Name: פרוטוקול מחוץ לגופית להערכת רמות מיקרוארנה, פונקציות, וגנים היעד הקשורים בתאי הגידול (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: למדו פרוטוקול חישובי לזיהוי ואימות מיקרוארנה וגנים יעד בתאי סרטן באמצעות שיבוט UTR-3', מבחן לוציפראז וניתוח עקומת מינון-תגובה. השיטה מאפשרת הבנת מנגנוני בקרת גנים ופוטנציאל טיפולי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה נתמך על ידי תוכנית בסיסית מחקר המדע באמצעות קרן המחקר הלאומי של קוריאה (NRF) ממומן על ידי משרד החינוך (2017R1D1A3B03035662); הקרן לחקר האוניברסיטה, 2017 (HRF-201703-003).

<ol><li>He, L., Hannon, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs%3A+small+RNAs+with+a+big+role+in+gene+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs: small RNAs with a big role in gene regulation.</a> Nature Reviews Genetics. 5 (7), 522-531 (2004).</li>
<li>Park, J. K., Doseff, A. I., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+Targeting+Caspase-3+and+-7+in+PANC-1+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs Targeting Caspase-3 and -7 in PANC-1 Cells.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (4), (2018).</li>
<li>Park, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs-103%2F107+coordinately+regulate+macropinocytosis+and+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs-103/107 coordinately regulate macropinocytosis and autophagy.</a> Journal of Cell Biology. 215 (5), 667-685 (2016).</li>
<li>Henry, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-199a-3p+targets+CD44+and+reduces+proliferation+of+CD44+positive+hepatocellular+carcinoma+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">miR-199a-3p targets CD44 and reduces proliferation of CD44 positive hepatocellular carcinoma cell lines.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 403 (1), 120-125 (2010).</li>
<li>Hoefert, J. E., Bjerke, G. A., Wang, D., Yi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microRNA-200+family+coordinately+regulates+cell+adhesion+and+proliferation+in+hair+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The microRNA-200 family coordinately regulates cell adhesion and proliferation in hair morphogenesis.</a> Journal of Cell Biology. 217 (6), 2185-2204 (2018).</li>
<li>Anfossi, S., Fu, X., Nagvekar, R., Calin, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs%2C+Regulatory+Messengers+Inside+and+Outside+Cancer+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs, Regulatory Messengers Inside and Outside Cancer Cells.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1056, 87-108 (2018).</li>
<li>Khoshinani, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+miR-155%2FFOXO3a+and+miR-222%2FPTEN+in+acquired+radioresistance+of+colorectal+cancer+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Japanese+Journal+of+Radiology%22%5BJournal%5D)">Involvement of miR-155/FOXO3a and miR-222/PTEN in acquired radioresistance of colorectal cancer cell line.</a> Japanese Journal of Radiology. 35 (11), 664-672 (2017).</li>
<li>Gao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-155+increases+colon+cancer+chemoresistance+to+cisplatin+by+targeting+forkhead+box+O3%5BTitle%5D)+AND+%22Oncology+Letters%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-155 increases colon cancer chemoresistance to cisplatin by targeting forkhead box O3.</a> Oncology Letters. 15 (4), 4781-4788 (2018).</li>
<li>Catanzaro, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+miR-107%2C+miR-181c+and+miR-29a-3p+Promote+Activation+of+Notch2+Signaling+in+Pediatric+High-Grade+Gliomas+%28pHGGs%29%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Loss of miR-107, miR-181c and miR-29a-3p Promote Activation of Notch2 Signaling in Pediatric High-Grade Gliomas (pHGGs).</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (12), (2017).</li>
<li>Akbari Moqadam, F., Pieters, R., den Boer, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hunting+of+targets%3A+challenge+in+miRNA+research%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">The hunting of targets: challenge in miRNA research.</a> Leukemia. 27 (1), 16-23 (2013).</li>
<li>Brown, R. A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+RNA+extraction+from+tissues+for+microRNA+and+target+gene+expression+analysis%3A+not+all+kits+are+created+equal%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Total RNA extraction from tissues for microRNA and target gene expression analysis: not all kits are created equal.</a> BMC Biotechnology. 18 (1), (2018).</li>
<li>Kim, Y. K., Yeo, J., Kim, B., Ha, M., Kim, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+structured+RNAs+with+low+GC+content+are+selectively+lost+during+extraction+from+a+small+number+of+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Short structured RNAs with low GC content are selectively lost during extraction from a small number of cells.</a> Molecular Cell. 46 (6), 893-895 (2012).</li>
<li>Schmittgen, T. D., Livak, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+real-time+PCR+data+by+the+comparative+C%28T%29+method%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method.</a> Nature Protocols. 3 (6), 1101-1108 (2008).</li>
<li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2%28-Delta+Delta+C%28T%29%29+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li>
<li>Park, J. K., Seo, J. S., Lee, S. K., Chan, K. K., Kuh, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+Antitumor+Activity+of+Oxaliplatin+with+Epigenetic+Modifying+Agents%2C+5-Aza-CdR+and+FK228%2C+in+Human+Gastric+Cancer+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules+%26+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Combinatorial Antitumor Activity of Oxaliplatin with Epigenetic Modifying Agents, 5-Aza-CdR and FK228, in Human Gastric Cancer Cells.</a> Biomolecules & Therapeutics. 26 (6), 591-598 (2018).</li>
<li>Xia, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Downregulation+of+miR-301a-3p+sensitizes+pancreatic+cancer+cells+to+gemcitabine+treatment+via+PTEN%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Translational+Research%22%5BJournal%5D)">Downregulation of miR-301a-3p sensitizes pancreatic cancer cells to gemcitabine treatment via PTEN.</a> American Journal of Translational Research. 9 (4), 1886-1895 (2017).</li>
<li>Lee, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+silencing+of+MicroRNA+miR-107+regulates+cyclin-dependent+kinase+6+expression+in+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Pancreatology%22%5BJournal%5D)">Epigenetic silencing of MicroRNA miR-107 regulates cyclin-dependent kinase 6 expression in pancreatic cancer.</a> Pancreatology. 9 (3), 293-301 (2009).</li>
