In Vitro Transcribed RNA-based Luciferase Reporter Assay to Study Translation Regulation in Poxvirus-infected Cells

Pragyesh Dhungel; Fernando Cantu; Candy Hernandez; Zhilong Yang

doi:10.3791/59626

ב מחוץ לחוק העתק RNA-מבוססי לוציפראז העיתונאי שיטת המחקר בקרת תרגום ב Poxvirus-תאים נגועים

JoVE Journal
Immunology and Infection

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

JoVE Journal Immunology and Infection

In Vitro Transcribed RNA-based Luciferase Reporter Assay to Study Translation Regulation in Poxvirus-infected Cells

ב מחוץ לחוק העתק RNA-מבוססי לוציפראז העיתונאי שיטת המחקר בקרת תרגום ב Poxvirus-תאים נגועים

Full Text

15,664 Views

08:58 min

May 1, 2019

DOI: 10.3791/59626-v

Pragyesh Dhungel¹, Fernando Cantu¹, Candy Hernandez¹, Zhilong Yang¹

¹Division of Biology,Kansas State University

Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

אנו מציגים פרוטוקול ללמוד את התקנת תרגום mRNA ב-poxvirus תאים נגועים באמצעות מבחנה מבוסס RNA המבוסס לוציפראז כתבת הכתב. ניתן להשתמש באותו שיטת לימוד בקרת תרגום על ידי cis-אלמנטס של mrna, כולל 5 '-אזור בלתי מתורגם (utr) ו-3 '-utr. ניתן גם לבדוק מצבי שונה של ייזום תרגום באמצעות שיטה זו.

הפרוטוקול שלנו עבור לוציפראז מבוסס RNA מועתק במבחנה מסייע ללמוד ויסות תרגום בתאים נגועים בנגיף אבעבועות רוח. בנוסף, אורך מותאם אישית של פולי(A)ליטר מאפשר ללמוד את השפעותיו הרגולטוריות על התרגום. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת את המחקר של ויסות תרגום על ידי אלמנטים Cis כגון 5'UTR ו 3'UTR ב mRNA וספקטרום רחב של חניכת תרגום.

הויטרו מועתק RNA מבוסס RNA assay עשוי להיות מותאם לשלב שינוי כובע ושינויים אחרים המשמשים כדי לבדוק את ההשפעה על התרגום. כדי להתחיל, תכנן פריימרים קדימה ואחלווה כדי ליצור אמפייקון PCR המכיל את הרכיבים הבאים ב- 5'עד 3'כיוון:T7-Promoter, פולי(A)ליטר, Firefly Luciferase ORF בזנב פולי(A) המכונה T7_12A-Fluc, כוללים מספר נוקלאוטידים נוספים פריימר קדימה ואחריו T7-Promoter פולי(A)ליטר או רצף רצוי 5'UTR וכ 20 נוקלאוטידים המתאימים לקצה 5 של ORF של הגן הכתב. התאימו את אורך ה-Primer בהתאם לטמפרטורת ההיתוך המתאימה ל-5'ים של ORF של גן הכתב, כדי להבטיח שהאזור המתאים בפרימר זהה לתחושת הגדיל של הגן.

View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos