימו את אורך ה-Primer בהתאם לטמפרטורת ההיתוך המתאימה ל-5'ים של ORF של גן הכתב, כדי להבטיח שהאזור המתאים בפרימר זהה לתחושת הגדיל של הגן.לאחר מכן תכנן פריימר הפוך שיכלול זנב פולי(A) וכ-20 נוקלאוטידים. התאם בהתבסס על טמפרטורת ההיתוך המתאימה לקצה ה-3 של ORF של גן הכתב, כדי להבטיח שהאזור המתאים של פריימר יהיה זהה לגדיל האנטי-נס של הגן וקדון עצירה בתוך המסגרת יהיה קיים לפני זנב הפולי(A). לשליטה פנימית, תכנן קבוצה נוספת של פריימרים המכילים את הרכיבים הבאים ב- 5'עד 3'direction:T7-Promoter, רצף קידוד אקראי של 5'UTR המכיל רצף קוזאק, רנילה לוציפראז ORF וזנב פולי(A), המכונה T7_Kozak-Rluc.כדי להגדיר את התגובה, להוסיף ריאגנטים בסדר הבא לצינור PCR:DNase מים חינם, פולימראז DNA נאמנות גבוהה 2X, פריימרים ורצף אישר לוציפראז תבנית DNA. לאחר מחזור PCR סטנדרטי בן שלושה שלבים ליצירת תבנית DNA, זהה את מוצר ה- PCR על-ידי הפעלת 5-10% מתגובת PCR באלקטרופורזה של 1%agarose TAE gel יחד עם תקן משקל מולקולרי. כדי לקבוע את גודל מוצר ה-PCR, דמיינו את הג'ל תחת מאיר UV.לאחר קביעת הגודל הנכון של מוצר PCR, לטהר אותו באמצעות ערכת טיהור PCR זמין מסחרית באמצעות 100 microliters של מים ללא גרעין כדי לחמק ה-DNA. בדוק את הריכוז של ה-DNA מטוהרים באמצעות ספקטרופוטומטר ולאחסן אותו במינוס 20 מעלות צלזיוס לשימוש עבור תמלול במבחנה מיד. כדי לסנתז RNA ממוצר PCR, הוסף את ריאגנטים הבאים לצינור מיקרוצנטריפוגה:מים חופשיים DNase-RNase, תערובת מאגר NTP, אנלוגי כובע, תבנית מוצר PCR, ותערובת פולימראז T7-RNA מערכת שעתוק במבחנה.מערבבים היטב. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעתיים ולאחר מכן להמשיך לטיהור של RNA מסונתז באמצעות ערכת טיהור RNA. כדי לבדוק את RNA מטוהרים, חום RNA ב 70 מעלות במשך חמש דקות כדי להסיר מבנה משני ולהפעיל אותו על 1.5 ג'ל TBE agarose.ואז לדמיין את הג'ל תחת מאיר UV. בדוק את הריכוז של רנ"א מטוהר באמצעות ספקטרופוטומטר. תן לי את זה ותארך במינוס 80 מעלות צלזיוס.זרעי HeLa תאים בצלחת 24 באר כדי להשיג 80-90% confluency למחרת דגירה לילה באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני. להדביק תאי HeLa עם וירוס Vaccinia בריבוי של זיהום של חמישה ולשמור על תאי HeLa לא נדבקים להשוואה. ואז לה הדגירה את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס עם 5%פחמן דו חמצני במשך 10 עד 12 שעות.לאחר השעות הרצויות לאחר ההדבקה, מערבבים 480 ננוגרם של רצף 12A הנושא את Firefly Luciferase mRNA ו -20 ננוגרם של רצף קוזאק הנושא את רנילה לוציפראז mRNA בצינור מיקרוצנטריפוגה אחד. בצינור מיקרוצנטריפוגה אחר, להוסיף 1.1 microliters של רגנט עירוי שומנים cationic. הוסיפו 55 מיקרוליטרים של מדיית סרום מופחתת לשני הצינורות, ערבבו והתערבבו בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות.לאחר מכן הוסיפו 55 ריג'נטים דביקים של שומנים זעירים המכילים מדיית סרום מופחתת ל-mRNA המכיל צינור. מערבבים בעדינות אך ביסודיות עם פיפטה ודגירה בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות. במהלך הדגירה, להסיר את מדיום תרבות התא מהתאים ולהוסיף 400 microliters של מדיום סרום מופחת ל הבאר.כאשר הדגירה הושלמה, להוסיף 100 microliters של תערובת טיפה חכם באופן שווה לכל באר של צלחת 24 גם. חמש שעות לאחר שיתוף transfection עם 12A Fluc ו Kozak Rluc mRNA, להסיר את מדיום הסרום מופחת מהתאים lyse התאים על ידי הוספת 150 microliters 1X מאגר תזה מתוך ערכת בדיקה לוציפראז מסוגל לבצע שתי בדיקות כתב. לאחר הדגירה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, מגרדים את התאים באמצעות גומי ומזרק סטרילי ומעבירים לצינור מיקרוצנטריפוגה.כדי גלולה פסולת התא, צנטריפוגה ליזאט ב 12, 000 פעמים גרם במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. מעבירים 30 מיקרוליטרים של על-טבעיים ל הבאר של צלחת ממוסמרת אטומה עם 96 היטב לבן עם תחתית מוצקה. השתמש בערכת ההתמדה של Luciferase ובלומינומטר קורא לוחות רב-מצבי כדי למדוד את הזוהר הכפול באמצעות פונקציית קינטיקה כמתואר בכתב היד.לאחר ייצוא נתוני קריאת luminescence לתוך תבנית קובץ רצויה, לקבוע שיעור תרגום יחסי מ 12A Fluc mRNA בתאי HELA נגועים ו- VACV נגועים על ידי חלוקת ערך Fluc על ידי ערך Rluc בקרה פנימית. בדיקה זו שימשה לבדיקת יעילות התרגום של Fluc mRNA המכיל 5'Poly(A)ליטר בתאים נגועים ו- VACV נגועים. שני תאים נגועים ו- VACV הנגועים היו בהצלחה משותף עם Fluc ו Rluc mRNA.חלוקת Fluc על ידי Rluc מנורמל יעילות transfection ביציבות RNA בתאים. 5'Poly(A)ליטר המכיל mRNA יש יתרון תרגום במהלך זיהום VACV בהשוואה לתאים לא מודבקים. זה לא היה בגלל יעילות transfection דיפרנציאלי או יציבות mRNA כמו רמת RNA היה דומה בתאים נגועים ו- VACV נגוע חמש שעות לאחר transfection mRNA.קח טיפול מיוחד בעת תכנון פריימרים כמו זה יכול להשפיע לא רק על יעילות תגובת PCR, אלא גם על כל התהליכים במורד הזרם הדורשים את ה-DNA מוגברת. שיטה זו היא בדיקה חשובה כדי לבדוק במהירות את תקנת התרגום על ידי אלמנטים Cis. במידת האפשר, שיטה זו צריכה להיות מאומתת על ידי ניסויים משלימים אחרים.יש לנקוט אמצעי זהירות בעת שימוש בנגיף Vaccinia ולהימנע מחשיפה לכימיקלים כגון אתידיום ברומיד ופנול.