<li>van Tonder, A., Joubert, A. M., Cromarty, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limitations+of+the+3-%284%2C5-dimethylthiazol-2-yl%29-2%2C5-diphenyl-2H-tetrazolium+bromide+%28MTT%29+assay+when+compared+to+three+commonly+used+cell+enumeration+assays%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Research+Notes%22%5BJournal%5D)">Limitations of the 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT) assay when compared to three commonly used cell enumeration assays.</a> BMC Research Notes. 8, 47(2015).</li>
<li>Wang, P., Henning, S. M., Heber, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limitations+of+MTT+and+MTS-based+assays+for+measurement+of+antiproliferative+activity+of+green+tea+polyphenols%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Limitations of MTT and MTS-based assays for measurement of antiproliferative activity of green tea polyphenols.</a> PloS One. 5 (4), e10202(2010).</li>
<li>Wu, L., Belasco, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Let+me+count+the+ways%3A+mechanisms+of+gene+regulation+by+miRNAs+and+siRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Let me count the ways: mechanisms of gene regulation by miRNAs and siRNAs.</a> Molecular Cell. 29 (1), 1-7 (2008).</li>
<li>Jin, Y., Chen, Z., Liu, X., Zhou, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+the+microRNA+targeting+sites+by+luciferase+reporter+gene+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Evaluating the microRNA targeting sites by luciferase reporter gene assay.</a> Methods in Molecular Biology. , 117-127 (2013).</li>
<li>Ma, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gamma-synuclein+binds+to+AKT+and+promotes+cancer+cell+survival+and+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Tumour+Biology%22%5BJournal%5D)">Gamma-synuclein binds to AKT and promotes cancer cell survival and proliferation.</a> Tumour Biology. 37 (11), 14999-15005 (2016).</li>
<li>Pan, Z. Z., Bruening, W., Giasson, B. I., Lee, V. M., Godwin, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gamma-synuclein+promotes+cancer+cell+survival+and+inhibits+stress-+and+chemotherapy+drug-induced+apoptosis+by+modulating+MAPK+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Gamma-synuclein promotes cancer cell survival and inhibits stress- and chemotherapy drug-induced apoptosis by modulating MAPK pathways.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (38), 35050-35060 (2002).</li>
<li>Martinez-Sanchez, A., Murphy, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+Target+Identification-Experimental+Approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">MicroRNA Target Identification-Experimental Approaches.</a> Biology (Basel). 2 (1), 189-205 (2013).</li>
<li>Lee, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+profiling+identifies+microRNA+signature+in+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Expression profiling identifies microRNA signature in pancreatic cancer.</a> International Journal of Cancer. 120 (5), 1046-1054 (2007).</li>
<li>Nuovo, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+methodology+for+the+combined+in+situ+analyses+of+the+precursor+and+mature+forms+of+microRNAs+and+correlation+with+their+putative+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">A methodology for the combined in situ analyses of the precursor and mature forms of microRNAs and correlation with their putative targets.</a> Nature Protocols. 4 (1), 107-115 (2009).</li>
<li>Schmittgen, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+PCR+quantification+of+precursor+and+mature+microRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Real-time PCR quantification of precursor and mature microRNA.</a> Methods. 44 (1), 31-38 (2008).</li>
<li>Diederichs, S., Haber, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+role+for+argonautes+in+microRNA+processing+and+posttranscriptional+regulation+of+microRNA+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Dual role for argonautes in microRNA processing and posttranscriptional regulation of microRNA expression.</a> Cell. 131 (6), 1097-1108 (2007).</li>
<li>Orellana, E. A., Kasinski, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sulforhodamine+B+%28SRB%29+Assay+in+Cell+Culture+to+Investigate+Cell+Proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protocol%22%5BJournal%5D)">Sulforhodamine B (SRB) Assay in Cell Culture to Investigate Cell Proliferation.</a> Bio Protocol. 6 (21), (2016).</li>
<li>Lawrie, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+in+hematological+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Reviews%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs in hematological malignancies.</a> Blood Reviews. 27 (3), 143-154 (2013).</li>
<li>Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+lymphocyte+proliferation+in+vitro+and+in+vivo+with+the+intracellular+fluorescent+dye+carboxyfluorescein+diacetate+succinimidyl+ester%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester.</a> Nature Protocols. 2 (9), 2049-2056 (2007).</li>
<li>Xing, Z., Li, D., Yang, L., Xi, Y., Su, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+and+anticancer+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biochimica+et+Biophysica+Sinica%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs and anticancer drugs.</a> Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 46 (3), 233-239 (2014).</li>
<li>Moeng, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-107+Targets+IKBKG+and+Sensitizes+A549+Cells+to+Parthenolide%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer+Research%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-107 Targets IKBKG and Sensitizes A549 Cells to Parthenolide.</a> Anticancer Research. 38 (11), 6309-6316 (2018).</li>
<li>Chou, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+combination+studies+and+their+synergy+quantification+using+the+Chou-Talalay+method%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Drug combination studies and their synergy quantification using the Chou-Talalay method.</a> Cancer Research. 70 (2), 440-446 (2010).</li>
<li>Flamand, M. N., Gan, H. H., Mayya, V. K., Gunsalus, K. C., Duchaine, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+non-canonical+site+reveals+the+cooperative+mechanisms+of+microRNA-mediated+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">A non-canonical site reveals the cooperative mechanisms of microRNA-mediated silencing.</a> Nucleic Acids Research. 45 (12), 7212-7225 (2017).</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

