Name: בניית פלסמידים CRISPR וזיהוי יעילות נוקאאוט בתאים יונקים באמצעות מערכת כתב לוציפראז כפול (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-05T12:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 51 s
Description: למדו לבנות פלסמידים CRISPR ולהעריך יעילות נוקאאוט בתאים יונקים באמצעות מערכת כתב לוציפראז כפול. שיטה זו מאפשרת ניתוח יעילות sgRNA ללא עריכת גנים אנדוגניים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

פרויקט זה מומן על ידי המחלקה הראשונה גראסלאנד מדע משמעת תוכנית של מחוז שאנדונג (סין), הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (31301936, 31572383), הקרן המיוחדת למחקר אגרו-מדעי באינטרס הציבורי (201403071), הערכת סיכונים לאומית לפרויקט מיוחד של איכות ובטיחות של מוצרי חלב (GJFP201800804) ופרויקטים של מדע וטכנולוגיה של פרנסה של אנשי צ'ינגדאאו (19-6-1-68-nsh, 14-2-3-45-nsh, 13-1-3-88-nsh).

1. עיצוב sgRNA אוליגונוקלאוטיד
<ol><li>עיצוב sgRNAs באמצעות כלים מקוונים כגון הכלי המקוון Cas-Designer (http://www.rgenome.net/cas-designer/). רצף PAM חשוב בהתבסס על Cas9 בשימוש. עבור xCas9, רצפי PAM הרלוונטיים הם NG והתוחלת הכלי המקוון Cas-Designer לשעבר יכול ליצור xCas9 sgRNAs רלוונטי.<ol>
<li>השתמש בכלי עיצוב sgRNA המקיפים אלגוריתמים לחיזוי יעד (http://www.broadinstitute.org/rnai/public/analysis-tools/sgrna-design)11. ציון של 0.2 או יותר הוא מועדף.</li>
	</ol>
</li>
	<li>בחר עד 3 מטרות לעריכת גנים עבור הקרנה אופטימלית (לדוגמה, T1, T2 ו- T3 תוכננו עבור כבשים DKK2 exon 1 פילוח גנים [טבלה 1]).</li>
</ol>2. שינוי אוליגונוקלאוטיד
<ol><li>כדי לשנות את sgRNA oligonucleotide, מחק את המוטיב הסמוך של הפרוטו-SPACER (PAM) של SgRNA, תוך שמירה על רצף הפרוטו-spacer (לדוגמה, רצף התחלתי עבור T1: TGCCTCTCTTCCTACTGGGGCCGC [20 nt]).</li>
	<li>הוסף את pentanucleotide CACCG ל 5'-סוף של האוליגו. הערה: עם קשירה לשלד pX330-xCas9, רצף זה יכיל את 3'-סוף של U6 מקדם מניע שעתוק sgRNA. המערך "CACC" מבטיח כי האולגו תואם עם overhangs של BbsI מעוכל pX330-xCas9 פלסמיד. הבסיס "G" הוא תנאי מוקדם של מקדמי RNA Polymerase III ומבטיח את האתחול היעיל של שעתוק sgRNA (למשל, צירוף מערך 5'-CACCG לפרוטו-spacer של T1, השגת T1-F: CACCGTGCCTCTCTCTCTGGGGCCGC [25 nt]). יעילות המחשוף של 21 nt gRNA שונה באופן משמעותי מזה של 20 nt gRNA1,12,13,14. מומלץ בדרך כלל להשתמש 20 nt עם 5'-G על ידי יצירת protospacer קצר יותר, אם זה לא אפשרי אז 21 nt עם נוסף 5'-G ניתן להשתמש.</li>
	<li>צור השלמה הפוכה (rc) של רצף הפרוטו-spacer. הערה: לדוגמה, rc של protospacer T1 הוא GCGGCCAGTAGGAGCAGGCAGGCA (20 nt).</li>
	<li>צרף AAAC ל-1.75 מ' של רצף הפרוטו-ספייסר של ה-RC. צרף C נוסף ל-3'-end של הפרוטו-spacer של ה-RC. הערה: רצף "AAAC" מבטיח כי oligonucleotide מתאים שיבוט לתוך pX330-xCas9 מעוכל BbsI. נוסף "C"על 3'-end חיוני עבור annealing עם "G" ייזום עבור שעתוק sgRNA המתואר לעיל (למשל, AAACGCGGCCAGTAGGAGAGAGCGCAC [25 nt] הוא רצף oligonucleotide הסופי עבור Protospacer T1 rc).</li>
	<li>תזמין את האויגונוקלאוטידים.</li>
</ol>3. אוליגונוקלאוטיד
<ol><li>דיללו אוליגונוקלאוטידים לריכוז סופי של 10 μM במים מזוקקים כפולים (ddH2O).</li>
	<li>מערבבים מוליגוניקלאוטידים קדמיים ואחורה בצינור PCR דק בקיר, המיצית יחס של 1:1 (לדוגמה, 20 μL כל אחד) מבלי להוסיף מאגר נוסף.</li>
	<li>מדגרים את התערובת ב-95°C למשך 5 דקות ולאחר מכן מגלגלים את הטמפרטורה ל-72 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. בצע עם תקופת קירור בטמפרטורת החדר (RT) המורכבת פשוט להסיר את המדגם ממכונה PCR ולמקם אותו ב RT. הערה: אין צורך phosphorylate תערובות oligonucleotide כדי להקל על הקשירה.</li>
</ol>4. עיכול וקטור SGRNA/CRISPR
<ol><li>לעכל 1 μg של pX330-xCas9 וקטור שנבחר עם BbsI (10 יחידות של אנזים לכל 1 μg של פלסמיד) עבור 2 שעות ב 37 ° C(איור 2). לנהל את העיכול של וקטור ביטוי pX330-xCas9 sgRNA בנפח כולל של 50 μL, המכיל 5 μL של מאגר עיכול 10x ומים מזוקקים כדי להשיג את הכרך הסופי.</li>
	<li>לטהר את הווקטור מעוכל על ידי חילוץ הלהקה 2% ג'ל agarose תחת 10 V / ס"מ ולאחר מכן לטהר באמצעות עמודה סיליקה באמצעות ערכת מיצוי ג'ל מסחרי.</li>
</ol>5. קשירה של sgRNA oligonucleotides ההבעה וקטור
<ol><li>מערבבים את ה-sgRNA oligonucleotides (5 μL של התערובת משלב 4) עם וקטור pX330-xCas9 מעוכל BbsI (מטוהר, 100 ng).</li>
	<li>להוסיף 1 μL של רצועה ו 1 μL של 10x מאגר רצועה.</li>
	<li>להוסיף מים מזוקקים עם נפח המתאים, עד 10 μL.</li>
	<li>דגירה לילה ב 4 מעלות צלזיוס.</li>
</ol>6. טרנספורמציה תא מוסמך
<ol><li>להוציא E. coli DH5α תאים מוסמכים מאחסון ב -80 ° C ולהפשיר אותו על קרח.</li>
	<li>להוסיף 5 μL של תערובת קשירה 50 μL של חיידקי E. coli DH5α מוסמכים ולשמור את התערובת על קרח במשך 30 דקות.</li>
	<li>מחממים את התערובת ב-42 מעלות צלזיוס ל-90 מעלות.</li>
	<li>הנח אותו על קרח במשך 2 דקות.</li>
	<li>לשחזר את התרבות על שייקר סיבובי ב 500 μL של LB מדיה עבור 1 שעה ב 37 ° C.</li>
	<li>צלחת 200 μL של התרבות על צלחת agarose התנגדות התנגדות אאמפיצילין LB דגירה אותו בן לילה ב 37 מעלות צלזיוס.</li>
</ol>7. זיהוי של פלסמידים רקומביננטיים הנכונים על ידי PCR
<ol><li>בחר 5 עד 10 מושבות חיידקים מצלחת LB ולהשתמש בכל אחד מהם כדי לחסן צינור אחד 1.5 מ"ל המכיל 1 מ"ל של LB מדיה עם 60 מ"ג / מ"ל אמפוצילין.</li>
	<li>דגירה את הצינורות על שייקר סיבובי במשך 2-3 שעות.</li>
	<li>לבצע זיהוי של פלסמידים רקומביננטיים נכונים באמצעות זוגות פריימר ספציפיים עבור sgRNA oligonucleotides [למשל, פריימר קדימה עבור T1 sgRNA ביטוי וקטור בנייה (T1-F): CACCGTGCCTCTCTCTCTACTGGCCGC, פריימר הפוך (BbsI-R): AAAGTCCCTATTATTGGCGTTAC, הפקת 287 bp amplicon(איור 3).<ol>