in-vitro-transcribed-rna-based-luciferase-reporter-assay-to-study

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

שיטה זו מתארת סינתזה in vitro בתפוקה גבוהה של mRNA עם כיסוי (capped) וללא כיסוי (uncapped), מפלסמיד ליניארי המכיל את הגן של לוסיפראז Gaussia (GLuc). ה-RNA מטוהר, וחלק מה-RNA ללא הכיסוי עובר תהליך כיסוי אנזימטי באמצעות אנזים הכיסוי של נגיף ה-Vaccinia. בשלב הסופי, ה-mRNA מוחדר (transfection) לתאי HeLa, ותעליל התרבית של התאים נבדק לפעילות לוסיפראז.

בתעתיק במבחנה תקרת של mRNA בלוציפראז Gaussia ואחריו transfection Cell הלה

Source: Chang, X., et al. Preparation of Pseudo-Typed H5 Avian Influenza Viruses with Calcium Phosphate Transfection Method and Measurement of Antibody Neutralizing Activity. J. Vis. Exp. (2021).This video demonstrates a luciferase-based assay to quantify pseudovirus infection in epithelial cells. The pseudovirus encodes the luciferase gene, which is expressed in infected cells. After washing, and cells are incubated with lysis buffer at an ultra-low temperature, and then thawed to induce lysis.

Assessing Pseudovirus Infection Using Luciferase Reporter Assay

סרטון זה מדגים שיטה למעקב אחר זיהומים נגיפיים במודלים של עכברים באמצעות וירוס רקומביננטי של לוציפראז וחלבון פלואורסצנטי המבטא חלבון פלואורסצנטי שפעת A. שיטה זו מאפשרת הן מחקרי in vivo והן מחקרי ex vivo, ומאפשרת לחוקרים לקבל תובנות לגבי דינמיקה נגיפית והשפעות של התערבויות.