אסטרטגיות לקביעת מטרות miRNA בתום ובלבד עם פונקציות של מירנה של עניין הם חיוניים להבנת תפקידים מרובים של Mirna. זיהוי של גנים היעד miRNA יכול להיות מנחה לפענוח התא איתות אירועים מאופנן על ידי Mirna בתא. החשיפה של גנים מטרה חשובה מבחינה פונקציונלית של miRNAs יכול לספק את הידע הבסיסי לפתח טיפול מבוססי Mirnas בסרטן.
מספר שיטות כגון microarrays ערכים, מיקרו ברצף הספרייה RNA קטן, רצף עמוק, היפוך הטרנססקריפט ב-PCR באתרו, ואת הגושים הצפוניים ניתן להחיל כדי לחקור את רמות הביטוי miRNA באמצעות RNA סך מב...

MicroRNAs (miRNAs) הם RNAs הרגולציה קטן כי בעיקר לווסת את תהליך התרגום והשפלה של RNAs שליח (mRNAs) על ידי התגובה ל 3 ' אזורים לא מתורגם (3 ' UTR) בתום היעד לאחד גנים1. ביטוי של miRNAs יכול להיות מוסדר על ידי מנגנונים שלאחר ההמרה. חוסר האיזון של מנגנונים כגון מביא בלתי מבוקרת וייחודית רמות הביטוי miRNAs במחלות רבות כולל סרטן2. ל-miRNA אחת יכול להיות מספר אינטראקציות עם mRNAs מגוונות. בהתאמה, mRNA הפרט יכול להיות נשלט על ידי miRNAs שונים. לכן, רשתות איתות תאיים מושפע באופן מסובכת על ידי ביטוי באופן מתבטא על ידי הפרעות פיסיולוגיים ומחלות ניתן ליזום והידרדר2,3,4, מיכל 5 , 6. למרות הביטוי השונה של mirnas נצפתה סוגים שונים של סרטן, המנגנונים המולקולריים לווסת את הנימוסים של תאים סרטניים בשילוב עם mirnas עדיין לא ידוע ברובו.
צבירת ראיות הראה כי התפקידים אונגניים או מדכאים הגידול של miRNAs תלוי בסוגי סרטן. לדוגמה, על-ידי פילוח forkhead box o3 (FOXO3), מיר-155 מקדם את התפשטות התא, גרורות, ו-cheמורשת של סרטן המעי הגס7,8. לעומת זאת, ההגבלה של הפלישה התאים glioma נגרמת על ידי מיר-107 באמצעות התקנה של חלבון מקור נוירוגניים הומולוג 2 (NOTCH2) ביטוי9. הערכה של האינטראקציות miRNA-target בקשר עם פונקציות miRNA הוא חלק הכרחי כדי להבין טוב יותר כיצד Mirna לווסת תהליכים ביולוגיים שונים במדינות בריאות וחולה10. בנוסף, הגילוי של היעד בתום האדם (s) של miRNAs יכול עוד לספק אסטרטגיה מכוון עדין עבור טיפול מבוסס Mirnas עם תרופות נגד סרטן שונים. עם זאת, האתגר העיקרי בתחום של miRNAs הוא זיהוי של יעדים ישירים של miRNAs. כאן, שיטות מפורטות מוצגים כגישות ניסיוני לצורך הגדרה גנטית היעד miRNA. תכנון ניסיוני מוצלח עבור זיהוי יעד miRNA כרוך בשלבים שונים ושיקולים (איור 1). השוואה של רמות miRNA בוגרת בתאי הגידול תאים נורמליים יכול להיות אחד ההליכים השכיחים כדי לבחור miRNA עניין (איור 1A). המחקר הפונקציונלי של miRNA שנבחרו כדי לזהות את ההשפעות של miRNA על התפשטות התא חשוב לצמצם את רשימת המטרות המועמדים הפוטנציאליים הטובים ביותר של miRNA עניין (איור 1B). מבוסס על פונקציות מאומת הניסויים של miRNAs, סקירה שיטתית של ספרות ומסד נתונים בחברה עם תוכנית חיזוי יעד Mirnas נדרש כדי לחפש את המידע הרלוונטי ביותר על פונקציות גן (איור 1C). הזיהוי של גנים היעד האמיתי של mirna העניין יכול להיות מושגת על ידי יישום ניסויים כגון שיטת ללוציפראז יחד עם שיבוט של 3 ' utr של גן, PCR בזמן אמת, ו בלוק מערבי (איור 1d). המטרה של הפרוטוקול הנוכחי היא לספק שיטות מקיפות של ניסויים מרכזיים, את תגובת שרשרת פולימראז מבוסס בזמן אמת (PCR), sulforhodamine B (SRB) שיטה בעקבות מחקים miRNA מחקה, מינון תגובה הדור עקומת, ו שיטת לוציפראז יחד עם שיבוט של 3 UTR של גן. הפרוטוקול הנוכחי יכול להיות שימושי להבנה טובה יותר של הפונקציות של miRNAs בודדים ואת המשמעות של Mirnas בטיפול בסרטן.

