Name: בדיקת מחוץ גופית מבחן להערכת כלבת חיסון עוצמת (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-11T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: למדו שיטת ELISA לא מישר לבדיקת עוצמת חיסון כלבת כחלופית לבדיקת NIH בחיות. השיטה מזהה טרימרים של גליקופרוטאין בעזרת נוגדן מונוקלונלי mAb-D1, מציעה רגישות גבוהה ותוצאות תוך יום אחד בלבד.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ד ר סילבי מורגאטו וד ר ז'אן-מישל צ'סאל חייבים להיות מודעים להשתתפות המפתח שלהם על מנת לבסס את מינון ה-אליסה על אצוות חיסונים ולארגן סדנאות בינלאומיות ומחקרים משותפים. אנחנו מודים לסברינה קאלי. על קריאה קריטית בכתב היד ד ר פייר פרין היה אחראי לבידוד ולאפיון של mAb-D1. עבודה זו נתמכת בעיקר על ידי מימון מכון פסטר.

1. אמצעי זהירות ביטחוניים
הערה: שיטה זו ישימה גם עבור החיסון הפעיל של RABV וללא הפעלה.
<ol><li>השתמש בנוהל מעבדה טוב ובהליכי בטיחות.</li>
	<li>ללבוש הולם ציוד הגנה אישית (PPE) כולל מעיל חד פעמי, כפפות, מסכה, משקפיים, וכו '.</li>
	<li>כאשר וירוס חי מתבצע, השתמש בארון בטיחות ביולוגי בכיתה II.<ol>
<li>שקול כל חומר במגע עם דגימות (ריאגנטים, כביסה פתרונות וכו ') כחומר זיהומיות.</li>
		<li>פנקו את החומר המזוהם על ידי המאדות בתמיסת האקונומיקה (2, 5% מההיפוכלוניט של נתרן) במשך 30 דקות לטיהור.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לטפל בכימיקלים בהתאם לתרגול המעבדה הטובה.</li>
</ol>2. הכנה
<ol><li>השתמש ריאגנטים כיתה אנליטית היכן אי פעם אפשרי.</li>
	<li>להכין פתרונות טריים של מאגר ציפוי/קרבונט מאגר, מאגר פסיבציה, מדלל ו ציטראט מאגר (שולחן 1), לסנן דרך 0.45 או 0.22 יקרומטר מסננים ולאחסן ב 4 ° צ' ליום אחד לפני השימוש כדי לשמר את הטוהר האנליטי שלהם.</li>
	<li>אפשר לריאגנטים להגיע לטמפרטורת החדר (+ 18 ° c עד 25 ° c) 30 דקות לפני השימוש והמגון על ידי ערבוב עדין לפני השימוש.</li>
</ol>3. הרגישות למיקרופלייט
הערה: השתמש ב-96 לוחיות הזיהוי החיסוני הממוטבות לאגד כמויות גדולות של חיסוני (למשל, ראה טבלת חומרים).
<ol><li>לכל טוב, להוסיף 200 μL של נוגדן חד שבטיים (mAb-D1) מדולל במאגר פחמתי. הערה: ריכוז אופטימלי של כ-1 μg/mL נקבע מראש ומתאים לדילול 1/2000 משוער של mAb-D1 המטוהרים. ריכוז מומלץ זה מצוין עבור כל אצוות mAb-D1 וחייב להיות מאומת מעת לעת באמצעות הפקד החיובי.</li>
	<li>כסו את הצלחת בסרט דביק ומודקת את המיקרופלטה ל -3 מעלות ב-37 ° c באווירה של מחולל לחות.</li>
	<li>ומעבירים בזהירות את התוכן היטב לנמען המכיל 2, 5% נתרן היפוכלוניט הפתרון.</li>
	<li>היפוך המיקרוצלחת ולתת לו להתייבש על נייר adsorbent פוף בטמפרטורת החדר עבור 5 דקות.</li>
</ol>4. פסיבציה מיקרופלטה
<ol><li>לכל באר, הוסף 300 μL של מאגר הפסיבציה.</li>
	<li>מכסים את הצלחת עם סרט דביק ו דגירה עבור 30 דקות ב 37 ° c.</li>
	<li>משנף בקפידה ולהעביר את התוכן היטב לתוך הנמען המכיל 2, 5% נתרן היפוכלוניט הפתרון.</li>
	<li>היפוך המיקרו-פלטה והפוך אותו ליבש על נייר adsorbent בטמפרטורת החדר עבור 1 דקות. הערה: ניתן להשתמש במיקרו-לוחית או לאחסנו באופן מיידי ב-20 ° c עד 3 חודשים עד לשימוש.</li>
</ol>5. שיטת אליסה
הערה: להקמת עקומת הבקרה של חיסון הייחוס, Step 5.3 אינו נדרש; כדי נכייל את החיסון נבדק כל הצעדים 5.1 כדי 5.6 נחוצים.
<ol><li>שטיפת מיקרולוחית הרגישות<ol>
<li>לכל טוב, להוסיף 300 μL של מאגר הכביסה.</li>
		<li>משנף בקפידה ולהעביר את התוכן היטב לתוך הנמען המכיל 2, 5% נתרן היפוכלוניט הפתרון.</li>
		<li>חזור על שלבים 5.1.1 ו 5.1.2 עוד חמש פעמים כדי לשטוף בהרחבה את הצלחת הרגישות.</li>
		<li>היפוך המיקרו-פלטה והפוך אותו ליבש על נייר adsorbent בטמפרטורת החדר עבור 1 דקות.</li>
	</ol></li>
	<li>דילול של חיסון הייחוס עבור עקומת הבקרה<ol>
