יחסי למחצה כמותית של התרופה מגיב יציבות היעד (חצים) שיטת לימוד האינטראקציה Rapamycin/mTOR
27 באוגוסט 2019
במחקר זה, הצלחנו לשפר את יכולות ניתוח הנתונים של הניסוי חצים על ידי ניטור השינויים ביציבות החלבונים והערכת האהדה של ליגוניות חלבונים ואינטראקציות. ניתן להתוות את האינטראקציות לשתי עקומות: עקומת פרוטחרדה ועקומת תלות במינון. השתמשנו באינטראקציה של mTOR-rapamycin כמקרה מופתי.
זיקה לסמים מגיבה ליציבות היעד, DARTS, היא שיטה חזקה לגילוי מטרות חלבון חדשניות של מולקולה קטנה. ניתן להשתמש בו כדי לאמת אינטראקציות ידועות של חלבונים במולקולה קטנה ולמצוא מטרות חלבון פוטנציאליות למוצרים טבעיים. במחקר זה, אנו משפרים עוד יותר את יכולות ניתוח הנתונים של ניסוי DARTS על ידי ניטור השינויים ביציבות החלבון והערכת הזיקה של אינטראקציות חלבון-ליגנד.
ניתן להתוות את אינטראקציות החלבון-ליגנד מול שתי עקומות, עקומה פרוטאוליטית ועקומת תלות במינון. השתמשנו באינטראקציה mTOR-rapamycin כמקרה למופת להקמת הפרוטוקול שלנו. לגדל תאים 293T באמצעות DMEM עם 10% סרום חזיר עוברי, גלוטמין שני מילימולרים, ו 1% אנטיביוטיקה.
דגירה התרבויות ב 37 מעלות צלזיוס תחת 5% פחמן דו חמצני. כאשר התרבות מגיעה 80 עד 90%confluence, לשטוף את התאים פעמיים עם PBS קר. השתמש מגרד תאים כדי לאסוף את התאים לתוך כמות מתאימה של מאגר תות תאים קרים ולהעביר את התאים lysing לתוך צינור 1.5 מילימטר.
להפוך לערבב את חיץ תיזה ותאי lysing היטב דגירה הצינור על קרח במשך 10 דקות. צנטריפוגה הצינור ב 18, 000 פעמים גרם במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. מעבירים את העל-טבעי לצינור חדש של 1.5 מיליליטר ומצננים על קרח.
בצע בדיקת BCA כדי להעריך את ריכוז החלבון של ליזטים ולחשב את דילול הפרונסה בהתבסס על ריכוז החלבון. ראשית, להעביר את lysate לשני צינורות 1.5 מיליליטר, 99 microliters כל אחד. הוסף מיקרוליטר אחד של פתרון מלאי מולקולה קטנה לכל aliquot של ליט ולהדגר את שני הצינורות במשך 30 עד 60 דקות בטמפרטורת החדר עם רועד.
על הקרח, להקים דילול סדרתי של פתרון פרונס מופשר טרי ב 1x TNC. בעקבות הדגירה עם המולקולה הקטנה, מחלקים כל אליט ל-20 מיקרוליטרים של דגימות בחמישה צינורות. כדי להבטיח את אותו זמן עיכול, במרווחים ספציפיים של כל 30 שניות, להוסיף שני microliters של פתרונות pronase מוכן לדגימות בהתאם.
עבור קבוצת הבקרה אחת, הוסף שני מיקרוליטרים של מאגר TNC. לאחר חמש עד 20 דקות, לעצור את העיכול של ששת הצינורות באמצעות תוספת של שני microliters של קוקטייל מעכבי פרוטאז קר 20x במרווחים של 30 שניות. מערבבים היטב ודגירה על קרח במשך 10 דקות.
לדלל כל מדגם עם שישה microliters של חיץ טעינה 5x SDS-PAGE ולהרתיח את הדגימות באמבט מים ב 70 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. עכשיו, כדי לבצע כתם מערבי, לטעון כמויות שוות של חלבון לתוך הבארים של 8%SDS-PAGE ג'ל, יחד עם סמן משקל מולקולרי מתאים. הפעל את הג'ל במשך 30 דקות ב 80 וולט, ולאחר מכן להתאים את המתח ל 120 וולט ולהמשיך לרוץ במשך שעה עד שעתיים.
ודא כי המולקולה הקטנה יכולה להיקשר ישירות לחלבוני היעד הפוטנציאליים. בפרוטוקול זה, הדגירה עם המולקולה הקטנה אישרה את ההגנה מפני פרוטאוליזה. שלוש להקות נמצאו מוגנות על ידי דגירה עם rapamycin על בקרת רכב.
כתמים מערביים המחישו את נוכחותו של חלבון mTOR ביחסי פרונס לחלבון נמוכים ואת הפחתתו ואובדןו ביחסים הולכים וגדלים. פרוטאוליזה של mTOR על ידי פרונס היה מעוכב בבירור על ידי נוכחות של rapamycin ותוספת של rapamycin יצר שינוי ברור בעקומה פרוטאוליטית. Rapamycin מינון תלויה שיפרה את רמת mTOR, מה שמרמז על היציבות הגואה של mTOR עם טיפול rapamycin.