<table><tbody><tr><td>צינור חרוטי 15 מ"ל</td><td>SPL Life Sciences</td><td>50015</td><td></td></tr><tr><td>צלחת 24 בארות</td><td>Thermo Scientific</td><td>142475</td><td></td></tr><tr><td>50 מ"ל צינור חרוטי</td><td>SPL Life Sciences</td><td>50050</td><td></td></tr><tr><td>צלחת 6 בארות</td><td>Falcon</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>6x צבע טעינת DNA</td><td>Real Biotech Corporation</td><td>RD006</td><td>1 מ"ל</td></tr><tr><td>רצועת 8 כובעים</td><td>מיושם ביוסיסטמס</td><td></td><td>N8010535 לסינתזת cDNA</td></tr><tr><td>רצועת 8 צינורות</td><td>יישומי ביוסיסטמס</td><td>N8010580</td><td>לסינתזת cDNA</td></tr><tr><td>צלחת 96 בארות</td><td>פלקון</td><td>353072</td><td></td></tr><tr><td>חומצה אצטית</td><td>סיגמא</td><td>A6283-1L</td><td>1 ליטר</td></tr><tr><td>אגרוז A</td><td>ביו בייסיק</td><td>D0012</td><td>500 גרם</td></tr><tr><td>פוספטאז אלקליין</td><td>ניו אינגלנד ביולאבס</td><td>M0290S</td><td>10,000 U/mL</td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Bio basic Canada Inc</td><td>AB0028</td><td>25 גרם</td></tr><tr><td>AriaMx 96 רצועות צינור</td><td>Agilent Technologies</td><td>401493</td><td>למערכת PCR בזמן אמת</td></tr><tr><td>AriaMx PCR בזמן אמת</td><td>Agilent Technologies</td><td>G8830A</td><td>qPCR הגברה, זיהוי וניתוח נתונים</td></tr><tr><td>AsiSI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0630</td><td>10,000 יחידות/מ"ל</td></tr><tr><td>תאי CAPAN-1</td><td>ATCC</td><td>HTB-79</td><td></td></tr><tr><td>קולט אדים לתרבית תאים</td><td>Labtech</td><td></td><td>דגם: LCB-1203B-A2</td></tr><tr><td>תאי ספירה עם V-slash</td><td>פול מרינפלד</td><td>650010</td><td>מונה תאים</td></tr><tr><td>מאגר CutSmart</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>B7204S</td><td>10X ריכוז</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11965-092</td> ערכת מיצוי ג'ל DNA <td>500 מ"ל</td></tr><tr><td></td><td>Bionics</td><td>DN30200</td><td>200</td></tr><tr><td>הכנה סולם DNA</td><td>NIPPON Genetics EUROPE</td><td>MWD1</td><td>1 Kb סולם</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Invitrogen</td><td>18068015</td><td>100 יחידות</td></tr> מערכת <tr><td>בדיקת מדווח כפול לוציפראז</td><td>Promega</td><td>E1910</td><td>100 בדיקות</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>Gibco</td><td>26140-079</td><td>500 מ"ל</td></tr><tr><td>HIT תאים מוכשרים</td><td>Real Biotech Corporation (RBC)</td><td>RH617</td><td>תאים מוכשרים</td></tr><tr><td>תאי HPNE</td><td>ATCC</td><td>CRL-4023</td><td></td></tr><tr><td>LB מרק אגר</td><td>ביו בייסיק</td><td>SD7003</td><td>250 גרם</td></tr><tr><td>ליפופקטמין 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-027</td><td>0.75 מ"ל</td></tr><tr><td>ליפופקטמין RNAiMax</td><td>Invitrogen</td><td>13778-075</td><td>0.75 מ"ל</td></tr><tr><td>לומינומטר</td><td>פרומגה</td><td></td><td>דגם: E5311</td></tr><tr><td>צינור מיקרוצנטריפוגה</td><td>Eppendorf</td><td>22431021</td><td></td></tr><tr><td>קורא מיקרופלייט</td><td>TECAN</td><td></td><td>אינסופי F50</td></tr><tr><td>miRNA בקרת חיקוי</td><td>אמביון</td><td>4464058</td><td>5 nmole</td></tr><tr><td>miRNA-107 חיקוי</td><td>אמביון</td><td>4464066</td><td>5 nmole</td></tr><tr><td>miRNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td></td><td>217004 50 prep</td></tr><tr><td>Mupid-2plus (מערכת אלקטרופורזה)</td><td>TaKaRa</td><td></td><td>דגם: AD110</td></tr><tr><td>NotI</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>R3189</td><td>20,000 יחידות/מ"ל</td></tr><tr><td>תוכנית סייר Oligo</td><td>GeneLink</td><td></td><td>לעיצוב פריימר</td></tr><tr><td>מכסי רצועות צינור אופטי (רצועה 8x)</td> <td>Agilent Technologies</td><td>401425</td><td>לזמן אמת PCR</td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Gibco</td><td>31985-070</td><td>500 מ"ל</td></tr><tr><td>תאי PANC-1</td><td>ATCC</td><td>CRL-1469</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין/סטרפטומיצין</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>100 מ"ל</td></tr><tr><td>מאגר פוספט מלח</td><td>Gibco</td><td>14040117</td><td>1000 מ"ל</td></tr><tr><td>פלסמיד DNA miniprep S& V kit</td><td>Bionics</td><td>DN10200</td><td>200 prep</td></tr><tr><td>PrimeSTAR GXL DNA פולימראז</td><td>TaKaRa</td><td>R050A</td><td>250 יחידות</td></tr><tr><td>שייקר</td><td>TECAN</td><td></td><td>טלטול פלטפורמת</td></tr><tr><td>טלטול חממה</td><td>Labtech</td><td></td><td>דגם: LSI-3016A</td></tr><tr><td>Sigmaplot 14 תוכנה</td><td>Systat תוכנה בע"מ</td><td></td><td>עבור מינון-תגובה עקומת דור</td></tr><tr><td>Sulforhodamine B אבקה</td><td>Sigma</td><td>S1402-5G</td><td>5 גרם</td></tr><tr><td>SYBR תערובת מאסטר ירוקה</td><td>Smobio</td><td>TQ12001805401-3</td><td>צבע פלואורסצנטי מחייב עבור dsDNA</td></tr><tr><td>T4 DNA ligase</td><td>TaKaRa</td><td>2011A</td><td>25,000 U</td></tr><tr><td>TaqMan master mix</td><td>Applied Biosystems</td><td>4324018</td><td>200 תגובות, ללא AmpErase</td></tr><tr><td>UNG TaqMan בדיקת microRNA (has-miR-107)</td> <td>Applied Biosystems</td><td>4427975</td><td>מזהה בדיקה: 000443 (50RT, 150 PCR rxns)</td></tr><tr><td>בדיקת TaqMan microRNA (has-miR-301)</td><td>Applied Biosystems</td><td>4427975</td><td>מזהה בדיקה: 000528 (50RT, 150 PCR rxns)</td></tr><tr><td>ערכת TaqMan miR RT</td><td>Applied Biosystems</td><td>4366597</td><td>1,000 תגובות</td></tr><tr><td>חממת Thermo CO2 (BB15)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td>37 &deg; C ו-5% CO2 דגירה</td></tr><tr><td>חומצה טריכלורואצטית</td><td>סיגמא</td><td>91228-100G</td><td>100 גרם</td></tr><tr><td>בסיס Trizma</td><td>Sigma</td><td>T4661-100G</td><td>100 גרם</td></tr><tr><td>מים טהורים</td><td>במיוחד Invitrogen</td><td>10977-015</td><td>500 מ"ל</td></tr><tr><td>Veriti 96 באר תרמית מחזור יישומי</td><td>ביו-מערכות</td><td></td><td>להגברה של DNA (או cDNA)</td></tr><tr><td>XhoI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0146</td><td>20,000 יחידות/מ"ל</td></tr></tbody></table>