<li>מהווים מחדש את החיסון הייחוס (אנטיגן אימות לוט 09) ב 1 מ ל של מים מזוקקים התואמים ריכוז של 10 μg/mL של וירוס כלבת גליקופרוטאין.</li>
		<li>להכין דילול עשר קיפול של החיסון התייחסות מחדש בדילול להגיע 1 μg/mL של וירוס כלבת גליקופרוטאין.</li>
		<li>הכינו 6 מדלל בשני קיפול סדרתי של חיסון זה התייחסות בדילול כפי שמצוין בטבלה 1.</li>
		<li>הפץ 200 μL של הדילול בשכפול (בארות 1H/2H) כדי לשמש כפקד ריק.</li>
		<li>הפץ 200 μL לכל היותר של כל התייחסות לדילול חיסונים בשכפול (בארות G1/G2 ל-A1/A2).</li>
	</ol></li>
	<li>דילול החיסון הנבדק עבור טיטור<ol>
<li>להכין דילול עשר קיפול של החיסון נבדק בדילול.</li>
		<li>הכינו מדלל סדרתי 7 2 מקפלים של החיסון נבדק בדילול כפי שמצוין בטבלה 2.</li>
		<li>הפץ 200 μL לכל היותר של כל דילול חיסונים נבדק בשכפול (בארות H3/H4 עד A3/A4).</li>
	</ol></li>
	<li>דגירה/שטיפת צלחת אליסה<ol>
<li>לכסות את המיקרופלייט עם סרט דביק ו הדגירה 1 h ב 37 ° c.</li>
		<li>הסר את הסרט, מרוב בזהירות ולהעביר את התוכן של כל טוב לתוך הנמען המכיל 2, 5% נתרן היפוכלוניט הפתרון.</li>
		<li>לכל טוב להוסיף 300 μL של מאגר כביסה.</li>
		<li>משנף בקפידה ולהעביר את התוכן של כל טוב לתוך הנמען המכיל 2, 5% נתרן היפוכלוניט הפתרון.</li>
		<li>חזור על שלבים 5.4.3 ו 5.4.4 חמש פעמים כדי להסיר את האנטיגן הלא מאוגד ולשמר את טרימרס G החלבון כרוך הנוגדן מצופה (mAb D1).</li>
		<li>היפוך המיקרו-פלטה והפוך אותו ליבש על נייר adsorbent בטמפרטורת החדר עבור 1 דקות.</li>
	</ol></li>
	<li>כריכת הperoxidase מצובת מ-D1<ol>
<li>הפץ 200 μL לכל היותר של הדילול המומלץ (1/2000) של הperoxidase-mAb-D1 בדילול (ריכוז משוער של 1μg/mL). ריכוז מומלץ מצוין עבור כל אצווה mAb-D1 ויש לוודא מעת לעת עם השליטה החיובית.</li>
		<li>לכסות את המיקרופלייט עם סרט דביק ו הדגירה 1 h ב 37 ° c.</li>
		<li>הסר את הסרט, מרוב בזהירות ולהעביר את התוכן של כל טוב לתוך הנמען המכיל 2, 5% נתרן היפוכלוניט הפתרון.</li>
		<li>הוסף לכל באר, 300 μL של מאגר הכביסה.</li>
		<li>משנף בקפידה ולהעביר את התוכן של כל טוב לתוך הנמען המכיל 2, 5% נתרן היפוכלוניט הפתרון.</li>
		<li>חזור על שלבים 5.5.4 ו-5.5.5 חמש פעמים כדי להסיר נוגדנים בעלי תווית peroxidase לא מאוגדת (mAb D1).</li>
		<li>היפוך המיקרו-פלטה והפוך אותו ליבש על נייר adsorbent בטמפרטורת החדר עבור 1 דקות.</li>
	</ol></li>
	<li>התגלות באמצעות מצע כרומוגן<ol>
<li>הפץ 200 μL לכל היותר של פתרון כרומודור-מצע.</li>
		<li>לאטום את המיקרופלייט עם סרט ומודקון בחושך בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות. צבע צהוב-כתום מפתח את האינטנסיביות של אשר הוא פרופורציונלי לכמות הנוגדן peroxidase המסומן בתווית (mAb D1).</li>
		<li>להפסיק את התגובה על ידי הוספת 50 μL של הפסקת פתרון לכל טוב.</li>
		<li>בזהירות לנגב את החלק התחתון של המיקרו לוחית ולמקם אותו ספקטרוסקופיה כדי לקבוע את צפיפות אופטית (OD) ב 492 ננומטר של כל הבארות בשימוש: שלילי שליטה (ריק), התייחסות חיסון החיסון נבדק.</li>
		<li>אסוף נתוני OD כתבנית קובץ xls או. xlsx לצורך ניתוח.</li>
	</ol></li>
	<li>לצייר את עקומת החיסון ההפניה, התוכן trimeric גליקופרוטאין, כפונקציה של צפיפות אופטית (492 nm)<ol>
<li>לחשב את ה-OD הממוצע ב 492 nm עבור כל שכפול בדילול שונים של חיסון הייחוס (בארות G1/G2 ל-A1/A2 בטבלה 2)</li>
		<li>הפחת את ה-OD הממוצע של הריק (בארות, H1/H2 בטבלה 2) מכל ממוצע מחושב.</li>
		<li>התווה את ערכי ה-OD הנוצרים על הציר האנכי (קנה מידה ליניארי) ואת הריכוז המקביל בגליקופרוטאין טרימרס (ng/mL) על הציר האופקי (סקאלה לוגריתמי).</li>
		<li>ציירו את עקומת ההפניות על-ידי הצטרפות לנקודות (איור 1).</li>
	</ol></li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

