בניית פלסמידים CRISPR וזיהוי יעילות נוקאאוט בתאים יונקים באמצעות מערכת כתב לוציפראז כפול

פרוטוקול זה מתאר את שלבי המפתח בהידור ואופטימיזציה של וקטורים יעילים של sgRNA. ההקדמה שלנו של מועמד sgRNA מטרות זמן יחסי והסקת מסקנות. היתרון העיקרי של פרוטוקול זה הוא שהוא מאפשר לנתח את רשמי קידוד ה- DNA עבור כל אחד מה- sgRNAs מבלי לערוך גנים אנדוגניים.

ניתן להחיל שיטת בחירה מוקדמת זו גם על אמצעים אחרים לעריכת גנים באמצעות הפסקות דו-לוגיות. התחל על ידי דילול oligonucleotides lyophilized לריכוז סופי של 10 micromolar במים מזוקקים כפולים. ערבבו קדימה ואחורי אוליגונוקלאוטידים בצינור PCR דק-קירות ביחס של אחד לאחד מבלי להוסיף מאגר נוסף.

להחגירה את התערובת ב 95 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות, ולאחר מכן רמפה למטה את הטמפרטורה ל 72 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. הסר את תערובת oligonucleotide ממכונת PCR ולאפשר לו להתקרר בטמפרטורת החדר. לעיכול וקטור pX330-xCas9, עם Bbs1, שלבו את מאגר הווקטור, האנזים והעיכול בנפח של 50 מיקרוליטר והדקירה את התגובה ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים.

לאחר ביצוע טרנספורמציה התא, לבחור חמש עד 10 מושבות חיידקים מהצלחת LB ולהשתמש בכל אחד מהם כדי לחסן מיליליטר אחד של מדיה LB עם 60 מיליגרם אמפיצילין בצינור 1.5 מיליליטר. ואז להדרגר את הצינורות על שייקר סיבובי במשך שעתיים עד שלוש שעות. בצע PCR כדי לסנן עבור פלסמידים רקומביננטי כמתואר בכתב יד טקסט, ולאחר מכן להפעיל את המוצרים על 2%Agarose ג'ל תחת 10 וולט אחוזים.

לאחר זיהוי הפלסמידים החיוביים, השתמש בהם, יחד עם וקטור כתב, כדי לבצע חילוף שותף של קו תא מתאים. כדי ללת את התאים, הסר את מדיום הצמיחה מהתאים התרבותיים. בעדינות לשטוף את פני השטח של כלי התרבות עם PBS ולחלק 100 microliters של PLB לתוך כל תרבות היטב כדי לכסות לחלוטין את שכבת מונו התא.

תן את הצלחת דגירה בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות, ולאחר מכן להעביר את lysate לצינור או בקבוקון להמשך טיפול או אחסון. כדי לבצע את בדיקת הלוציפראז הכפולה, תכנת את הזוהר לספק השהיה של שתי שניות לפני הקריאה ואחריה תקופת מדידה של 10 שניות. לאחר מכן, מחלקים 100 מיקרוליטרים של לוציפראז מסאי רגנט למספר המתאים של צינורות לומינומטר.

בזהירות להוסיף 20 microliters של lysate התא לתוך צינור זוהר ומערבבים על ידי צינור פעמיים או שלוש פעמים. מניחים את הצינור בלומינומטר ויוזם את הקריאה. הסר את צינור הדגימה מהלומינומטר.

מוסיפים 100 מיקרוליטרים של עוצרי ים ומערבולת לזמן קצר כדי לערבב. מחזירים את הדגימה ללומינומטר ויוזם קריאה. הקלט את פעילות רנילה לוציפראז, מנורמלת לפעילות פיירפלי לוציפראז, במיוחד הגומלין של היחס המוצג על המסך.

השלך את צינור התגובה בסיום. שיטה זו שימשה ליצירת שלושה וקטורים sgRNA עבור כבשים DKK2 אקסון 1. sgRNA ו- xCas9 וקטורים מבטאים נבנו על ידי עיכול מראש של עמוד השדרה הווקטור ואחריו קשירה בסדרה של שברי DNA קצרים, כפולי גדילים באמצעות זוגות אוליגו חישול.

שבע מושבות חיידקים הוקרנו עם PCR מונחה זוג פריימר ספציפי ואת המושבות החיוביות זוהו. יכולות מיקוד הגנים של pX330-xCas9 T1, T2 ו- T3 זוהו בו-זמנית עם המוצג הכפול של לוציפראז. וקטור SgRNA האחרון הציג את אות הגילוי הגבוה ביותר ולאחר מכן שימש למחקר עריכת גנים כבשים.

בעקבות פרוטוקול זה, ניתן לבצע בדיקות T7EI או מוצג ריבונוקלאז. אמצעים נוספים אלה מעניקים רשמים מדויקים יותר של עריכת גנים אנדוגניים.