פרוטוקול מחוץ לגופית להערכת רמות מיקרוארנה, פונקציות, וגנים היעד הקשורים בתאי הגידול

An In Vitro Protocol for Evaluating MicroRNA Levels, Functions, and Associated Target Genes in Tumor Cells

MicroRNAs (miRNAs) הם RNAs הרגולציה קטנים אשר מזוהים לווסת מסלולים מסוימים של איתות תאיים במספר מחלות כולל סרטן. אלה RNAs הרגולציה קטנים בעיקר אינטראקציה עם 3 ' אזורים לא מתורגם (3 ' UTR) של שליח היעד שלהם RNAs (mRNAs) בסופו של דבר וכתוצאה מכך עיכוב תהליכי פענוח של mRNAs ואת הגדלת Mrnas היעד degradations. בהתבסס על רמות הביטוי ופונקציות תאיים, miRNAs מסוגלים לשמש גורמי רגולציה של mRNAs ומדכאים הגידול המדכא. זיהוי של גנים היעד בתום המטרה של miRNA בין מאות או אפילו אלפי מטרות חזוי מבחינה חישובית הוא צעד מכריע כדי להבחין את התפקידים ומנגנונים מולקולאריים בסיסיים של מירנה של עניין. תוכניות מסוימות לחיזוי היעד miRNA זמינים כדי לחפש אינטראקציות miRNA-mRNA אפשרי. עם זאת, השאלה המאתגרים ביותר היא כיצד לאמת גנים מטרה ישירה של miRNA עניין. פרוטוקול זה מתאר אסטרטגיה הניתן לפונקציה של שיטות מפתח כיצד לזהות יעדי miRNA הקשורים לפונקציה miRNA. פרוטוקול זה מציג מדריך מעשי על הליכים צעד אחר צעד כדי לחשוף רמות miRNA, פונקציות, ו-mRNAs הקשורות היעד באמצעות הבדיקה מבוסס בזמן אמת התגובה שרשרת פולימראז (PCR), sulforhodamine B (SRB) שיטת בעקבות מחקה מחקים העברה , מינון התגובה עקומת הדור, ושיטת לוציפראז יחד עם שיבוט של 3 ' UTR של גן, אשר הכרחי להבנה נכונה של התפקידים של miRNAs בודדים.

אישור מוצלח ומדויק של רמות miRNA חשוב לפרשנות של הנתונים שבהם הסיווג של Mirna אפשרי מבוסס על התפקידים הצפויים של Mirna בפיתוח והתקדמות של מחלה. רמות של miRNA-107 ו miRNA-301 נמדדו שלושה קווי התא הלבלב באמצעות ה-PCR כמותי המבוסס על בדיקה. סינתזה של cDNAs הן של miRNA ספציפית ו גן התייחסות באותה תגובה יכולה להגביר את האפשרות של נתונים. Panc-1 ו capan-1 הם בני אדם הלבלב אדנוקרצינומה תאים שורות, בעוד hpne הוא קו הלבלב מונצח צינור התא התמרה הדרגתית עם וקטור ביטוי retroviral יעיל מחסה האדם טלומראז הפוכה הטרנססקריפט (htert) גן. ...