האפיפי המזוהה על ידי mab-D1 ממוקם באתר העברה אנטיגנית III של rabv גליקופרוטאין שהוא לא רק חיסונית-דומיננטי עבור אינדוקציה של vnabs אלא גם מעורב בנוירואלימה, פתוגנונות40,41 וזיהוי הקולטן42. יש עוד אתר חשוב העברה אנטיגנית לאורך גליקופרוטאין, באתר II43, כנגד אילו מספר mabs יש מבודדים כגון mabs-WI-111235. אלה יכולים לשמש גם בסוג דומה של ניסויים.
מגבלה אחת של זה בשיטה מ...

מאז יותר מ 50 שנים, מבחן NIH1 משמש כשיטה בתקן זהב כדי להעריך את עוצמת החיסון נגד כלבת לפני שחרור האצווה. בדיקה זו מורכבת מחיסון תוך-הצפק של קבוצות של עכברים עם החיסון להיבדק ולאחר מכן האתגר הפנימי (IC) 14 ימים לאחר מכן עם המתח וירוס האתגר תקן (ה-קורות חיים) של וירוס כלבת (RABV). העוצמה מוערכת מתוך שיעור של עכברים ששרדו את האתגר IC. למרות מי2 ו-Pharmacopeia האירופי3 עדיין דורשים מבחן NIH להערכת עוצמת החיסון, בדיקה זו סובלת מכשולים מספר: תוצאות משתנה מאוד4; rabv זיהומיות משמש במהלך האתגר וזה דורש הן מיומנות טכנית ואמצעים אבטחה טיחות קפדנית; מספר גדול של בעלי חיים משמשים, וחומרת האתגר מעלה דאגות אתיות חמורות5. וריאציה חמורה פחות של בדיקה זו פותחה: שבועיים לאחר חיסון פנים הצפק, עכברים לא מאותגרים על ידי IC אבל דימם ונבדק לנוכחות של נוגדנים מסוימים לנטרול ראV (VNAbs) בסרום שלהם באמצעות ניטרול מבחנה. עם זאת, בדיקה זו עדיין דורשת הקרבת מספר רב של עכברי מעבדה למרות שהוא כבר בשימוש עבור חיסונים וטרינריים6,7 ונחשב עבור חיסונים אנושיים8.
החל מעכשיו, הן בינלאומיות9 ו-האירופי10 המלצות לעודד יצרנים ומעבדות השליטה הלאומית (הרפואה הרשמית בקרת מעבדות-omcls) כדי ליישם את ההחלפה, צמצום, ועידון של בדיקות חיות מעבדה, המכונה האסטרטגיה 3rs. הדירקטיבה האירופית 2010/63/האיחוד האירופי (בתוקף מאז 2013/01/01) הקשורים להגנה ולרווחתם של בעלי החיים גם חיזקו את האילוצים ליצרני חיסונים ומעבדות המעורבים בבקרת איכות של חיסונים נגד כלבת, כמו גם במחקר כלבת11. כתוצאה מכך, הפיתוח, האימות והשימוש בחלופות מחוץ לתחום, הפכו כעת לעדיפות. אלה הם לא רק קול מבחינה מוסרית אבל יכול גם להפחית את עלויות בדיקות אצווה לקצר את הזמן עבור תוצאות לשעות במקום שבועות3.
במשטח של החלקיק הרב, מאמצת גליקופרוטאין trimeric טופס12,13,14,15,16. בחיסון נגד כלבת, הטופס יליד trimeric זה מהווה את הגורם החיסוני העיקרי הגורם vnabs17 בעוד monomeric, מסיסים או הדקופרוטייטנטינים הם החיסונית מחמיר18,19. לפיכך, שימור הטרימרים של גליקופרוטאין לאורך תהליך ייצור החיסון הוא אינדיקציה טובה לשימור פוטנציאל חיסוני מיטבי. מספר שיטות חיסוני כימיים, כגון כריכת נוגדן מבחן20,21, החיסוני הרדיאלי היחיד (srd) מבחן22 ואת מבחן אליסה23,24,25,26,27 מומלצים על ידי הסדרה הדו ח הטכני2 ואת מונוגרף האירופי3 לכמת את התוכן אנטיגן חיסונים כלבת. אלה משמשים על ידי היצרנים כדי לפקח על העקביות של ייצור החיסון ועל ידי omcl להעריך את הניסוח עקבית של קבוצות של חיסונים אנושיים28, גם אם בדיקת NIH עדיין נחשב לעוצמה.
