בידוד וקוונפיקציה של וירוס Zika ממספר איברים בעכבר

בסרטון זה אנו מתארים קבוצה של הליכים שנועדו לחקור את ההשפעה של זיהום ויראלי ואת התגובה החיסונית וכתוצאה מכך באמצעות מודל מורין של זיהום זיקה. פרוטוקול זה הוא משמעותי משום שהוא מאפשר לנו לפתח הבנה מכנית של זיהום וחסינות על ידי זיהוי המידה שבה וירוס התפשט בכל הגוף, חוצה מחסומים פיזיים וגישה לרקמות. טכניקות אלה מאפשרות הבנה מפורטת של פתוגנזה ויראלית ומספקות את היכולת לנתח את מנגנון ההגנה המסופק על ידי חיסונים או טיפולים.

כאן אנו מדגימים שיטה זו באמצעות זיהום וירוס זיקה של עכברים, אבל שיטה זו יכולה להיות מיושמת על מגוון רחב של זיהומים ויראליים כולל flaviviruses אחרים כמו וירוס דנגי ו alphaviruses כמו וירוס Chikungunya. קצירת האיברים של מערכת העצבים המרכזית יכולה להיות מאתגרת, ולכן חשוב לאדם לתכנן ניסוי קטן, ויהיה מוכן לתרגל את הטכניקות מראש. פרוטוקול זה מאפשר ניתוח מהיר של התפשטות נגיפית במודלים של בעלי חיים קטנים עם היכולת לדמיין, ללכוד ולאחסן נתונים ניסיוניים.

חשוב להדגים באופן ויזואלי שיטה זו כדי לאפשר לנסיין להבין כיצד לקצור את איברי מערכת העצבים המרכזית. חשוב גם לראות את רמת הקונפדרציה התאית ואת עוצמת המוקד הנגיפי. כדי להתחיל, להשתמש במדפים כדי להסיר את פרווה של העכבר הנגוע.

לערוף את ראשו של העכבר עם מספריים, ואחריו הסרת הידיים והרגליים. כדי לקצור את המוח, השתמש במספריים משוננים של לה גראנג' כדי לחתוך את הגולגולת דרך מגנום הקם. לקלף את הגולגולת עם מדפים, ולסקופ את המוח עם מרית.

באמצעות מספריים קהה חזק, להסיר את העצם המקיפה את עמוד השדרה, ולאחר מכן לחתוך על פני עצם האגן כדי לחשוף את אבות החוליות ברמה המותנית. לאחר מכן, להסיר שריר רב ככל האפשר סביב עמוד השדרה. בזהירות, מניחים את הקצה משופע של המחט בתוך אבות החוליות, הימנעות לחץ מוגזם כדי למנוע את המחט הסגת גבול גוף החוליות.

החזק בחוזקה כדי להפעיל לחץ על גוף החוליות והמחט, ולחץ על בוכנה מזרק לגרש את חבל הטבור לתוך צלחת פטרי. מעבירים מיד את חוט השדרה בצינור המסוקרן, ומעבירים לאמבט הקרח היבש להומוגניזציה נוספת. להומוגניזציה, הוסיפו מיליליטר אחד של DMEM והומוגניזציה של הדגימה ב-BeadBeater.

לאחר הבטחת האיברים הם הומוגניים, דגימות צנטריפוגה ו aliquot על קרח ולאחסן מינוס 80 מעלות צלזיוס עד הצורך. ביום ההקפאה, הסר את הדגימות ההומוגניות מהמקפיא מינוס 80 מעלות צלזיוס, ואפשר להן להפשיר. עם הדגימות על הקרח, לדלל וירוס זיקה פי עשרה לתוך הטוב הראשון של צלחת הדילול ולהשתמש פיפטה רב ערוצי לעשות דילול סדרתי פי עשרה במורד הצלחת, שינוי טיפים בכל פעם.

על ידי הוספת 20 microliters של מדגם לתוך 180 microliters של מדיה צמיחה, לשנות טיפים פיפטה בין כל דילול. הכן את הלוח להרכיב את המוקד על ידי הסרת התקשורת מן צלחת שטוחה מוכנה 96 באר כיסוי virocells. כדי למנוע מהמונולייטר להתייבש, הוסיפו מיד 100 מיקרוליטרים של דילול הנגיף לכל באר בווירופלט.

השתמש באותה קבוצה של טיפים כדי להוסיף מהנמוך ביותר לריכוז הגבוה ביותר. צלחת סלע מצד לצד פעמיים עד ארבע פעמים ודגירה ב 37 מעלות צלזיוס ב 5% פחמן דו חמצני במשך שעה עד שעתיים. מחממים 2% מתיילקולוז לטמפרטורת החדר.

לאחר מכן, לדלל את הפתרון 2%methylcellulose במדיה צמיחה ביחס של כ 2-1. לאחר הדגירה, הוסיפו 125 מיקרוליטרים של מדיית הצמיחה של מתילקלולוז לכל באר של צלחות 96 בארות. דגירה שוב ב 37 מעלות צלזיוס ב 5%פחמן דו חמצני במשך 32 עד 40 שעות.