<li>מכינים את תערובת ה-PCR( שולחן 2).</li>
		<li>השתמש בתנאי הרכיבה הבאים של PCR: 95°C למשך 5 דקות לקדם-דה-נטורציה; 30 מחזורים של 95 °C עבור 30 s עבור denaturation, 60 °C עבור 30 s עבור annealing, ו 72 ° C עבור 30 s להארכה. לאחר השלמת 30 מחזורים, לבצע שלב הארכה סופי על ידי חימום במשך 5 דקות ב 72 °C.</li>
		<li>הפעל את מוצר PCR על ג'ל agarose 2% תחת 10 V /cm. רצועה בגודל הנכון [למשל, 287 bp] נחשבת חיובית.</li>
	</ol>
</li>
</ol>8. לאמת את הרצף של ביטוי sgRNA פלסמיד
<ol><li>אמת את רצף המושבות החיוביות PCR על-ידי רצף סנגר15 באמצעות פריימר BbsI-R ההפוך (ראה שלב 7.3). פריימר זה anneals באתר במורד הזרם של sgRNA אוליגו להוסיף. pX330-xCas9-T1 המביע רצף sgRNA המכיל protospacer TGCCTCTCTCTCTACTGGCCCCGCGG ו xCas9 נבנה.</li>
	<li>השתמש פריימר קדימה T1-F כדי רצף המושבות החיוביות. קדימה אחד לא יכול לתת מידע רצף מלא עבור האתר המקיף את אתר הכניסה של sgRNA אוליגו, כי 30-50 bp שבר בעקבות פריימר רצף לא ניתן לקרוא בדיוק.</li>
</ol>9. בניית וקטור עיתונאי לוציפראז כפול
<ol><li>לסנתז 300-500 bp שברי DNA המכילים את מטרות sgRNA subclone אותו לתוך וקטור כתב לוציפראז כפול באמצעות עיכול כפול [למשל, subclone 440 bp כבשה DKK2 exon1 שבר לתוך pSSA-כפול plasmid16,17 באמצעות עיכול כפול עם AscI ו SalI, וכתוצאה מכך pSSA-כפול-DKK2].</li>
	<li>לסנתז 300-500 bp שברי DNA המכילים את מטרות SGRNA. שים לב כי הרצפים של שברי ה-DNA חייבים להיות חלקים של רצפים גנומיים, אשר ניתן להשיג מאתר NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) או הפניות קשורות.</li>
	<li>בחר וקטור מתאים לכתב לוציפראז כפול כגון pSSA-Dual16,17 (או שניוקטורים המבטאים גחלילית לוציפראז ורנילה לוציפראז בהתאמה) ולאחר מכן לעכל את הווקטור הזה ואת שברי ה-DNA כאמור לעיל עם שני אנדונוקליאות כגון AscI ו SalI.</li>
	<li>לבסוף לתלות את שני השברים האלה עם T4 DNA Ligase, וכתוצאה מכך pSSA-כפול יעד. פרטים על עיכול כפול ורצועה מוצגים בטבלה 3 ובטבלה 4, בהתאמה. ראוי לציין כי וקטור הכתב צריך להיות מוגבר בזני חיידקים יציבים (כגון Top10), אשר מומלץ להיות תרבותי עם מהירות סיבוב נמוכה יותר (בדרך כלל לא יותר מ 200 סל"ד), לצורך הימנעות שילוב מחדש של ה-DNA.</li>
</ol>10. תעבירת תאים
<ol><li>לחלץ פלסמידים אנדוטוקסין ללא עבור וקטורים כאמור לעיל. להעריך את הטוהר והריכוז של פלסמידים באמצעות מכשירים מתאימים. ריכוז סופי של לא פחות מ 500 ng/μL ויחס טוהר של 1.7-1.9 בקליטה 260/280 נמיום (A260/A280) מומלצים עבור פלסמידים אלה.</li>
	<li>שיתוף תחינה קו תא מתאים כגון PIEC18 עם plasmids בפרופורציה שווה (למשל, pX330-xCas9-T1: pSSA-Dual-DKK2 =1:1, 0.5 μg plasmid עבור כל שכפול בעת שימוש 24 צלחת גם). השתמש בוקטור ריק כגון pX330-xCas9 כפקד שלילי.<ol>
<li>יום אחד לפני הטרנס-ת'ית, תאי צלחת בצלחת תרבות 24 באר בצפיפות של 2 x 105 תאים / גם. תאים יהיו מוכנים להעברה כאשר הם משיגים התכנסות של 60-80%.</li>
		<li>לפני נקודת הזמן transfection, להסיר את supernatant ככל האפשר בעדינות להוסיף 0.5 מ"ל של מדיה רעננה עבור כל באר.</li>
		<li>דילל את הטרנס-תירה מחדש במדיה DMEM ביחס של 1:25 ומערבבים היטב.</li>
		<li>להכין תערובת מאסטר של DNA על ידי דילול 0.5 μg של ה-DNA ב 25 μL של מדיה DMEM, ולאחר מכן להוסיף 1 μL של ריגנט P3000.</li>
		<li>הוסף DNA מדולל לכל שפופרת של reagent טרנסאפציה מדוללת (יחס 1:1).</li>
		<li>דגירה במשך 10-15 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>להוסיף 50 μL של תסביך ה-DNA-שומנים לתאים.</li>
		<li>תאי דגירה במשך 24 שעות ב 37 °C. לאחר מכן, נתח תאים טרנס-נגועים כמו בשלב 11.</li>
	</ol>
</li>
</ol>11. זיהוי לוציפראז כפול
<ol><li>הכינו כמות מספקת של מאגר הליזה הפסיבי (PLB) של 1x על ידי הוספת נפח אחד של 5x PLB ל-4 כרכים של מים מזוקקים ומערבבים היטב.</li>
	<li>מבחינה פסיבית של תאים המתובררים ב-24 צלחות תרבות.<ol>
<li>הסר את מדיום הצמיחה מהתאים התורבתים, והחיל בעדינות נפח מספיק של תמיסת מלח פוספט (PBS) כדי לשטוף את פני השטח של כלי התרבות. מערבבים את הכלי לזמן קצר כדי להסיר תאים מנותקים ויום שאריות צמיחה בינוני. הסר לחלוטין את פתרון שטיפה לפני החלת ריאגנט PLB.</li>
		<li>לחלק 100 μL של 1x PLB לתוך כל תרבות גם כדי לכסות לחלוטין את מונו-שכבת התא. תנו לוחיות התרבות לעמוד במשך 20 דקות.</li>
		<li>מעבירים את הליזייט לצינור או למבחנה להמשך טיפול או אחסון.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להכין את הרסיוג סיסאי luciferase (LAR) על ידי תחליף מחדש את הצוללת לוציפראז שסופקה ב 10 מ"ל של מאגר לוציפראז שסופק.</li>
	<li>להכין נפח הולם כדי לבצע את המספר הרצוי של כתב לוציפראז כפול (100 ריאגנט μL לכל כך). הוסף 1 נפח של 50x להפסיק את הצוללת 50 כרכים של מאגר עצירה בצינור פוליפרופילן זכוכית או סיליקון.</li>
	<li>כתב לוציפראז כפול (DLR) תסה<ol>
<li>התוכנית luminometers כדי לספק עיכוב קריאה מראש של 2 שניות, ואחריו תקופת מדידה של 10 שניות.</li>
		<li>Predispense 100 μL של לוציפראז אסאי רייגנט לתוך המספר המתאים של צינורות luminometer כדי להשלים את המספר הרצוי של DLR Assays.</li>
		<li>להעביר בזהירות עד 20 μL של תא lysate לתוך צינור luminometer המכיל LAR; מערבבים על-ידי התפתלות 2 או 3 פעמים. מניחים את הצינור במד ההמום ויזמו קריאה.</li>
		<li>הסר את הצינור לדוגמה מן luminometer, להוסיף 100 μL של עצירת reagent ומערבולת בקצרה כדי לערבב. החלף את הדגימה בממד הלומינומטר, והחל בקריאה.</li>
		<li>להקליט את פעילות renilla luciferase מנורמל לפעילות לוציפראז גחלילית, כל כך הדדי של היחס המוצג על המסך.</li>