עם זאת, כל השיטות הללו של האימונוגלוקליות אינן שוות ערך. מבחן srd דורש טיפול מקדים אשר עשוי לשנות את הטרימרס מעוגן הממברנה ולגרום בצורה מסיסים או מעוגנת של גליקופרוטאין22,29. מכאן, SRD אינו יעיל בהרבה להפלות בין החיסון האנטי-אימונוגלוגניים שאינם חיסוני וכתוצאה מכך הערכה לא מושלמת של החיסוני של מגרש חיסונים. לעומת זאת, מבחן אליסה הוא רגיש יותר22, שומר על מבנה יליד של גליקופרוטאין, והוא מתאים יותר לקבוע את התוכן של הטרימרים המקופלים מקורי של גליקופרוטאין. בדיקת ה-אליסה יכולה להשתמש גם בשני שבטים של הארנב או בעכבר שבטיים אנטי גליקופרוטאין מטוהרים או מרוכזים עם אמוניום גופרתי. מחקרים הפגינו הקונקורדנציה טובה בין בדיקת NIH לבין התוכן אנטיגן העריך על ידי אליסה בחיסונים וסיכם כי שיטות אליסה מתאימים לבדיקת העוצמה מחוץ לגופית. אלה עורכי דין כי בדיקות אליסה עשוי לפחות תוספת או אפילו להחליף את מבחן NIH4,26,27,30,31,32,33. כיום, הפרמקופיאה האירופאית ממליצה על שימוש באסמאולוגי או חיסוני מאומת כחלופות למבחן NIH3. הימנעות מוחלטת של השימוש בעלי חיים לעוצמת החיסון הפך פרספקטיבה ריאליסטית.
השיטה המוצגת להלן מבוססת על כריך מסוג אליסה עקיפה באמצעות שיבוט נוגדן מונובטיים (mab-D1) אשר מזהה את האתרים העברה אנטיגנית III (aa 330 אל 338) של trimeric rabv גליקופרוטאין15,34. שיטה זו פותחה בתחילה ב מכון פסטר26,30 ולאחר מכן ממוטבת ומאומת על ידי סוכנות הידיעות הלאומית דה מדימטיקה של הסוכנות לרפואה ומעבדה, כלומר, omcl הצרפתי4,33. MAb-D1 משמש הן ברגישות לצלחת ולאחר מכן לגילוי האנטיגן שנתפסו. זה מאפשר את הקוונפיקציה ספציפיים של גליקופרוטאין טרימרס, כלומר, האנטיגן החיסוני RABV. MAb-D1 המשמש לאיתור מתויג עם peroxidase, אשר נחשף בנוכחות המצע ו כרומוgen. השוואת ספיגת הספיגה נמדדת על החיסון הנבדק וחיסון הייחוס מאפשר לקבוע את התוכן החיסוני של גליקופרוטאין. יש לציין כי אותו סוג של שיטת ניתן להחיל עבור mAbs שונים לזהות אתרים נוגדי הגניים שונים של RABV גליקופרוטאין35. השיטה כדי להשיג ולטהר או להתרכז עם אמוניום סולפט נגד גליקופרוטאין שבטיים מסוג הארנב (IgG) או globuperoxidase העכבר המונבטיים תיארו בהרחבה בעבר36 יחד עם השיטה המשלים נוגדנים עם37.

