במחקר פונקציונלי Vivo של מחלות-הקשורים משתנים אנושיים נדירים באמצעות Drosophila ילה

פרוטוקול זה מאפשר לנו לקבוע אם גרסאות מיסנס בגנים אנושיים הקשורים למחלות משפיעות על תפקוד החלבון. קשה להשיג זאת מבחינה חישובית אפילו באמצעות אלגוריתמים חדישים. טכניקה זו מאפשרת ניתוח מהיר של גרסאות מיסנס בחלבונים אנושיים באמצעות מערכת in vivo Drosophila melanogaster שהיא מהירה וחסכונית יותר מאשר אורגניזמים מודל בעלי חוליות.

הוכחת כי גרסה ספציפית משפיעה על תפקוד החלבון תורמת ישירות לאבחון מחלות נדירות ומשמשת כנקודת מוצא לניתוח מנגנון המחלה וטיפולים פוטנציאליים. פרוטוקול זה שימושי במיוחד כאשר לומדים גרסאות הקשורות למחלות נדירות, אבל זה יכול להיות מיושם על מחלות נפוצות יותר כמו אוטיזם וסרטן. זיהוי פנוטיפים לשחזור בזבובים המשקפים את תפקוד החלבון יכול להיות מאתגר.

הפנוטיפים עשויים להשתנות מגן לגן והוא יכול להיות עדין. מחקרים פונקציונליים של גרסאות בחלבונים אנושיים באמצעות Drosophila יכול להתבצע על סמך ניסויי הצלה או מחקרי לחץ יתר. לפני תחילת ההליך, לאסוף מידע על הגן האנושי של עניין אורתולוגיות האורגניזם המודל שלה.

כדי לבדוק את פונקציית הווריאציה על-ידי דיכוי יתר של חלבונים אנושיים במערכת הראייה של הזבוב, צור זבובים מהודקים המבטאת התייחסות או וריאנטים אנושיים של cDNAs של עניין תחת שליטת רצף ההפעלה של Gal4 במעלה הזרם או מערכת UAS. כדי לבחור קו Gal4 ספציפי כדי לבטא את החלבונים האנושיים ברקמת זבוב ספציפית, לחצות שלוש עד חמש נקבות בתולה מהקו Gal4 עם שלושה עד חמישה זכרים מכל אחד הקווים הטרנסגניים CDNA אנושי UAS בבקבוקונים בודדים או כפילויות. מעבירים את הצלבים כל יומיים-שלושה כדי להשיג כמה שיותר בעלי חיים המתפתלים מצלב אחד ולבחון את החיה האקלוסית תחת מיקרוסקופ ניתוח כדי לזהות הבדלים בין ההתייחסות לזני הווריאציה.

אם קיים פגם גלוי, תדמיין את הזבובים כדי לתעד את הפנוטיפים. כדי ליצור זבובים כדי לבדוק פגמים תפקודיים במערכת הראייה, לחצות נקבות בתולה מן rhodopsin 1 Gal4 קו לזכרים עם התייחסות או גרסה UAS אנושי cDNA transgenes להביע את החלבונים האנושיים של עניין פוטורצפטורים R1 כדי R6 ברשתית לטוס. ברגע שהזבובים מתחילים להתבודד, אוספים את הצאצאים לבקבוקונים טריים ומחזירים את הבקבוקונים לאינקובטור שנקבע לטמפרטורה הניסיונית המתאימה לשלושה ימים נוספים כדי לאפשר למערכת הראייה להתבגר.

בסוף הדגירה, לשתק את הזבובים עם שיטת הרדמה מתאימה בעדינות להדביק צד אחד של כל זבוב על מגלשת מיקרוסקופ זכוכית. לאחר הקמת אסדת אלקטרורטינוגרם, מניחים נימי זכוכית 1.2 מילימטר לתוך מושך מחט ולשבור את הצינור נימי כדי להשיג שתי אלקטרודות חלולות חדות מחודדות עם פחות מ 0.5 מילימטר קטרים. מלא את נימים עם 100 תמיסת מלח מילימולר דואג להימנע בועות אוויר להחליק את נימי הזכוכית מעל אלקטרודות חוט כסף.