		<li>זרוק את צינור התגובה, והמשך למאסאה הבאה.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+surrogate+reporter+system+for+multiplexable+evaluation+of+CRISPR%2FCas9+in+targeted+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A surrogate reporter system for multiplexable evaluation of CRISPR/Cas9 in targeted mutagenesis.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1042(2018).</li>
<li>Nageshwaran, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+Guide+RNA+Cloning+for+Mammalian+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">CRISPR Guide RNA Cloning for Mammalian Systems.</a> Journal of Visualized Experiments. (140), (2018).</li>
<li>Dang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+sgRNA+structure+to+improve+CRISPR-Cas9+knockout+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Optimizing sgRNA structure to improve CRISPR-Cas9 knockout efficiency.</a> Genome Biology. 16, 280(2015).</li>
<li>Doench, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+sgRNA+design+to+maximize+activity+and+minimize+off-target+effects+of+CRISPR-Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9.</a> Nature Biotechnology. 34 (2), 184-191 (2016).</li>
<li>Moreno-Mateos, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPRscan%3A+designing+highly+efficient+sgRNAs+for+CRISPR-Cas9+targeting+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">CRISPRscan: designing highly efficient sgRNAs for CRISPR-Cas9 targeting in vivo.</a> Nature Methods. 12 (10), 982-988 (2015).</li>
<li>Joung, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+CRISPR-Cas9+knockout+and+transcriptional+activation+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout and transcriptional activation screening.</a> Nature Protocols. 12 (4), 828-863 (2017).</li>
<li>Yang, L., Yang, J. L., Byrne, S., Pan, J., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-Directed+Genome+Editing+of+Cultured+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-Directed Genome Editing of Cultured Cells.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 107, 1-17 (2014).</li>
<li>Yang, L., Mali, P., Kim-Kiselak, C., Church, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas-mediated+targeted+genome+editing+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas-mediated targeted genome editing in human cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1114, 245-267 (2014).</li>
<li>Vidigal, J. A., Ventura, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+efficient+one-step+generation+of+paired+gRNA+CRISPR-Cas9+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Rapid and efficient one-step generation of paired gRNA CRISPR-Cas9 libraries.</a> Nature Communications. 6, 8083(2015).</li>
<li>Mazon, G., Mimitou, E. P., Symington, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SnapShot%3A+Homologous+recombination+in+DNA+double-strand+break+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SnapShot: Homologous recombination in DNA double-strand break repair.</a> Cell. 142 (4), 646(2010).</li>
<li>Doench, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+design+of+highly+active+sgRNAs+for+CRISPR-Cas9-mediated+gene+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation.</a> Nature Biotechnology. 32 (12), 1262-1267 (2014).</li>
<li>Lee, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+of+CRISPR-Cas9+to+increase+its+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Directed evolution of CRISPR-Cas9 to increase its specificity.</a> Nature Communications. 9 (1), 3048(2018).</li>
<li>Sung, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+gene+knockout+in+mice+and+zebrafish+with+RNA-guided+endonucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Highly efficient gene knockout in mice and zebrafish with RNA-guided endonucleases.</a> Genome Research. 24 (1), 125-131 (2014).</li>
<li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double+nicking+by+RNA-guided+CRISPR+Cas9+for+enhanced+genome+editing+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity.</a> Cell. 154 (6), 1380-1389 (2013).</li>
<li>Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+sequencing+with+chain-terminating+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">DNA sequencing with chain-terminating inhibitors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (12), 5463-5467 (1977).</li>
<li>Ruan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+CRISPR%2FCas9-mediated+transgene+knockin+at+the+H11+locus+in+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated transgene knockin at the H11 locus in pigs.</a> Scientific Reports. 5, 14253(2015).</li>
<li>An plasmid with double fluorescent groups and its application as standard substance. China patent. , 201210509946.1 (2012).</li>
<li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+porcine+p65+subunit+of+NF-kappaB+and+its+association+with+virus+antibody+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Immunology%22%5BJournal%5D)">Characterization of the porcine p65 subunit of NF-kappaB and its association with virus antibody levels.</a> Molecular Immunology. 48 (6-7), 914-923 (2011).</li>
<li>A pair of sgRNAs targeting porcine RELA gene. China patent. , 201510398717.0 (2015).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