<table><tbody><tr><td>Class II ארון בטיחות ביולוגי</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10445753</td><td>אם טיטרציה של וירוס חי</td></tr><tr><td>ברור שטוח תחתון חיסון לא סטרילי 96 בארות צלחות 400 ומיקרו; L, MAXISORP</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>439454</td><td>טוב לקשירה לנוגדנים הטעונים</td></tr><tr><td>Equip Labo פוליפרופילן מעבדה אדים קולט אדים</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12576606</td><td>להכנת חומצה גופרתית</td></tr><tr><td>אימונולוגיה צלחת חזקה ספיחה MAXISORP תחתית שטוחה באר F96</td><td>Dutscher</td><td>55303</td><td>טובה לקשירה לנוגדן הטעון</td></tr><tr><td>איטום מיקרופלייט קלטת(100 גיליונות)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15036</td><td></td></tr><tr><td>Microplate&nbsp; קורא מצב יחיד Sunrise</td><td>TECAN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microplate שייקר-אינקובטור</td><td>Dutscher</td><td>441504</td><td></td></tr><tr><td>מכונת כביסה Microplate Wellwash</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>5165000</td><td></td></tr><tr><td>פיפטה רב ערוצית (30-300 ומיקרו; L) 12 ערוצים</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4661180N</td><td></td></tr><tr><td>פיפטות חד ערוציות (ערכה 2: Finnpipettes F2 0.2-2 &mu; L מיקרו, 2-20 ו-mu; L, 20-200 &mu; L & 100-1000 &mu; L)</td> <td>ThermoFisher Scientific</td><td>4700880</td><td></td></tr></tbody></table>

בדיקת מחוץ גופית מבחן להערכת כלבת חיסון עוצמת

In Vitro ELISA Test to Evaluate Rabies Vaccine Potency

הדאגה העולמית הגוברת לרווחת בעלי החיים היא לעודד יצרנים ומעבדות השליטה הלאומית (OMCLs) לבצע את האסטרטגיה השלישית להחלפת, צמצום ועידון של בדיקות חיות המעבדה. התפתחות הגישות בתחום החוץ מומלצת ברמות האדם והאירופאי כחלופות למבחן NIH להערכת עוצמת החיסון בכלבת. על פני השטח של וירוס הכלבת (RABV), הטרימרים של גליקופרוטאין מהווים את החיסון העיקרי לגרום לנוגדנים לנטרול נגיפים (VNAbs). מבחן אליסה, שם לנטרל נוגדנים מונובטיים (mAb-D1) להכיר את הצורה הtrimeric של גליקופרוטאין, פותחה כדי לקבוע את התוכן של יליד מקופל trimeric גליקופרוטאין יחד עם הייצור של אצוות החיסון. זה בדיקת מבחנה מבחינה גופית הפגינו קונקורדנציה טובה עם מבחן NIH ונמצא מתאים בניסויים שיתופית על ידי יצרני החיסון RABV ו-OMCLs. הימנעות משימוש בעלי חיים היא מטרה השגה בעתיד הקרוב.
השיטה המוצגת מבוססת על מבוסס על כריך דיאגנוסטיקה בלתי ישירה של אליסה באמצעות mab-D1 אשר מזהה את האתרים העברה אנטיגנית III (aa 330 אל 338) של trimeric rabv גליקופרוטאין, כלומר, אנטיגן מבוסס rabv החיסוני. mAb-D1 משמש לציפוי ולגילוי של טרימרס גליקופרוטאין הנמצאים באצווה החיסון. מאחר והאפירופה מזוהה בשל תכונותיו הקונפורמציה, לא ניתן ללכוד ולזהות את הגליקופרוטאין העלול להיות מזוהה על ידי ה-mAb-D1. החיסון הניתן לבדיקה מודמת בצלחת הנמצאת בתוך לוחית של mAb-D1. Trimeric RABV מאוגד מזוהה על ידי הוספת mAb-D1 שוב, מתויג עם peroxidase ולאחר מכן נחשף בנוכחות מצע כרומוgen. השוואת ספיגת הספיגה נמדדת על החיסון הנבדק וחיסון הייחוס מאפשר לקבוע את התוכן החיסוני של גליקופרוטאין.

בדוגמה הבאה את החיסון הפניה המגרש 09, המורכב חלקיקי וירוס כלבת מטוהרים (PV החיסון זן), משמש. The גליקופרוטאין טרימרס (10 μg/mL) תוכן זה כבר הוקם לאחר קביעת הסכום הכולל של חלבונים ויראלי (BCA מבחן) והערכה של אחוז גליקופרוטאין על ידי האלקטרופורזה בג של SDS-pvc. לחילופין, חיסון התייחסות מכויל, לדוגמה, התקןהבינלאומי ה -6 (IS) לחיסון נגד כלבת (קוד כיול: 07/162) ניתן לשימוש.
טבלה 3 מציגה את ערכי ה-OD (492 נ...

כאן אנו מתארים בעקיפין כריך מחלה אימונואפלטיוט כדי לקבוע את התוכן החיסוני גליקופרוטאין בחיסון כלבת. מבחן זה משתמש נוגדן מונושבטיים (mAb-D1) לזהות גליקופרוטאין טרימרס. זוהי חלופה למבחן vivo NIH לבצע את העקביות של עוצמת החיסון במהלך הייצור.