פרוטוקול זה משתמש ב-החללית מבוסס בזמן אמת בתגובת שרשרת פולימראז (PCR), שיטת sulforhodamine B (SRB), 3 ' אזורים לא מתורגמים (3 ' UTR) שיבוט, ושיטת לוציפראז לאמת את הגנים היעד של miRNA עניין ולהבין את הפונקציות של Mirna.

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory RNAs which are recognized to modulate numerous intracellular signaling pathways in several diseases including ...

כדי לגשת אינטראקציות יעד microRNA עצבי עם פונקציות MicroRNA הוא קריטי כדי להבין כיצד MicroRNAs לווסת תהליכים ביולוגיים שונים במצבים בריאים וחלים. פרוטוקול זה מתאר את ההתרבות באמצעות אסטרטגיה לזיהוי מטרות microRNA ואת microRNAs פונקציונלי כמו אימות של יעד ישיר של microRNAs הוא מאתגר. הפרוטוקול שלנו יכול לספק תובנות על הפונקציה של microRNAs בודדים ואת המשמעות של microRNA בטיפול בסרטן.חישוב הריכוז המעכב החצי-מקסימלי הוא שיטה חשובה, לא רק למחקרי microRNA אלא להערכה יעילה של תרופות אחרות נגד סרטן. הפרוטוקול שלנו יהיה מועיל לחוקרים חדשים מאז שתיארנו את השיטה הבסיסית כדי להבין את רמת microRNAs בתא. כדי להתחיל את הפרוטוקול, ספור את התאים באמצעות מונה התאים.צלחת התאים בצלחת 96 היטב. למחרת, להכין קבוצה של תערובות transfection כדי לשנות את התאים בכמה ריכוזים סופיים של חיקוי בקרת microRNA, ו microRNA-107 לחקות. מתוך מלאי של חיקוי בקרת מיקרו-רנ"א של 25 מיקרומולריים, או מיקרו-רנ"א-107 מחקים, מדללים ומוסיפים חיקוי בקרה או מיקרו-רנ"א-107 במדיה המופחתת בסרום יחד עם הריג'נט השקוף בצינורות מיקרוצנטריפוגה.מערבבים בעדינות את תערובות האוליגו המכילות באמצעות מיקרופיגט. לאחר דגירה של 10 דקות במכסה המנוע של תא התרבות, מערבבים בעדינות את תערובות המכילות אוליגו שוב, ולאחר מכן מוסיפים 50 מיקרוליטרים של תערובות לתוך כל באר. שמור את התאים המרובים באינקובטור של תרבות התאים.בזהירות שאפו את מדיית תרבות התאים בכל באר של הצלחת ומלאו מיד 100 מיקרוליטרים של 10% חומצה טריכלורואצטית, או TCA, בכל באר. שמור את הצלחת המכילה 10% TCA בארבע מעלות צלזיוס במשך שעה אחת. לאחר מכן, לשטוף את הצלחת מספר פעמים על ידי שקוע אותו לתוך אמבטיה עם מי ברז.הסר מים עודפים מתוך בארות על ידי הקשה על הצלחת עד שלא נשארו מים, וייבש את הצלחת. פיפטה 50 מיקרוליטרים של 0.4% פתרון SRB לתוך כל באר כולל בארות ריקות. מנערים בעדינות את הצלחת עד שפתרון ה-SRB של 0.4% מכסה באופן שווה את תחתית בארות.לאחר מכן, לה הדגירה את הצלחת במשך 40 עד 60 דקות. לאחר הדגירה, לשטוף את הצלחת עם 1% חומצה אצטית עד הצבע מאוגד נשטף לחלוטין. פיפטה 100 microliters של 10 מילימולר טריס בסיס פתרון לתוך בארות המתאימות, כולל בארות ריקות.שמור את הצלחת על שייקר במשך 10 דקות. למדוד את הספיגה ב 492 ננומטר. חשב את אחוז הספיגה הממוצעת ואת סטיית התקן של כל קבוצה באמצעות ערכי ספיגה של מקשה SRB.יבא את הנתונים הגולמיים כולל ריכוזי טיפול, ספיגה ממוצעת וסטיית תקן לתוכנה על-ידי יישור אנכי של הנתונים. לחצו על הכרטיסייה 'יצירת תרשים' ובחרו בפסי שגיאה פשוטים של פיזור. בחר עמודות גליון עבודה כערכי סימנים ולחץ על הבא.בחלונית 'תבנית נתונים', בחרו זוגות X-Y ולחצו על הלחצן 'הבא'. בחרו בעמודות נתונים תואמות בחלונית 'בחירת נתונים'. לחץ על סיום כדי ליצור את ההתוויה.לחץ פעמיים על ציר ה- X כדי לשנות את סוג קנה המידה בשינוי קנה המידה של הציר. שנה את סוג קנה המידה מליניארי ליומן רישום. שנה את מספר טווח ההתחלה והסיום ל- 0.01 ו- 200, בהתאמה.לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על חלקת פיזור כלשהי, בחר התאמה לעקומה ולעבור אל קטגוריית המשנה המוגדרת על-ידי המשתמש. בחר עקומת תגובת מינון. לחץ על הלחצנים הבאים ולאחר מכן לחץ על סיום.