הליכי השיבוט הווקטור sgRNA שתיארנו כאן מקל על ייצור יעיל של sgRNAs, עם רוב העלויות הנגזרות הזמנת oligonucleotide ושורק וקטור. בעוד השיטה המתוארת נועדה לאפשר למשתמשים ליצור sgRNAs לשימוש עם CRISPR/Cas9, הפרוטוקול יכול בקלות להיות מותאם לשימוש עם Cas9 orthologues או אנדונוקלאות מונחה RNA אחרות כגון Cpf1, הצגת שינויים קלים עמוד השדרה הווקטורית רצפי תליית מוליגוניקלאוטיד.
הפרוטוקול המתואר לעיל יספק יעד sgRNA מועדף בתוך 10 ימים כאשר מתחיל עם oligonucleotides מעוצב כראוי. זה כולל את העיצוב sgRNA (1 ...

SGRNAs CRISPR מהווים רצף של 20 נוקלאוטידים (הפרוטו-ספייסר), המשלים את רצף היעד הגנומי1,2. למרות יעילות רבה, היכולת של מערכת CRISPR/Cas לשנות אתר גנומי נתון דורשת יצירת וקטור הנושא sgRNA יעיל ייחודי לאתרי היעד2. מאמר זה מתאר את השלבים המרכזיים בדור של וקטור sgRNA זה.
לעריכת גנום מוצלחת באמצעות מערכת CRISPR/Cas, השימוש sgRNAs יעיל מאוד הוא תנאימוקדםחיוני 3,4,5. מאז גרעין מהונדס המשמש בעריכת הגנום להפגין יעילות מגוונת ב lociממוקד שונים 1, בחירה מראש של מטרות sgRNA מועמד יש צורך כדי לחסוך זמןומאמץ 6,7,8,9. מערכת כתב לוציפראז כפולה פותחה כדי להעריך יעילות נוקאאוט על ידי בדיקת תיקון לשבור גדיל כפול באמצעות גדיל יחיד annealing3,10. כאן אנו משתמשים במערכת כתבים זו כדי לבחור יעד CRISPR sgRNA מועדף ממועמדים שונים sgRNA וקטורים המיועדים לעריכת גנים ספציפיים. הפרוטוקול שצוין כאן יושם במעבדות הקבוצה ושיתוף הפעולה שלנו בשנים האחרונות כדי ליצור ולהעריך את CRISPR sgRNAs.
הפרוטוקול הבא מסכם כיצד לעצב SgRNA מתאים באמצעות תוכנת רשת. לאחר הבחירה sgRNAs המתאימים, אנו מתארים את השלבים השונים כדי להשיג את האוליגונוקלאוטידים הנדרשים, כמו גם את הגישה להכנסת oligonucleotides לזווג לתוך וקטור הביטוי pX330-xCas9. כמו כן, אנו מציגים שיטה להרכבת וקטורים כתב sgRNA-הבעת וגם וקטורים כתב לוציפראז כפול בהתבסס על הקשירה של רצפים אלה לתוך וקטור ביטוי ים-10 (שלבים 2-10, איור 1A). לבסוף אנו מתארים כיצד לנתח את יעילות חיתוך ה-DNA עבור כל sgRNAs (שלבים 11-12).