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy ...

במטרה להפחית את הניסויים בבעלי חיים ובגלל השונות של מבחן NH, ארגון הבריאות בעולם מעודד לפתח גישות במבחנה להערכת עוצמת החיסון נגד כלבת. בדיקה זו ELISA מראה קונקורדנס טוב עם בדיקת NH קלאסית בזיהוי הצורה האימונוגנית של גליקופרוטאין, מראה רגישות גבוהה, והוא יכול להתבצע בתוך יום אחד בלבד. הערכה של עוצמת החיסון נגד כלבת במבחנה על ידי ELISA היא חלופה למבחן NH in vivo.הוא מקודם על ידי היצרנים ומעבדות הבקרה הלאומיות. זה קריטי כדי להפיץ כרכים בגודל מראש כפול עבור כל דילול כדי לייבש היטב את הצלחת על נייר סופג לאחר שטיפה כדי למנוע כדי להתחיל בהליך זה, לשים על ציוד הגנה אישית נאותה כולל מעיל חד פעמי, כפפות, מסכה, ושקפיים. לטפל בחומרים מזוהמים על ידי טבילה אותו בתתיק של 2.6% hypochlorite נתרן במשך 30 דקות עבור טיהור.לאחר מכן, להגדיר צלחת immunoassay 96-well ולהוסיף 200 microliters של נוגדן חד שבטי מדולל במאגר קרבונט לכל באר. מכסים את הצלחת בסרט דבק ודגירה את המיקרופלסטיק ב 37 מעלות צלזיוס במשך שלוש שעות בסביבה לחה. לאחר מכן בזהירות שאפו והעברו את תוכן הבאר לנמען המכיל פתרון של 2.6% נתרן היפוכלוריט.להפוך את המיקרופלסטיק ולתת לו להתייבש על נייר סופג בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות. ראשית, להוסיף 300 microliters של מאגר פסיבציה לכל באר. מכסים את הצלחת בסרט דבק ודגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות.לאחר מכן, להעביר את התוכן של הבאר לאחד המכיל פתרון של 2.6% hypochlorite נתרן. כדי לשטוף את הצלחת, להוסיף 300 microliters של מאגר הכביסה לכל באר. לאחר מכן שאפו בזהירות והעבירו את תוכן הבאר לנמען המכיל פתרון של 2.6% נתרן היפוכלוריט.חזור על תהליך כביסה זה חמש פעמים נוספות כדי לשטוף בהרחבה את הצלחת רגיש. לאחר מכן, להפוך את המיקרופלסטיק ולתת לו להתייבש על פיסת נייר סופג בטמפרטורת החדר במשך דקה אחת. לשחזר את החיסון התייחסות במיליליטר אחד של מים מזוקקים, כך הריכוז הסופי של נגיף הכלבת גליקופרוטאין הוא 10 מיקרוגרם למיליליטר.הכינו דילול פי 10 של חיסון הייחוס המשוחזר בדילול כדי להגיע לריכוז גליקופרוטאין של נגיף כלבת של מיקרוגרם אחד למיליליטר. לאחר מכן, בצע שישה דיללולים סדרתיים של פי שניים של חיסון ייחוס זה בדילול כפי שמתואר בטבלה אחד מפרוטוקול הטקסט. להפיץ 200 microliters של diluent בארות כפולות לשמש שליטה עיוורת 200 microliters לגם עבור כל דילול חיסון התייחסות כפול.לאחר מכן הכינו דילול פי 10 של החיסון שנבדק בדילולנט והכינו שבעה דילולים סדרתיים של החיסון שנבדק בדילול כפי שמתואר בטבלה 2 של פרוטוקול הטקסט. להפיץ 200 microliters של כל דילול חיסון נבדק כפול לכל באר של microplate. מכסים את המיקרופלאט בסרט דבק ו דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת.לאחר מכן, הסר את הסרט. שאפו בזהירות והעבירו את התוכן של כל באר לנמען המכיל פתרון היפוכלוריט נתרן 2.7%. כדי לשטוף את הצלחת, להוסיף 300 microliters של חיץ כביסה לכל גם, שאפו בזהירות ולהעביר את התוכן של כל באר לתוך נמען המכיל 2.6% פתרון hypochlorite נתרן.