כימות של התעצמות רצועת החלבון היעד הציע כי mTOR הוא חלבון היעד של rapamycin. על מנת לקבל את האפקט הטוב ביותר צעד אחר צעד, ניסוי זה עשוי להיות חוזר על עצמו מספר פעמים כדי להשיג מגוון מתאים של pronase על יחסי חלבון.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה
מחקר זה משפר את יכולות ניתוח הנתונים של ניסוי DARTS על ידי ניטור שינויים ביציבות חלבון והערכת הזיקות של אינטראקציות חלבון-ליגנד. האינטראקציה של mTOR-רפמיצין משמשת כמקרה דוגמה לניתוח זה.
רכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביוכימיה
- פרמקולוגיה
רקע
- DARTS היא שיטה לזיהוי מטרות חלבון מולקולות קטנות.
- היא מאמתת אינטראקציות ידועות של מולקולות קטנות עם חלבון.
- DARTS יכולה לזהות מטרות חלבון פוטנציאליות עבור מוצרים טבעיים.
- אינטראקציות חלבון-ליגנד יכולות להיות ויזואליות דרך עקומות ספציפיות.
מטרת המחקר
- לשפר את ניתוח הנתונים בניסויי DARTS.
- לנטר שינויים ביציבות החלבון.
- להעריך את הזיקות של אינטראקציות חלבון-ליגנד.
שיטות ששימשו
- ניטור שינויים ביציבות החלבון.
- הערכת הזיקות של אינטראקציות חלבון-ליגנד.
- תרשים אינטראקציות על עקומות פרוטאוליטיות ועקומות תלות במינון.
- שימוש ב-mTOR-רפמיצין כמקרה מבחן.
תוצאות עיקריות
- ניתוח משופר של יציבות החלבון ב-DARTS.
- הערכה מוצלחת של הזיקות של אינטראקציות חלבון-ליגנד.
- ויזואליזציה של אינטראקציות דרך עקומות ספציפיות.
- הדגמה של השיטה באמצעות mTOR-רפמיצין.
מסקנות
- המחקר משפר את המתודולוגיה של DARTS לניתוח טוב יותר.
- ניתן לנטר ביעילות את יציבות החלבון והזיקות של האינטראקציות.
- הממצאים יכולים לסייע בזיהוי מטרות חלבון חדשות.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
The enhanced DARTS assay provides a label-free, native-state approach to validate small-molecule target engagement, supporting early-stage target de-risking. By quantifying binding affinity through proteolytic and dose-dependent curves, it enables mechanistic confidence in hit-to-lead progression. This method aids in prioritizing compounds with validated target interactions, reducing attrition due to false positives in downstream screening.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Confirms direct target engagement of small molecules like rapamycin with mTOR in native lysates.
- Operational Value: Uses unmodified compounds, avoiding artifacts from tags or labels that may alter binding.
- Predictive Value: Enables affinity estimation to triage hits based on target residence and stability shifts.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates quantitative proteolytic and dose-response curves for hit confirmation.
- Reproducibility: Standardized workflow with defined pronase titration and inhibitor quench points.
- Scalability: Compatible with multi-well formats for testing compound libraries against purified or cellular targets.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Validated target engagement in cellular lysates supports extrapolation to intact systems.
- Mechanistic De-risking: Distinguishes specific binding from nonspecific proteolysis inhibition via dose-dependent stabilization.
- Preclinical Alignment: Confirmed mTOR-rapamycin interaction provides a benchmark for pathway-targeted compound evaluation.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits between primary hit confirmation and lead optimization, offering biophysical validation before cellular functional assays.
- Discovery Biology: Tests target hypothesis by measuring ligand-induced stability shifts in native protein pools.
- Screening: Confirms target engagement of hits from biochemical or phenotypic screens using endogenous protein.
- Analytics: Provides affinity estimates from dose-dependence curves and stability changes from proteolytic profiles.
- Translational Research: Uses cellular lysates to maintain native protein complexes and post-translational states.
- Enterprise Reuse: Platform adaptable to diverse targets and ligands without reagent redesign.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Direct measurement of target stabilization enables objective assessment of ligand efficacy.
- Operational Value: Simple workflow using standard lysis, protease digestion, and Western blot infrastructure.
- Strategic Value: Reduces false advancement by confirming target binding early in the discovery cascade.
- Portfolio Impact: Supports go/no-go decisions based on quantitative target engagement metrics.
Implementation Considerations
- Requires expertise in Western blotting and quantitative band analysis.
- Dependent on access to pronase and protease inhibitor cocktails for controlled digestion.
- Needs standardization across labs for consistent pronase:protein ratios and incubation times.
- Adaptation to membrane or complex targets may require optimization of lysis conditions.
- Practical limitation: Semi-quantitative nature requires replicate runs for reliable affinity estimation.