<table><tbody><tr><td>דור חדש של מכשיר PCR שיפוע מסך מגע מלא</td><td>LongGene</td><td>A200</td><td>הגברת גן יעד</td></tr><tr><td>אנזימי הגבלת AscI</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>R0558V</td><td>חיתוך וקטורי מטרה</td></tr><tr><td>אנזים הגבלה BbsI ניו</td><td>אינגלנד Biolabs</td><td>R0539S</td><td>חיתוך וקטורי מטרה</td></tr><tr><td>שולחן עבודה נקי</td><td>AIRTECH</td><td>SW-CJ-2FD/VS-1300L-U</td><td>מכשיר טיהור חלקי בצורת זרימה למינרית אנכית, היוצרת סביבת אוויר נקי מקומית גבוהה</td></tr><tr><td>DH5 ואלפא; תאים מוכשרים</td><td>TaKaRa</td><td>K613</td><td>טרנספורמציה וקטורית פלסמיד</td></tr><tr><td>Dual-Luciferas Reporter Assay System</td><td>Promega</td><td>E1910</td><td>Dual-luciferas מדווח מבחן</td></tr><tr><td>אמבט מים תרמוסטטי חשמלי</td><td>Sanfa Scientific Instruments</td><td>DK-S24</td><td>מגיב חימום על ידי טמפרטורה קבועה באמבט מים</td></tr><tr><td>אלקטרופורזה</td><td>בייג'ינג Liuyi ביוטכנולוגיה ושות', בע"מ</td><td>DYY-6C</td><td>בקרת מתח, זרם וכו'.</td></tr><tr><td>Eppendorf Reference 2</td><td>Eppendorf China Ltd.</td><td>התייחסות 2</td><td>צייר והעביר במדויק עקבות של</td></tr><tr><td>מנתח הדמיית ג'ל</td> נוזלי <td>Beijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd.</td><td>WD-9413B</td><td>לניתוח תמונות ג'ל אלקטרופורזה</td></tr><tr><td>GloMax 20/20 Luminometer</td><td>Promega</td><td>E5311</td><td>זיהוי פעילות לוציפראז כפולה במהירות</td></tr><tr><td>גבוהה</td><td>BMH</td><td>sigma 3K15</td><td>מיצוי וטיהור חומצות גרעין</td></tr><tr><td>חממה ביוכימית אינטליגנטית</td><td>Sanfa Scientific Instruments</td><td>SHP-160</td><td>לספק סביבת טמפרטורה מתאימה לניסוי עיכול האנזים</td></tr><tr><td>LB Broth Agar</td><td>Sangon Biotech</td><td>A507003-0250</td><td>לגידול E.coli</td></tr><tr><td>Lipofectamine 3000 Transfection Reagent Kit</td><td>Thermo Fisher</td><td>L3000015</td><td>DNA Transfection</td></tr><tr><td>SalI אנזימי הגבלה ניו</td><td>אינגלנד Biolabs</td><td>R3138V</td><td>חיתוך וקטורי יעד</td></tr><tr><td>SanPrep עמודה DNA ג'ל ערכת מיצוי</td><td>Sangon Biotech</td><td>B518131-0050</td><td>מיחזור שברי DNA</td></tr><tr><td>ערכת SanPrep Column Plasmid Mini-Preps</td><td>Sangon Biotech</td><td>B518191-0100</td><td>מיצוי DNA פלסמיד</td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>M0202V</td><td>קישור שבר DNA</td></tr><tr><td>TaKaRa MiniBEST ערכת טיהור שברי DNA Ver.4.0</td><td>TaKaRa</td><td>9761</td><td>טיהור DNA</td></tr><tr><td>אנכי מעקר קיטור בלחץ</td><td>JIBIMED</td><td>LS-50LD</td><td>טמפרטורה גבוהה וחיטוי להרוג חיידקים, פטריות ומיקרואורגניזמים אחרים בציוד מעבדה</td></tr><tr><td>תרמוסטט אמבט מים</td><td>Changzhou Guoyu Instrument Manufacturing Co., Ltd.</td><td>SHZ-82</td><td>תן לחיידקים להמשיך לרעוד, וזה טוב למגע עם אוויר.</td></tr></tbody></table>