חזור על תהליך הכביסה חמש פעמים נוספות כדי להסיר את האנטיגן הלא מאוגד ול לשמר את טרימרים G-חלבון קשור הנוגדן מצופה. להפוך את המיקרופלסטיק שטוף ולתת לו להתייבש על פיסת נייר סופג בטמפרטורת החדר במשך דקה אחת. לאחר מכן להפיץ 200 microliters של הדילול המומלץ של פרוקסידאז שכותרתו D1 נוגדן חד שבטי diluent לכל באר.מכסים את המיקרופלאט בסרט דבק ו דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת. לאחר מכן, הסר את הסרט, שאף בזהירות והעבר את התוכן של כל באר לנמען המכיל פתרון היפוכלוריט של 2.6%. כדי לשטוף את המיקרופלסטיק, הוסיפו 300 מיקרוליטרים של חיץ כביסה לכל באר.שאפו בזהירות והעבירו את התוכן של כל באר לנמען המכיל 2.6% פתרון hypochlorite נתרן. חזור על תהליך כביסה זה חמש פעמים נוספות כדי להסיר את נוגדן peroxidase לא מאוגד שכותרתו. להפוך את המיקרופלסטיק שטוף ולתת לו להתייבש על פיסת נייר סופג בטמפרטורת החדר במשך דקה אחת.לאחר מכן, להפיץ 200 microliters של פתרון כרומוגן מצע לתוך כל באר. לאטום את המיקרופלאט עם סרט צילום ודגירה בטמפרטורת החדר בחושך במשך 30 דקות. לאחר מכן להוסיף 50 microliters של פתרון עצירה לתוך כל באר כדי לעצור את התגובה.בזהירות לנגב את החלק התחתון של המיקרופלסטיק ולה למקם אותו ספקטרופוטומטר. לקבוע את הצפיפות האופטית ב 492 ננומטר עבור כל בארות בשימוש. אסוף נתונים אלה בקובץ גיליון אלקטרוני לצורך ניתוח.לאחר מכן, צור חלקות הן עבור עקומת החיסון הייחוס והן עבור ערכי הצפיפות האופטית כמתואר בפרוטוקול הטקסט. במחקר זה, הבדיקה במבחנה ELISA משמש להערכת עוצמת החיסון נגד כלבת. ערכי צפיפות אופטית מייצגים מניסוי טיפוסי מוצגים כאן.ערכים אלה משמשים כדי לצייר את עקומת החיסון התייחסות על ידי התוויית הצפיפות האופטית הממוצעת עבור דילולים שונים של חיסון הייחוס על הציר האנכי ואת הריכוז של גליקופרוטאין על הציר האופקי. תוכן הגליקופרוטאין של החיסון שנבדק מוערך לאחר מכן באמצעות עקומה זו. ההערכה מדויקת עבור דילולים בעלי ערך צפיפות אופטית ממוצע באזור אניה של עקומת החיסון התייחסות.אם לוקחים בחשבון את הדילול של אחד עד 40, ההקרנה האנכית של OD 1534 על ציר ה- x תואמת ל- 500 ננוגרם למיליליטר. אז החיסון שנבדק מוערך ב-20 מיקרוגרם למיליליטר של גליקופרוטאין. כאשר הוקמה העוצמה במבחנה, יש להשוות את החיסון שנבדק להתייחסות שישה תקן בינלאומי של ארגון האו"ם מכויל ביחידות בינלאומיות.ניתן להשתמש באותה שיטה עם נוגדנים אחרים כדי להגדיל את הגילוי של זנים חיסונים נוספים, כולל אלה המשמשים בחיסונים וטרינריים שהם קלאסיים יותר משתנים. נוגדנים יכולים לשמש גם בתחרות על טיטרציה של נוגדנים נגד רבי בסוסים או בסרום אנושי. יש לנקוט אמצעי זהירות עם חיסונים אינם מושבתים או עם וירוסים.הקפד להשתמש בציוד מגן אישי, ללבוש כפפות לטהר הכל כראוי. כמו כן, להיזהר עם טבליות של כפי שהם מסרטנים עם פתרון hypochlorite נתרן חומצי.