עבור אל כרטיסיית הדוח ולאחר מכן בדוק את הערכים n, k ו- R. הפעל את ה- PCR כמפורט בפרוטוקול הטקסט הנלווה. לאחר מכן לעבור לעיכול כפול על ידי שילוב תערובות התגובה, כולל אנזימי ההגבלה Exo1 ו Not1 אחד בצינור.הדגירה את תערובות במשך שלוש עד ארבע שעות באמבט מים 37 מעלות צלזיוס. הפעל את המוצרים המתעכלים הכפולים על ג'ל 1%agarose. ואז לחתוך את הרצועות תחת אור UV.לטהר את מוצרי PCR מתעכל פעמיים וקטורים luciferase מן הרצועות excised. המשך עם קשירה של מוצרי PCR לתוך וקטורים luciferase על ידי הכנת 20 microliters של תערובות תגובת קשירה כולל קשירה DNA. בקצרה צנטריפוגה הצינור במשך 10 עד 15 שניות.הדגירה את הרצועה ב 16 מעלות צלזיוס לילה באמצעות מחזור תרמי. למחרת, לבצע טרנספורמציה על ידי הוספת תערובות קשירה לתוך הצינור המכיל תאים מוסמכים. יש להקיש בעדינות על הצינור ולשמור אותו על קרח למשך 20 דקות.מעבירים במהירות ובעדינות את הצינור לבלוק חום ב-42 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות עד דקה. לאחר הלם חום, מניחים את הצינור על קרח במשך 20 דקות. להפיץ תאים מוכשרים על צלחת אגר LB.לגדל תאים מוכשרים באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס לילה. למחרת, בחר מושבה בודדת והחזר את E.coli באחד מצינורות 8 הרצועות המכילים מים אולטרה-חמים, וחזור על צעד זה כדי למחזר את E.coli מארבע עד שמונה מושבות שנבחרו באקראי. העבר 25 מיקרוליטרים של השעיית E.coli לקבוצה אחרת של צינורות 8 רצועות.בצע את PCR המושבה באמצעות ההשעיה E.coli. הכינו את התדהים של לוציפראז בצלחת של 24 בארות. הוסף אחד עד פעמיים עשר לארבעת התאים במדיה של 500 מיקרוליטר לתרבות תאים עבור כל באר.לאחר הדגירה במהלך הלילה, יש להעיף 50 ננוגרם של וקטורים של לוציפראז לתאים עם חיקוי בקרה או חיקוי מיקרו-רנ"א ספציפי באמצעות רגנט טרנספרקט. למחרת, לשטוף את החלק הפנימי של הבאר פעמיים באמצעות מלוחים אגף פוספט. החל 200 microliters של ריאגנט תזה לתוך הבארים מספיק לבצע תזה התא לפני מדידת פעילות לוציפראז.שמור על הצלחת רועדת לפחות 15 דקות. מעבירים חמישה עד 10 מיקרוליטרים של lysate התא לתוך הצינור החדש, ולהוסיף 100 microliters של reagent אחד ומיד לערבב את הפתרון על ידי צינור. לאחר מכן לקרוא את פעילות לוציפראז גחלילית באמצעות אילומינומטר במשך 10 עד 15 שניות.מוסיפים 100 מיקרוליטרים של רגנט 2 באותו צינור ואז מערבבים על ידי צינור פעמיים. לבסוף, לקרוא את פעילות רנילה לוציפראז במשך 10 עד 15 שניות באמצעות illuminometer. RTPCR מציג הפחתה משמעותית של תאי מיקרו-רנ"א-107 ו-PANC-1 ו-CAPAN-1 בהשוואה לתאי HPNE.רמות המיקרו-רנ"א-301 עלו באופן משמעותי בתאי PANC-1 ו-CAPAN-1, בהשוואה לתאי HPNE. בדיקה SRB במחקר זה מראה בבירור כי התפשטות של תאים PANC-1 ירד בעקבות microRNA-107 לחקות transfection. ההקרנה של 11 יעדים חזויים פוטנציאליים של microRNA-107 מראה בבירור כי רק גמא סינוקלין, או SNCG, וסת חיובי של צמיחת תאים סרטניים אינטראקציה ישירה עם microRNA-107 ו PANC-1 תאים, המציין כי microRNA-107 יכול לווסת לרעה את התפשטות תאי PANC-1 על ידי ויסות הביטוי SNCG.בדיקות התפשטות תאים למבוגרים המשתמשות בישות המבוססת על טטרה הידרוליאום ו- CFSE ישימות כדי לסנן את ההשפעה של כגון חיקויי microRNA, בהתאם לסוגי התאים. בהתבסס על הפונקציה המותאמת באופן ניסיוני של microRNAs, נדרשת סקירה שיטתית של מסדי נתונים ותוכנית חיזוי יעדים כדי לצמצם את רשימת היעדים המועמדים לפני בדיקות Luciferase. להערכת יעילות שילוב של microRNAs עם תרופות נגד סרטן, זה יתרון לחשב ערכי IC מותאמים המבוססים על הפרוטוקול שלנו להערכת מדד שילוב.

an-vitro-protocol-for-evaluating-microrna-levels-functions-associated

Research

JoVE Journal

Genetics

גנטיקה

ספריית מזהה היעד הוא פלסמיד מבוסס, הגנום כולו אוסף של cDNA משובטים לשמש לזיהוי מטרות מירנה. כאן אנו מדגימים את השימוש והיישום.