בניית פלסמידים crispr וזיהוי יעילות נוקאאוט בתאים יונקים באמצעות מערכת כתב לוציפראז כפול

Construction of CRISPR Plasmids and Detection of Knockout Efficiency in Mammalian Cells through a Dual Luciferase Reporter System

למרות יעיל מאוד, שינוי של אתר גנומי על ידי אנזים CRISPR דורש הדור של sgRNA ייחודי לאתרי היעד מראש. עבודה זו מתארת את הצעדים המרכזיים המובילים לבניית וקטורים SGRNA יעילים באמצעות אסטרטגיה המאפשרת זיהוי יעיל של המושבות החיוביות על ידי PCR לפני רצף DNA. מאחר שעריכת גנום יעילה באמצעות מערכת CRISPR דורשת SGRNA יעילה ביותר, יש צורך בבחירה מוקדמת של יעדי SGRNA של מועמדים כדי לחסוך זמן ומאמץ. מערכת כתב לוציפראז כפולה פותחה כדי להעריך יעילות נוקאאוט על ידי בדיקת תיקון לשבור גדיל כפול באמצעות חיתוק גדיל יחיד. כאן, אנו משתמשים במערכת הכתבים הזו כדי לאסוף את היעד המועדף של xCas9/sgRNA מקטורי SGRNA מועמדים לעריכת גנים ספציפיים. הפרוטוקול המתואר יספק וקטור אנזים sgRNA/CRISPR מועדף בתוך 10 ימים (החל מאוליגונוקלאוטידים מעוצבים כראוי).

השיטות המתוארות בפרוטוקול זה הן לבניית וקטורים ביטוי sgRNA ו xCas9 ולאחר מכן עבור הקרנת אופטימיזציה של sgRNA אוליגוס עם יעילות מיקוד גנים גבוהה יחסית. כאן אנו מציגים דוגמה מייצגת של 3 מטרות sgRNA לכבשים DKK2 exon 1. SgRNA ו xCas9 לבטא וקטורים ניתן לבנות על ידי נטיעת עמוד השדרה וקטור (איור 2) ואחריו רצועה אותו בסדרה של שברי DNA קצר גדיל כפול באמצעות זוגות אוליגו annealing. המושבות החיוביות ניתן לזהות באמצעות זוגות פריימר ספציפיים מונחה PCR(איור 3). שבר D...

כאן, אנו מציגים פרוטוקול המתאר שיטה יעילה עבור הדור היעיל של פלסמידים המבטאים הן את אנזים CRISPR והן את RNA מדריך יחיד (sgRNAs). שיתוף פעולה של תאים יונקים עם וקטור sgRNA / CRISPR זה וקטור כתב לוציפראז כפול הבוחן תיקון הפסקה דו-גדילי מאפשר הערכה של יעילות נוקאאוט.

בניית פלסמידים CRISPR וזיהוי יעילות נוקאאוט בתאים יונקים באמצעות מערכת כתב לוציפראז כפול

Although highly efficient, modification of a genomic site by the CRISPR enzyme requires the generation of a sgRNA unique to the target site(s) beforehand. ...

