פרוטוקול מחוץ לגופית להערכת רמות מיקרוארנה, פונקציות, וגנים היעד הקשורים בתאי הגידול

פרוטוקול זה משתמש ב-החללית מבוסס בזמן אמת בתגובת שרשרת פולימראז (PCR), שיטת sulforhodamine B (SRB), 3 ' אזורים לא מתורגמים (3 ' UTR) שיבוט, ושיטת לוציפראז לאמת את הגנים היעד של miRNA עניין ולהבין את הפונקציות של Mirna.

כדי לגשת אינטראקציות יעד microRNA עצבי עם פונקציות MicroRNA הוא קריטי כדי להבין כיצד MicroRNAs לווסת תהליכים ביולוגיים שונים במצבים בריאים וחלים. פרוטוקול זה מתאר את ההתרבות באמצעות אסטרטגיה לזיהוי מטרות microRNA ואת microRNAs פונקציונלי כמו אימות של יעד ישיר של microRNAs הוא מאתגר. הפרוטוקול שלנו יכול לספק תובנות על הפונקציה של microRNAs בודדים ואת המשמעות של microRNA בטיפול בסרטן.

חישוב הריכוז המעכב החצי-מקסימלי הוא שיטה חשובה, לא רק למחקרי microRNA אלא להערכה יעילה של תרופות אחרות נגד סרטן. הפרוטוקול שלנו יהיה מועיל לחוקרים חדשים מאז שתיארנו את השיטה הבסיסית כדי להבין את רמת microRNAs בתא. כדי להתחיל את הפרוטוקול, ספור את התאים באמצעות מונה התאים.

צלחת התאים בצלחת 96 היטב. למחרת, להכין קבוצה של תערובות transfection כדי לשנות את התאים בכמה ריכוזים סופיים של חיקוי בקרת microRNA, ו microRNA-107 לחקות. מתוך מלאי של חיקוי בקרת מיקרו-רנ"א של 25 מיקרומולריים, או מיקרו-רנ"א-107 מחקים, מדללים ומוסיפים חיקוי בקרה או מיקרו-רנ"א-107 במדיה המופחתת בסרום יחד עם הריג'נט השקוף בצינורות מיקרוצנטריפוגה.

מערבבים בעדינות את תערובות האוליגו המכילות באמצעות מיקרופיגט. לאחר דגירה של 10 דקות במכסה המנוע של תא התרבות, מערבבים בעדינות את תערובות המכילות אוליגו שוב, ולאחר מכן מוסיפים 50 מיקרוליטרים של תערובות לתוך כל באר. שמור את התאים המרובים באינקובטור של תרבות התאים.

בזהירות שאפו את מדיית תרבות התאים בכל באר של הצלחת ומלאו מיד 100 מיקרוליטרים של 10% חומצה טריכלורואצטית, או TCA, בכל באר. שמור את הצלחת המכילה 10% TCA בארבע מעלות צלזיוס במשך שעה אחת. לאחר מכן, לשטוף את הצלחת מספר פעמים על ידי שקוע אותו לתוך אמבטיה עם מי ברז.

הסר מים עודפים מתוך בארות על ידי הקשה על הצלחת עד שלא נשארו מים, וייבש את הצלחת. פיפטה 50 מיקרוליטרים של 0.4% פתרון SRB לתוך כל באר כולל בארות ריקות. מנערים בעדינות את הצלחת עד שפתרון ה-SRB של 0.4% מכסה באופן שווה את תחתית בארות.

לאחר מכן, לה הדגירה את הצלחת במשך 40 עד 60 דקות. לאחר הדגירה, לשטוף את הצלחת עם 1% חומצה אצטית עד הצבע מאוגד נשטף לחלוטין. פיפטה 100 microliters של 10 מילימולר טריס בסיס פתרון לתוך בארות המתאימות, כולל בארות ריקות.

שמור את הצלחת על שייקר במשך 10 דקות. למדוד את הספיגה ב 492 ננומטר. חשב את אחוז הספיגה הממוצעת ואת סטיית התקן של כל קבוצה באמצעות ערכי ספיגה של מקשה SRB.

יבא את הנתונים הגולמיים כולל ריכוזי טיפול, ספיגה ממוצעת וסטיית תקן לתוכנה על-ידי יישור אנכי של הנתונים. לחצו על הכרטיסייה 'יצירת תרשים' ובחרו בפסי שגיאה פשוטים של פיזור. בחר עמודות גליון עבודה כערכי סימנים ולחץ על הבא.

בחלונית 'תבנית נתונים', בחרו זוגות X-Y ולחצו על הלחצן 'הבא'. בחרו בעמודות נתונים תואמות בחלונית 'בחירת נתונים'. לחץ על סיום כדי ליצור את ההתוויה.

לחץ פעמיים על ציר ה- X כדי לשנות את סוג קנה המידה בשינוי קנה המידה של הציר. שנה את סוג קנה המידה מליניארי ליומן רישום. שנה את מספר טווח ההתחלה והסיום ל- 0.01 ו- 200, בהתאמה.

לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על חלקת פיזור כלשהי, בחר התאמה לעקומה ולעבור אל קטגוריית המשנה המוגדרת על-ידי המשתמש. בחר עקומת תגובת מינון. לחץ על הלחצנים הבאים ולאחר מכן לחץ על סיום.