הגנום כולו מסך עבור מטרות מירנה שימוש יעד המשימה ספריית מזהה

פולימראז כמותי זמן אמת תגובת שרשרת (QPCR) היא שיטה מהירה רגישה כדי לחקור את רמות הביטוי של microRNA שונים (מירנה) מולקולות דגימות הגידול. שימוש בביטוי זה השיטה של ​​מאות מולקולות שונות מירנה יכול להיות מוגבר, לכמת אותה ולנתח אותה מהתבנית cDNA אותו.

MicroRNA איתור גידולים הערמונית ב כמותי בזמן אמת PCR (QPCR)

סרטון זה מדגים את העברת in vivo של מעכבי miRNA כסוכנים טיפוליים נגד צמיחת הגידול במודלים אורתוטופיים של עכברים. מתן תוך-גידולי של מעכבי miRNA סינתטיים או אנטגומירים מאפשר להם לקשור ולעכב miRNA אנדוגניים, ובכך לגרום להגברת הרגולציה של mRNA ולדיכוי צמיחת הגידול.

מידול טיפול תוך גידולי עם מעכבי miRNA: שיטה לניתוח ההשפעה של מעכבי miRNA על צמיחת הגידול במודל Murine

מולקולרי איתות דרך גם אסטרוגן ומייקרו RNA הם קריטיים בהתפתחות סרטן השד וצמיחה. אסטרוגן מפעיל את קולטני האסטרוגן, שהם גורמי שעתוק. גורמי שעתוק רבים יכולים לווסת את הביטוי של מיקרו RNA, והוא יכול להיות צדודית מיקרו RNA מוסדר אסטרוגן תוך שימוש בטכניקות שונות בקנה מידה גדולה.

פרופיל של מיקרו RNA המוסדר אסטרוגן בתאי סרטן השד

כאן אנו מציגים פרוטוקול לאיתור ביטוי miRNA בדגימות חולות סרטן השד באמצעות הכלאה של miRNA באתר.

ניתוח Clinicopathological ביטוי מירנה שד רקמות סרטן על ידי שימוש מירנה<em&gt; באתרו</em&gt; כלאה

דו ח זה מתאר שיטה מהירה ואמינה עבור אימות מטרות mRNA miRNAs הסלולר. משתמשת בשיטה biotinylated סינתטי מבוססת מגבר קדם חומצת גרעין נעול miRNA מחקה ללכידת המטרה mRNA. לאחר מכן, מצופים streptavidin beads מגנטי מועסקים הנפתח המטרה mRNA על כימות על ידי תגובת שרשרת של פולימראז qPCR.

הנועד מבוסס-ביוטין הנפתח Validate mRNA miRNAs מטרות של הסלולר

אנו מציגים פרוטוקול כדי להעריך את רמת הביטוי של מחזורי microRNA (miRNAs) בדגימות הפלסמה של חולי סרטן. בפרט, השתמשנו ערכת זמינים מסחרית עבור מחזור miRNA החילוץ, שעתוק במהופך. לבסוף, ניתחנו את פאנל של 24 miRNAs שנבחר באמצעות לוחות מותאמים אישית בדיקה מראש הבחין בזמן אמת.

זיהוי של לוח מותאם אישית MicroRNA במחזור בחולים עם סרטן המעי הגס גרורתי

פרוטוקול זה מתאר מבע ו אורתובנושא מודלים העכבר של בלוטת התריס האנושית tumorigenesis כפלטפורמה לבדוק טיפולים מעכבי מבוססי-אורנה. גישה זו אידיאלית כדי ללמוד את הפונקציה של RNAs ללא קידוד והפוטנציאל שלהם כמטרות טיפוליות חדשות.

ב Vivo עיכוב של מיקרואורנה כדי להקטין את צמיחת הגידול בעכברים

miRNA הרפוי יש פוטנציאל משמעותי בוויסות התקדמות סרטן. המודגמות כאן גישות אנליטיות משמשים לצורך זיהוי הפעילות של טיפול miRNA קומבינטורית להפסקת מחזור התא, אנגיוגנזה.

ניתוח של miRNA קומבינטורית טיפולים כדי להסדיר מחזור התא, אנגיוגנזה

המתואר כאן הוא פרוטוקול לאפיון מודולים של miRNAs ביולוגית מירסטים וההרכבה שלהם לתוך טרנסגנים קצרים, אשר מאפשר ביטוי יתר בו של טיפול גנטי יישומים.

אפיון של miRNAs הקשורים פונקציונלית ב גלינובלסטומה וההנדסה שלהם לאשכולות מלאכותיים עבור טיפול גנטי

הפרוטוקול מתאר בדיקת הכלאה אימונופלואורסצנטית טנדם עם רקמה משובצת פרפין קבועה בפורמלין כדי לזהות ולכמת מיקרו-RNA וחלבונים מרובים בו זמנית.

הגברה וזיהוי של מיקרו-RNA באמצעות הכלאה נעולה של חומצת גרעין-באתרה כשיטת זיהוי וכימות חדשה

למדו פרוטוקול חישובי לזיהוי ואימות מיקרוארנה וגנים יעד בתאי סרטן באמצעות שיבוט UTR-3', מבחן לוציפראז וניתוח עקומת מינון-תגובה. השיטה מאפשרת הבנת מנגנוני בקרת גנים ופוטנציאל טיפולי.

פרוטוקול מחוץ לגופית להערכת רמות מיקרוארנה, פונקציות, וגנים היעד הקשורים בתאי הגידול

גלה סרטונים נוספים