פרוטוקול זה מתאר את שלבי המפתח בהידור ואופטימיזציה של וקטורים יעילים של sgRNA. ההקדמה שלנו של מועמד sgRNA מטרות זמן יחסי והסקת מסקנות. היתרון העיקרי של פרוטוקול זה הוא שהוא מאפשר לנתח את רשמי קידוד ה- DNA עבור כל אחד מה- sgRNAs מבלי לערוך גנים אנדוגניים.ניתן להחיל שיטת בחירה מוקדמת זו גם על אמצעים אחרים לעריכת גנים באמצעות הפסקות דו-לוגיות. התחל על ידי דילול oligonucleotides lyophilized לריכוז סופי של 10 micromolar במים מזוקקים כפולים. ערבבו קדימה ואחורי אוליגונוקלאוטידים בצינור PCR דק-קירות ביחס של אחד לאחד מבלי להוסיף מאגר נוסף.להחגירה את התערובת ב 95 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות, ולאחר מכן רמפה למטה את הטמפרטורה ל 72 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. הסר את תערובת oligonucleotide ממכונת PCR ולאפשר לו להתקרר בטמפרטורת החדר. לעיכול וקטור pX330-xCas9, עם Bbs1, שלבו את מאגר הווקטור, האנזים והעיכול בנפח של 50 מיקרוליטר והדקירה את התגובה ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים.לאחר ביצוע טרנספורמציה התא, לבחור חמש עד 10 מושבות חיידקים מהצלחת LB ולהשתמש בכל אחד מהם כדי לחסן מיליליטר אחד של מדיה LB עם 60 מיליגרם אמפיצילין בצינור 1.5 מיליליטר. ואז להדרגר את הצינורות על שייקר סיבובי במשך שעתיים עד שלוש שעות. בצע PCR כדי לסנן עבור פלסמידים רקומביננטי כמתואר בכתב יד טקסט, ולאחר מכן להפעיל את המוצרים על 2%Agarose ג'ל תחת 10 וולט אחוזים.לאחר זיהוי הפלסמידים החיוביים, השתמש בהם, יחד עם וקטור כתב, כדי לבצע חילוף שותף של קו תא מתאים. כדי ללת את התאים, הסר את מדיום הצמיחה מהתאים התרבותיים. בעדינות לשטוף את פני השטח של כלי התרבות עם PBS ולחלק 100 microliters של PLB לתוך כל תרבות היטב כדי לכסות לחלוטין את שכבת מונו התא.תן את הצלחת דגירה בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות, ולאחר מכן להעביר את lysate לצינור או בקבוקון להמשך טיפול או אחסון. כדי לבצע את בדיקת הלוציפראז הכפולה, תכנת את הזוהר לספק השהיה של שתי שניות לפני הקריאה ואחריה תקופת מדידה של 10 שניות. לאחר מכן, מחלקים 100 מיקרוליטרים של לוציפראז מסאי רגנט למספר המתאים של צינורות לומינומטר.בזהירות להוסיף 20 microliters של lysate התא לתוך צינור זוהר ומערבבים על ידי צינור פעמיים או שלוש פעמים. מניחים את הצינור בלומינומטר ויוזם את הקריאה. הסר את צינור הדגימה מהלומינומטר.מוסיפים 100 מיקרוליטרים של עוצרי ים ומערבולת לזמן קצר כדי לערבב. מחזירים את הדגימה ללומינומטר ויוזם קריאה. הקלט את פעילות רנילה לוציפראז, מנורמלת לפעילות פיירפלי לוציפראז, במיוחד הגומלין של היחס המוצג על המסך.השלך את צינור התגובה בסיום. שיטה זו שימשה ליצירת שלושה וקטורים sgRNA עבור כבשים DKK2 אקסון 1. sgRNA ו- xCas9 וקטורים מבטאים נבנו על ידי עיכול מראש של עמוד השדרה הווקטור ואחריו קשירה בסדרה של שברי DNA קצרים, כפולי גדילים באמצעות זוגות אוליגו חישול.שבע מושבות חיידקים הוקרנו עם PCR מונחה זוג פריימר ספציפי ואת המושבות החיוביות זוהו. יכולות מיקוד הגנים של pX330-xCas9 T1, T2 ו- T3 זוהו בו-זמנית עם המוצג הכפול של לוציפראז. וקטור SgRNA האחרון הציג את אות הגילוי הגבוה ביותר ולאחר מכן שימש למחקר עריכת גנים כבשים.בעקבות פרוטוקול זה, ניתן לבצע בדיקות T7EI או מוצג ריבונוקלאז. אמצעים נוספים אלה מעניקים רשמים מדויקים יותר של עריכת גנים אנדוגניים.

construction-crispr-plasmids-detection-knockout-efficiency-mammalian

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

שעוני יממה לתפקד בתוך תאים בודדים, כלומר, הם תאים אוטונומיים. כאן, אנו מתארים שיטות ליצירת מודלי שעון תא אוטונומי באמצעות טכנולוגיה לא פולשנית, לוציפראז מבוסס זמן אמת פליטת אור. תאי Reporter מספקים מערכות צייתניות, פונקציונליות מודל ללימוד ביולוגית יממה.

