בניית פלסמידים CRISPR וזיהוי יעילות נוקאאוט בתאים יונקים באמצעות מערכת כתב לוציפראז כפול
5 בדצמבר 2020
כאן, אנו מציגים פרוטוקול המתאר שיטה יעילה עבור הדור היעיל של פלסמידים המבטאים הן את אנזים CRISPR והן את RNA מדריך יחיד (sgRNAs). שיתוף פעולה של תאים יונקים עם וקטור sgRNA / CRISPR זה וקטור כתב לוציפראז כפול הבוחן תיקון הפסקה דו-גדילי מאפשר הערכה של יעילות נוקאאוט.
פרוטוקול זה מתאר את שלבי המפתח בהידור ואופטימיזציה של וקטורים יעילים של sgRNA. ההקדמה שלנו של מועמד sgRNA מטרות זמן יחסי והסקת מסקנות. היתרון העיקרי של פרוטוקול זה הוא שהוא מאפשר לנתח את רשמי קידוד ה- DNA עבור כל אחד מה- sgRNAs מבלי לערוך גנים אנדוגניים.
ניתן להחיל שיטת בחירה מוקדמת זו גם על אמצעים אחרים לעריכת גנים באמצעות הפסקות דו-לוגיות. התחל על ידי דילול oligonucleotides lyophilized לריכוז סופי של 10 micromolar במים מזוקקים כפולים. ערבבו קדימה ואחורי אוליגונוקלאוטידים בצינור PCR דק-קירות ביחס של אחד לאחד מבלי להוסיף מאגר נוסף.
להחגירה את התערובת ב 95 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות, ולאחר מכן רמפה למטה את הטמפרטורה ל 72 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. הסר את תערובת oligonucleotide ממכונת PCR ולאפשר לו להתקרר בטמפרטורת החדר. לעיכול וקטור pX330-xCas9, עם Bbs1, שלבו את מאגר הווקטור, האנזים והעיכול בנפח של 50 מיקרוליטר והדקירה את התגובה ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים.
לאחר ביצוע טרנספורמציה התא, לבחור חמש עד 10 מושבות חיידקים מהצלחת LB ולהשתמש בכל אחד מהם כדי לחסן מיליליטר אחד של מדיה LB עם 60 מיליגרם אמפיצילין בצינור 1.5 מיליליטר. ואז להדרגר את הצינורות על שייקר סיבובי במשך שעתיים עד שלוש שעות. בצע PCR כדי לסנן עבור פלסמידים רקומביננטי כמתואר בכתב יד טקסט, ולאחר מכן להפעיל את המוצרים על 2%Agarose ג'ל תחת 10 וולט אחוזים.
לאחר זיהוי הפלסמידים החיוביים, השתמש בהם, יחד עם וקטור כתב, כדי לבצע חילוף שותף של קו תא מתאים. כדי ללת את התאים, הסר את מדיום הצמיחה מהתאים התרבותיים. בעדינות לשטוף את פני השטח של כלי התרבות עם PBS ולחלק 100 microliters של PLB לתוך כל תרבות היטב כדי לכסות לחלוטין את שכבת מונו התא.
תן את הצלחת דגירה בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות, ולאחר מכן להעביר את lysate לצינור או בקבוקון להמשך טיפול או אחסון. כדי לבצע את בדיקת הלוציפראז הכפולה, תכנת את הזוהר לספק השהיה של שתי שניות לפני הקריאה ואחריה תקופת מדידה של 10 שניות. לאחר מכן, מחלקים 100 מיקרוליטרים של לוציפראז מסאי רגנט למספר המתאים של צינורות לומינומטר.
בזהירות להוסיף 20 microliters של lysate התא לתוך צינור זוהר ומערבבים על ידי צינור פעמיים או שלוש פעמים. מניחים את הצינור בלומינומטר ויוזם את הקריאה. הסר את צינור הדגימה מהלומינומטר.
מוסיפים 100 מיקרוליטרים של עוצרי ים ומערבולת לזמן קצר כדי לערבב. מחזירים את הדגימה ללומינומטר ויוזם קריאה. הקלט את פעילות רנילה לוציפראז, מנורמלת לפעילות פיירפלי לוציפראז, במיוחד הגומלין של היחס המוצג על המסך.
השלך את צינור התגובה בסיום. שיטה זו שימשה ליצירת שלושה וקטורים sgRNA עבור כבשים DKK2 אקסון 1. sgRNA ו- xCas9 וקטורים מבטאים נבנו על ידי עיכול מראש של עמוד השדרה הווקטור ואחריו קשירה בסדרה של שברי DNA קצרים, כפולי גדילים באמצעות זוגות אוליגו חישול.
שבע מושבות חיידקים הוקרנו עם PCR מונחה זוג פריימר ספציפי ואת המושבות החיוביות זוהו. יכולות מיקוד הגנים של pX330-xCas9 T1, T2 ו- T3 זוהו בו-זמנית עם המוצג הכפול של לוציפראז. וקטור SgRNA האחרון הציג את אות הגילוי הגבוה ביותר ולאחר מכן שימש למחקר עריכת גנים כבשים.