כדי לתקן את הווירוצלים, בארון biosafety להוסיף 50 microliters של 5% paraformaldehyde מעל החלק העליון של שכבת methylcellulose בכל באר של 96 צלחות היטב. דגירה במשך 60 דקות בטמפרטורת החדר. לחלופין, מכסים את הצלחות עם Parafilm וממקמים אותם בארבע מעלות צלזיוס לילה.

לאחר מכן, השתמש פיפטה כדי להסיר שכבת-על ומדיה את התאים לתוך מיכל חד פעמי בתוך ארון biosafety. יש לשטוף בעדינות עם 150 מיקרוליטרים של PBS ל-150 מיקרו-גרם להיטב. הסר PBS מהצלחות ולהסיר את הצלחת מן הארון biosafety.

חזור על לשטוף PBS פעמיים, ולאחר מכן להוסיף 150 microliters לבא פעם אחת FFA לשטוף חיץ ולהשאיר בטמפרטורת החדר במשך חמש עד 10 דקות כדי לחלחל את התאים הקבועים. לאחר מכן, השתמש בנוגדן זיקה ראשוני כדי לזהות זיהום. הכינו את הנוגדן העיקרי 4G2 בריכוז של מיקרוגרם אחד למיליליטר במאגר הכתמים של FFA.

פליק FFA לשטוף חיץ מן הצלחות, ולהוסיף 50 microliters של הנוגדן העיקרי במאגר הכתמים FFA לכל באר. לאחר מכן לאטום את הצלחות עם Parafilm, או סרט פלסטיק, ותידגר לילה בארבע מעלות צלזיוס. הכן את המשני ללכת נגד עכבר HRP שכותרתו נוגדן בריכוז של אחד עד 5, 000 במאגר כתמים FFA.

לאחר הסרת פתרון הנוגדנים, לשטוף תאים שלוש פעמים עם 150 microliters FFA לשטוף מאגר לגם. הסר את מאגר הכביסה על-ידי החלקה לתוך הכיור בכל פעם. הכתם את התאים בנוגדן המשני במאגר הכתמים של FFA ב-50 מיקרוליטרים ל-100 מיקרוליטרים ל-1 עד 2 שעות בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן, לשטוף תאים שלוש פעמים עם מאגר לשטוף FFA, שוב, הסרת מאגר לשטוף על ידי מהבהב לתוך הכיור בכל פעם. הוסף 50 מיקרוליטרים של מצע TrueBlue לתוך כל באר. המתן 2 עד 15 דקות עד שהנקודות מוגדרות במלואן עם רקע מינימלי.

לאחר כתמים גלויים, לשטוף בעדינות עם מים באמצעות יד כדי להגן על monolayer מ כוחו של המים זורמים. הקש על יבש על מגבות נייר. זמן קצר לאחר מכן, השתמש בטווח ניתוח כדי לספור באופן ידני את הנקודות בכל באר, או השתמש ב מונה ספוט אוטומטי.

בתוכנת ImmunoCapture, בחר דילול עם מוקדים מכובדים בקלות בין 20 ל -200 ל באר עבור כל מדגם וחשב טיטר ביחידות יוצרות מיקוד למילימטר באמצעות הממוצע של בארות כפולות. בניסוי זה, נטל ויראלי הוצג ברקמות ההיקפיות והמרכזיות של מערכת העצבים לאחר שעכברי Ifnar קיבלו נגיף זיקה תת עורית. מגבלת הזיהוי הייתה בין 100 ל-500 FFU לגרם, בהתבסס על איבר.

בעת ביצוע הבדיקה יוצרת המוקד, טעויות טכניות עלולות לגרום לתוצאות תת-אופטימליות. רעילות איברים, מונעת על ידי ריכוז גבוה של כבד, שינה את הרגישות של ההתרכך. כאשר הטיטר הוויראלי באיבר היה נמוך מהרעילות, ה-FFA לא יכול היה לתעד במדויק את הטיטרים הנגיפיים.

תאי כליות המחיש רעילות עם ריכוז איברים גבוה אבל היה להתגבר על ידי טיטר ויראלי בריכוזי איברים נמוכים. צינורות נמרצים או כביסה יכולים להסיר את המונו-קוטל, מה שמוביל לדיווח לא מדויק של נתונים אבודים על תוצאות טיטר. סיבים או שערות הקיימים בנייר סופג ספסל מעבדה, יכול לזהם בארות בודדות ולגרום לשגיאות משמעותיות אם באמצעות תוכנית ספירה אוטומטית.

צפיפות תאים היא בעיה נוספת, אשר יכולה להשפיע באופן דרמטי על ההצלחה של הסתערות יוצרת מיקוד. תאים בעוצמה של כ-60% בתחילת ההקדמה, בהשוואה לתאים מצופים ב-90%, הראו הבדל דרמטי המשפיע על ההקדמה המתגבשת. תכנון גודלו והיקפו של הניסוי כך שקציר האיברים יושלם ביעילות, הוא החלק החשוב ביותר בהליך, ואחריו התחלת הבדיקה יוצרת המיקוד עם תאים באיכות גבוהה.

הליך זה שימש לכימות וירוס עבור משפחות ויראליות מרובות. פרוטוקול זה יכול גם להיות מותאם למסך עבור תרכובות טיפוליות לכמת נטרול טיטרים נוגדנים. טכניקות אלה משמשות לכמת וירוס חי ויש לנקוט בצעדי בטיחות מתאימים בהתאם להנחיות המפורטות ב- BMBL.