מהדקים את נימי הים במקום ומסתגלים לזבובים כדי להשלים את החושך לפחות 10 דקות בטמפרטורת החדר. בסוף המגורים, מניחים את השקופית המכילה את הזבובים על מנגנון ההקלטה ומזיזים את המיקרומניפולטורים הנושאים את ההתייחסות וההקלטה של אלקטרודות קרוב לעוף העניין. צפייה בקצה האלקטרודה, מניחים בזהירות את אלקטרודה הייחוס לתוך בית החזה של הזבוב חודר את קוטיקל ומ מניחים את האלקטרודה הקלטה על פני השטח של העין.

עבור הקלטות אלקטרורטינוגרם מוצלחות, יש לדאוג להחיל כמות מתאימה של לחץ על האלקטרודה הקלטה, כך שהוא גורם גומה קטנה מבלי לחדור את העין. כאשר האלקטרודות הוצבו, לכבות את האור הראשי במשך שלוש דקות כדי להתאקלם מחדש את הזבובים לסביבה האפלה. בתום תקופת ההתאקלמות מחדש, פתחו וסגרו את התריס פעם בשנייה למשך 20 שניות והקליטו את האלקטרוטרינוגרמים מלפחות 15 זבובים לשקופית לכל גנוטיפ לכל תנאי באמצעות אותן אלקטרודות.

כאשר ההקלטות מההפניה וזבובי הווריאציה הושלמו, השווה את הקלטות האלקטרורטינוגרם מההפניה, הווריאנט והפקדים כדי להעריך את ההבדלים. לאחר מכן להעריך את נתוני electroretinogram עבור שינויים על ארעיים, depolarization, את ארעיות ו repolarization. בניסוי מייצג זה, מחקרים מבוססי לחץ יתר בוצעו עבור TBX2 מאז ההתייחסות האנושית TBX2 לא הצליח להחליף באופן תפקודי את הגן זבוב אורתולוגי עושה אסטרטגיות מבוססות הצלה בלתי אפשרי.

כאשר התייחסות TBX2 האנושי היה overexpressed בעין המתפתחת וחלקים של המוח באמצעות Gal4 חסר עיניים, הלחץ יתר תוצאות קטלניות כ 85% וירידה משמעותית בגודל העין. לעומת זאת, הטרנסג'ין הגרסה פחות חזק בגרימת קטלניות וגורם לפנוטיפ עיניים קטן באמצעות אותו נהג בתנאים ניסיוניים זהים המצביעים על כך שהגרסה משפיעה על תפקוד החלבון. בנוסף, כאשר TBX2 אנושי התייחסות הוא overexpressed ב photoreceptors באמצעות rhodopsin Gal4, לחץ יתר גורם לשינוי משמעותי עקבות אלקטרורטינוגרם.

פנוטיפ זה מתון יותר כאשר החלבון גרסה באה לידי ביטוי מתן ראיות נוספות כי הווריאציה של עניין משפיע על תפקוד החלבון ב vivo. חשוב לציין כי כל גן הוא ייחודי ולכן אין ניסוי אחד שיכול להעריך את ההשפעה של כל הגרסאות הקשורות למחלות. בנוסף לעבודה עם cDNAs אנושיים, ניתן גם לקבוע אם לגרסה יש השלכות תפקודיות על ידי החדרת גרסאות אנלוגיות לשאריות שמורות אבולוציונית של גן הזבובים האורגזמי.

בשיטה זו תרמנו למספר מחקרים לגילוי גנים של מחלות אנושיות בשיתוף עם רשת המחלות הלא מאובחנים וקבוצות אחרות.