עבור אל כרטיסיית הדוח ולאחר מכן בדוק את הערכים n, k ו- R. הפעל את ה- PCR כמפורט בפרוטוקול הטקסט הנלווה. לאחר מכן לעבור לעיכול כפול על ידי שילוב תערובות התגובה, כולל אנזימי ההגבלה Exo1 ו Not1 אחד בצינור.

הדגירה את תערובות במשך שלוש עד ארבע שעות באמבט מים 37 מעלות צלזיוס. הפעל את המוצרים המתעכלים הכפולים על ג'ל 1%agarose. ואז לחתוך את הרצועות תחת אור UV.

לטהר את מוצרי PCR מתעכל פעמיים וקטורים luciferase מן הרצועות excised. המשך עם קשירה של מוצרי PCR לתוך וקטורים luciferase על ידי הכנת 20 microliters של תערובות תגובת קשירה כולל קשירה DNA. בקצרה צנטריפוגה הצינור במשך 10 עד 15 שניות.

הדגירה את הרצועה ב 16 מעלות צלזיוס לילה באמצעות מחזור תרמי. למחרת, לבצע טרנספורמציה על ידי הוספת תערובות קשירה לתוך הצינור המכיל תאים מוסמכים. יש להקיש בעדינות על הצינור ולשמור אותו על קרח למשך 20 דקות.

מעבירים במהירות ובעדינות את הצינור לבלוק חום ב-42 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות עד דקה. לאחר הלם חום, מניחים את הצינור על קרח במשך 20 דקות. להפיץ תאים מוכשרים על צלחת אגר LB.

לגדל תאים מוכשרים באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס לילה. למחרת, בחר מושבה בודדת והחזר את E.coli באחד מצינורות 8 הרצועות המכילים מים אולטרה-חמים, וחזור על צעד זה כדי למחזר את E.coli מארבע עד שמונה מושבות שנבחרו באקראי. העבר 25 מיקרוליטרים של השעיית E.coli לקבוצה אחרת של צינורות 8 רצועות.

בצע את PCR המושבה באמצעות ההשעיה E.coli. הכינו את התדהים של לוציפראז בצלחת של 24 בארות. הוסף אחד עד פעמיים עשר לארבעת התאים במדיה של 500 מיקרוליטר לתרבות תאים עבור כל באר.

לאחר הדגירה במהלך הלילה, יש להעיף 50 ננוגרם של וקטורים של לוציפראז לתאים עם חיקוי בקרה או חיקוי מיקרו-רנ"א ספציפי באמצעות רגנט טרנספרקט. למחרת, לשטוף את החלק הפנימי של הבאר פעמיים באמצעות מלוחים אגף פוספט. החל 200 microliters של ריאגנט תזה לתוך הבארים מספיק לבצע תזה התא לפני מדידת פעילות לוציפראז.

שמור על הצלחת רועדת לפחות 15 דקות. מעבירים חמישה עד 10 מיקרוליטרים של lysate התא לתוך הצינור החדש, ולהוסיף 100 microliters של reagent אחד ומיד לערבב את הפתרון על ידי צינור. לאחר מכן לקרוא את פעילות לוציפראז גחלילית באמצעות אילומינומטר במשך 10 עד 15 שניות.

מוסיפים 100 מיקרוליטרים של רגנט 2 באותו צינור ואז מערבבים על ידי צינור פעמיים. לבסוף, לקרוא את פעילות רנילה לוציפראז במשך 10 עד 15 שניות באמצעות illuminometer. RTPCR מציג הפחתה משמעותית של תאי מיקרו-רנ"א-107 ו-PANC-1 ו-CAPAN-1 בהשוואה לתאי HPNE.

רמות המיקרו-רנ"א-301 עלו באופן משמעותי בתאי PANC-1 ו-CAPAN-1, בהשוואה לתאי HPNE. בדיקה SRB במחקר זה מראה בבירור כי התפשטות של תאים PANC-1 ירד בעקבות microRNA-107 לחקות transfection. ההקרנה של 11 יעדים חזויים פוטנציאליים של microRNA-107 מראה בבירור כי רק גמא סינוקלין, או SNCG, וסת חיובי של צמיחת תאים סרטניים אינטראקציה ישירה עם microRNA-107 ו PANC-1 תאים, המציין כי microRNA-107 יכול לווסת לרעה את התפשטות תאי PANC-1 על ידי ויסות הביטוי SNCG.

בדיקות התפשטות תאים למבוגרים המשתמשות בישות המבוססת על טטרה הידרוליאום ו- CFSE ישימות כדי לסנן את ההשפעה של כגון חיקויי microRNA, בהתאם לסוגי התאים. בהתבסס על הפונקציה המותאמת באופן ניסיוני של microRNAs, נדרשת סקירה שיטתית של מסדי נתונים ותוכנית חיזוי יעדים כדי לצמצם את רשימת היעדים המועמדים לפני בדיקות Luciferase. להערכת יעילות שילוב של microRNAs עם תרופות נגד סרטן, זה יתרון לחשב ערכי IC מותאמים המבוססים על הפרוטוקול שלנו להערכת מדד שילוב.