בעקבות פרוטוקול זה, ניתן לבצע בדיקות T7EI או מוצג ריבונוקלאז. אמצעים נוספים אלה מעניקים רשמים מדויקים יותר של עריכת גנים אנדוגניים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה
פרוטוקול זה מתאר שיטה יעילה לייצור פלסמידים המבטאים את האנזים CRISPR ורנ"א מנחה יחיד (sgRNAs) הקשורים אליו. הוא מאפשר הערכת יעילות הנוקאאוט באמצעות טרנספקציה משותפת עם וקטור דו-לוציפרז דו-גורמי.
מרכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- עריכת גנים
- טכנולוגיית CRISPR
- בניית פלסמידים
רקע
- ייצור יעיל של וקטורי sgRNA חיוני לעריכת גנים.
- הפרוטוקול מאפשר ניתוח של רשמי קידוד DNA ללא עריכת גנים אנדוגניים.
- בחירה מוקדמת של מטרות sgRNA יכולה להעלות את יעילות העריכה.
- שיטה זו יכולה לשמש למגוון אמצעי עריכת גנים.
מטרת המחקר
- לספק פרוטוקול לייצור וקטורי sgRNA יעילים.
- להקל על ניתוח האפקטיביות של sgRNA בעריכת גנים.
- לייעל את התהליך של הערכת יעילות הנוקאאוט.
שיטות בשימוש
- דילול של אוליגונוקלאוטידים ליפיליזים לריכוז סופי של 10 מיקרו-מולר.
- ערבוב של אוליגונוקלאוטידים קדימה ואחורה בצינור PCR.
- טרנספקציה משותפת של תאים יונקים עם וקטור sgRNA/CRISPR ווקטור דו-גורמי.
- הערכת יעילות תיקון שבר דו-גדילי.
תוצאות עיקריות
- הפרוטוקול מאפשר ייצור יעיל של וקטורי sgRNA.
- ניתן להעריך באופן יעיל את יעילות הנוקאאוט.
- בחירה מוקדמת של מטרות sgRNA משפרת את תהליך העריכה.
- השיטה ישימה לאסטרטגיות עריכת גנים אחרות.
מסקנות
- פרוטוקול זה מספק גישה אמינה לייצור וקטורי sgRNA.
- הוא מאפשר ניתוח של עריכת גנים מבלי לשנות גנים אנדוגניים.
- השיטה יכולה להיות מותאמת ליישומי עריכת גנים שונים.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Efficient sgRNA vector construction and rapid knockout efficiency assessment are critical for accelerating CRISPR-based target validation in early discovery pipelines. The dual luciferase reporter system enables quantitative, pre-endogenous screening of candidate sgRNAs, reducing time and resource expenditure before full-scale gene editing. This workflow supports portfolio triage by prioritizing sgRNAs with the highest editing potential for downstream applications.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables rapid preselection of sgRNAs with high editing efficiency before endogenous gene targeting.
- Supports functional target validation by quantifying double-strand break repair via reporter assays.
- Reduces mechanistic ambiguity by isolating sgRNA performance in a controlled system.
- Facilitates predictive confidence in CRISPR reagent selection for subsequent studies.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized, quantitative readout for sgRNA activity using dual luciferase ratios.
- Improves assay reproducibility and comparability across candidate sgRNAs.
- Enables scalable screening of multiple sgRNA constructs in parallel.
- Prepares validated sgRNA/CRISPR vectors for downstream gene editing workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns sgRNA selection with translational goals by ensuring only high-efficiency reagents advance.
- Supports continuity from discovery to preclinical validation by minimizing failed edits in disease-relevant models.
- De-risks preclinical studies by front-loading sgRNA efficacy assessment.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates at the interface of early discovery and lead identification, enabling efficient sgRNA selection prior to endogenous gene editing and downstream functional studies.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing and pathway interrogation by enabling rapid sgRNA efficacy screening.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible luciferase-based outputs for sgRNA comparison.
- Analytics: Provides normalized dual luciferase ratios to objectively rank sgRNA performance.
- Translational Research: Ensures only validated, high-performing sgRNAs progress to disease-relevant or preclinical models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for sgRNA validation across multiple gene targets and projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic uncertainty in CRISPR reagent selection.
- Operational Value: Standardizes sgRNA screening and accelerates vector construction timelines.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital allocation by prioritizing high-efficiency sgRNAs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement and reduces late-stage failure due to ineffective gene editing.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular cloning, cell transfection, and luciferase assay execution.
- Needs access to PCR, gel electrophoresis, and luminometer instrumentation.
- Demands cross-team standardization of assay conditions and data normalization.
- Adaptable to various mammalian cell lines and gene targets with appropriate optimization.
- Dependent on accurate oligonucleotide design and vector preparation for reproducible results.