וירוס שפעת של כתב לוציפראז-פלואורסצנטי למעקב אחר זיהומים ויראליים

סרטון זה מדגים בדיקה לחקר ויסות התרגום בתאים נגועים באבעבועות רוח. תאים לא נגועים ונגועים בנגיף הודבקו יחד עם mRNA המקודד עבור לוציפראז גחלילית (Fluc) ו Renilla luciferase (Rluc), כאשר mRNA Fluc מכיל רצף מוביל 5' Poly(A). עם הוספת מצעים ביולומינסנטיים על תאים lysed, למדוד את האות משני luciferases כדי לזהות את היתרון התרגומי של mRNA Fluc בתאים נגועים בנגיף, המוענק על ידי רצף מוביל.

בדיקת כתב לוציפראז לחקר ויסות תרגום בתאים נגועים באבעבועות רוח

אנו מתארים את השימוש של וירוס vaccinia כתב ניאון המאפשר מדידה של infectivity הנגיפי וביטוי גנים בזמן אמת דרך הביטוי בשלב מסוים של fluorophores כתב ספקטרלית שונה. אנחנו פירוט שיטה המבוססת על צלחת לזיהוי מדויק השלב שבו שכפול נגיף מושפע בתגובה לעיכוב מולקולה קטן.

וירוסי כתב Vaccinia לכימות פונקציה ויראלי בכל השלבים של ביטוי גנים

כאן אנו מתארים בדיקת גן מדווח מבוססת תאים ככלי רב ערך לסינון ספריות כימיות עבור תרכובות המווסתות מנגנוני בקרה פוסט-שעתוק המופעלים באמצעות 3' UTR.

הקרנת תפוקה גבוהה עבור כימית מאפננים של גני Post-תעתיק מוסדר

טרנספקציה לקו תאי המקרופאגים, RAW264.7, קשה בשל התגובה הטבעית של התא כנגד חומרים זרים. תיארנו כאן הליך עדין אך חזק להעברת גנים מדווחים על לוציפראז לתאי RAW264.7.

Transfecting תאי RAW264.7 עם לוציפראז כתב ג&#39;ין

וזמינותו ביולומינסנציה במבחנה כדי לקבוע סלולארית בשעון הביולוגי בתאי אפיתל החלב מוצג. שיטה זו משתמשת בתרבית של תאים כתב פלסמידים לבטא גרם אולי לפגיעה ביציבות לוציפראז תחת השליטה של האמרגן ג'ין תקופה 2 . זה ניתן להתאים את סוגי תאים אחרים כדי להעריך את ההשפעות איבר ספציפי על שעון ביולוגי.

במבחנה ביולומינסנציה Assay לאפיין בשעון הביולוגי בתאי אפיתל החלב

כאן, אנו מציגים את הפרוטוקולים כדי לזהות immunomodulators 1) וירוס מקודד המקדמים arbovirus השכפול וגורמים מארח 2) האיקריוטים שמגבילות את שכפול arbovirus. שיטות אלה פלורסצנטיות הפריה חוץ גופית מבוססות מאפשרים להשיג במהירות את המפרט כמותית של שכפול arbovirus ב מבחני פשטני עם יחס אות לרעש נמוך.

זיהומים arbovirus כמו כלים ההקרנה לצורך זיהוי גורמים אנטי ויראלי Immunomodulators ומנחה

כדי לזהות והרגולטורים הרומן של גורמי שעתוק, פיתחנו גישה למסך מסודר או לספריות RNAi ויראלי באמצעות שימוש כפול-לוציפראז מבוסס מבוססת הכתב. גישה זו מציעה דרך מהירה וזולה יחסית להקרין מאות מועמדים בניסוי אחד.

זיהוי של שעתוק מקדם ווסת באמצעות הקרנת תפוקה בינונית של ספריות מסודר וכתבת המבוססת על כפול-לוציפראז

פיתחנו בדיקת כתב ביוגנזה של מיקרו-רנ"א אינטרוני, שתשמש בתאים במבחנה עם ארבעה פלסמידים: אחד עם miRNA אינטרוני, אחד עם המטרה, אחד כדי לבטא יתר על המידה חלבון רגולטורי, ואחד עבור Renilla luciferase. ה-miRNA עובד ויכול היה לשלוט בביטוי לוציפראז על ידי קשירה לרצף המטרה.

בדיקת כתב לניתוח התבגרות מיקרו-רנ"א אינטרוניים בתאי יונקים

למדו שיטת מחקר מבוססת RNA ללוציפראז לבחינת ויסות תרגום בתאים נגועים בפוקסווירוס. השיטה מאפשרת ניתוח אפקטים של אזורים 5'UTR ו-3'UTR על תרגום mRNA ומסייעת בפיתוח אסטרטגיות טיפוליות נגד זיהומים ויראליים.

ב מחוץ לחוק העתק RNA-מבוססי לוציפראז העיתונאי שיטת המחקר בקרת תרגום ב Poxvirus-תאים נגועים

גלה סרטונים נוספים