in-vitro-elisa-test-to-evaluate-rabies-vaccine-potency

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

סרטון זה מדגים צביעה אימונוהיסטוכימית לזיהוי אנטיגן של נגיף הכלבת ברקמת מוח עכבר נגועה. התהליך כולל דה-פרפיניזציה וטיפול באלכוהול, ולאחר מכן טיפול פרוטאוליטי לשיפור נגישות האנטיגן. צביעה אימונוהיסטוכימית מגלה משקעים אדומים, המאשרים את נוכחותם של אנטיגנים כלבת בסעיף הרקמות.

מכתים אימונוהיסטוכימיים לזיהוי אנטיגנים של נגיף הכלבת

סרטון זה מציג בדיקת אימונוסורבנט עקיפה הקשורה לאנזים או בדיקת לכידת חיסון סנדוויץ' ELISA שנועדה להעריך את רמות הגליקופרוטאין האימונוגני בחיסונים. צלחת הבדיקה, המכילה נוגדנים ספציפיים לגליקופרוטאין, מודגרת עם דגימות חיסון בדילול סדרתי, כולל חיסוני ייחוס ובדיקה, ולאחר מכן immunoassay כדי לכמת את תכולת הגליקופרוטאין בחיסון הבדיקה.

שימוש בכריך ELISA כדי לקבוע את תכולת הגליקופרוטאין האימונוגני בחיסון

מחקר זה מתאר של תפוקה גבוהה, assay מיקרו-ניטרול מבוססת הדמיה כדי לקבוע את כייל נוגדנים נטרול ספציפיות עבור הווירוס syncytial הנשימה (RSV). תבנית זו assay נבדקו על סוגי דגימה שונים.

Assay מיקרו-ניטרול קצב העברת נתונים משופר וגבוה הווירוס Syncytial הנשימה (RSV)

מבחן אימונוהיסטוכימיה מהירה ישירה (DRIT) מציע ארגון עולמי לבריאות בעלי חיים וארגון הבריאות העולמי (OIE/מי) המזוהה נגד נוגדן פלורסנט ישירה (DFA) מבחן לאבחון כלבת. בדיקה זו מאפשרת יישומים מבוססי שדה שניתן לבצע בתוך כ 1 שעות על רשמים במוח באמצעות מיקרוסקופ אור.

מעקב משופר כלבת באמצעות מבחן אימונוהיסטוכימיה ישירה מהירה

פאן-lyssavirus וירוס שעתוק הפוכה התגובה שרשרת פותחה כדי לזהות במיוחד את כל lyssavirus ידוע. אימות באמצעות דגימות מוח של כלבת ממינים שונים של בעלי חיים הראו כי שיטה זו יש רגישות וספציפיות שוות ערך לבדיקת נוגדן הפלורסנט הסטנדרטית וניתן להשתמש בה לאבחון כלבת שגרתית.

הערכה של מקונן אוניברסלי הפוכה תגובת שרשרת פולימראז לאיתור של Lyssaviruses

אנו מציגים פרוטוקול מלאה לאבחון שלאחר המוות של כלבת בעלי חיים תחת תנאי שדה באמצעות מבחן חיסוני מהיר האבחון (RIDT), מן הבדיקה ביופסיה המוח לפרשנות הסופי. אנו גם לתאר יישומים נוספים באמצעות המכשיר לניתוח מולקולרי הגנוזות ויראלי.

שדה הנתיחה לאחר המוות חיסוני מהיר מבחן אבחון עבור הגדרות מוגבלות משאב עם יישומים מולקולריים נוספים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול בדיקת אימונוהיסטוכימיה לגילוי אנטיגן וירוס כלבת כמבחן אבחון חלופי לרקמות קבועות פורמרין.

בדיקת אימונוהיסטוכימיה לגילוי אנטיגן ליסוירוס מרקמות קבועות פורמלין

פרוטוקול זה מציג גישה מבוססת qRT-PCR לקביעת מספר עותק הגן נוקלאופרוטאין (N) של וירוס הכלבת בתוך מבנים אנטומיים שונים במוח שור באמצעות שעתוק במבחנה.

כמויות של וירוס כלבת במבני מוח שור שונים

שיטה זו מתארת את האנקפסולציה של אנטיגן הכלבת למיקרו-חלקיקים פולימריים מתכלים בעלי תכונות מבניות וחומריות המאפשרות שחרור פולסטילי לאחר עיכוב קבוע מראש. הערכת ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) של האנטיגן שנלקח מליבת החלקיק מאשרת את נוכחותו של גליקופרוטאין תקין של נגיף הכלבת הטרימרי באמצעות ייצור חלקיקים.

ייצור של מיקרו-חלקיקים פולימריים פולסטיליים העוטפים אנטיגן כלבת

מטרת כתב היד היא לבחון את השימוש בבדיקת נוגדנים פלואורסצנטיים עקיפים לכלבת לאיתור נוגדנים ספציפיים לכלבת מסוג IgG ו-IgM.

איתור נוגדנים מסוג כלבת, IgG ו-IgM באמצעות בדיקת נוגדנים פלואורסצנטיים עקיפים של כלבת

פרוטוקול זה מדגים את בדיקת תגובת שרשרת פולימראז (RT-PCR) בזמן אמת של pan-lyssavirus LN34 מאיסוף רקמות ועד לפירוש התוצאה, כולל עדכונים לרצפי פריימר ותכשירים לשיפור ביצועי הבדיקה עבור כמה נגיפי ליסה ולגומורפים שאינם כלבת. אנו גם מדגימים את מערך הבדיקה עבור פורמט LN34 מרובב (LN34M) בעל באר אחת.

אבחון לאחר המוות של כלבת בבעלי חיים על ידי מבחן תגובת שרשרת פולימראז LN34 המעודכן והמרובה בזמן אמת

למדו שיטת ELISA לא מישר לבדיקת עוצמת חיסון כלבת כחלופית לבדיקת NIH בחיות. השיטה מזהה טרימרים של גליקופרוטאין בעזרת נוגדן מונוקלונלי mAb-D1, מציעה רגישות גבוהה ותוצאות תוך יום אחד בלבד.

בדיקת מחוץ גופית מבחן להערכת כלבת חיסון עוצמת

גלה סרטונים נוספים