ניטור מקצבי Cell-אוטונומי יממת שעון של ביטוי גנים באמצעות כתבי פליטת האור לוציפראז

שיטה של ​​מולקולות דנ"א בודדות התבוננות בתאים חיים מתוארת. הטכניקה מתבססת על הכריכה של חלבון מתויג fluorescently lac repressor לאתרי קישור מהונדס לתוך הדנ"א של עניין. שיטה זו יכולה להיות מותאמת למעקב DNAs רקומביננטי רב בתאי חיים לאורך זמן.

ניטור כפול פלסמיד בתאי יונקים חיים דרך מספר דורות על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי

אנו מציגים שיטת סינון מהירה וזולה לזיהוי רגולטורים תעתיק באמצעות transfections רובוטית תפוקה גבוהה וassay בלוציפראז כפול זוהר תוצרת בית. פרוטוקול זה במהירות מייצר נתונים פונקציונליים Side-by-צד ישיר לאלפי גנים והוא שינוי בקלות למקד כל גן של עניין.

הקרנה פונקציונלית תפוקה גבוהה באמצעות assay בלוציפראז Dual-זוהר תוצרת בית

השגת הבנה ברמת מערכות של תהליכים תאיים היא מטרה של ביולוגיה של התא המודרנית. אנו מתארים כאן אסטרטגיות לכתבי לוציפראז ריבוב של תפקוד תאי שונים נקודות קצה לחקור את תפקוד גן באמצעות הגנום בקנה מידה ספריות RNAi.

פלטפורמת הקרנה מבוססת לוציפראז Multiplexed לחקירת מלחמה בסרטן הקשורים להעברת אותות בתאים בתרבית

CRISPR/Cas9 היא מערכת חזקה ליצירת שיבוש של גנים ואלמנטים גנטיים. כאן אנו מתארים פרוטוקול ליצירה יעילה של מחיקות גנומיות בשורות תאים של יונקים באמצעות CRISPR/Cas9.

דור של מחיקות הגנומי בשורות תאים יונקים באמצעות CRISPR / Cas9

ההתקדמות האחרונות ביכולת לתמרן גנטית קווי תאים סומטיים להחזיק פוטנציאל גדול עבור מחקר בסיסי ויישומי. כאן, אנו מציגים שתי גישות עבור CRISPR / Cas9 שנוצר נוקאאוט הייצור והקרנה שורות תאים יונקים, עם וללא שימוש סמנים לבחירה.

הבחירה תלויה עצמאית הדור של CRISPR / Cas9 בתיווך גין Knockouts בתאי יונקים

CRISPR-Cas היא טכנולוגיה רבת עוצמה להנדס הגנום מורכבים של צמחים ובעלי חיים. כאן, אנחנו פירוט נוהל לעריכת ביעילות הגנום האנושי באמצעות endonucleases רשויות אישורים שונים. אנחנו מדגישים שיקולים חשובים ופרמטרים עיצוב כדי למטב את יעילות העריכה.

הגנום עריכה בשורות תאים בתרבית של שימוש CRISPR-Cas

CRISPR-Cas9 הטכנולוגיה מספקת שיטה יעילה בדיוק לערוך את הגנום היונקים בסוג תא כלשהו ומייצג את האמצעים הרומן לבצע מסכי גנטי רחב הגנום. פרוטוקול מפורט לדון בצעדים הנדרשים עבור ביצועים מוצלחים של מסכי CRISPR-Cas9 הגנום הרחב מסופק כאן.

מסכי גנטי מבוססי CRISPR במאגר תאים ממיונקים

פרוטוקול זה משתמש בכתבים פלואורסצנטיים ובמיון תאים כדי לפשט ניסויי נוק-אין בקווי תא מקרופאג' ו- T. שני פלסמידים משמשים לניסויים פשוטים אלה, כלומר CRISPR/Cas9- ו- DsRed2-מבטא פלסמיד ותורם רקומבינציה הומולוגי המבטא את EBFP2, המשולב לצמיתות בלוקוס Rosa26 בתאי מערכת החיסון.

נוק-אין של ג'ין על-ידי CRISPR/Cas9 ומיון תאים בקווי תא מקרופאג' ו-T

מחקר זה מציג מערכת CRISPRi כפולה המכוונת ל-RNA ארוכים שאינם מקודדים בתאי מלנומה. הוא מאפשר הפלת גנים קומבינטוריים ובדיקה קטלנית סינתטית, זיהוי אינטראקציות lncRNA ספציפיות לסרטן לאסטרטגיות טיפוליות פוטנציאליות.

אסטרטגיית הפרעות CRISPR כפולות למיקוד אינטראקציות קטלניות סינתטיות בין RNA לא מקודדים בתאים סרטניים

מחקר זה מתאר שיטה לניסויים בתפוקה גבוהה באמצעות מערך LED מודפס בתלת מימד כדי לייעל את ביטוי הגנים המושרה באור בתאי HEK293T.

אופטימיזציה מהירה של מערכת השראת אור לשליטה בביטוי גנים של יונקים

למדו לבנות פלסמידים CRISPR ולהעריך יעילות נוקאאוט בתאים יונקים באמצעות מערכת כתב לוציפראז כפול. שיטה זו מאפשרת ניתוח יעילות sgRNA ללא עריכת גנים אנדוגניים.

בניית פלסמידים CRISPR וזיהוי יעילות נוקאאוט בתאים יונקים באמצעות מערכת כתב לוציפראז כפול

גלה סרטונים נוספים