שליטה מרחבית וטמפורלית של מלנומה מורין ייזום מוטציה תאי גזע מלנוציט
7 ביוני 2019
הפרוצדורה הבאה מתארת שיטה לשליטה מרחבית וטמפורלית של ייזום גידול מלנוציטוטי בעור מוראני, באמצעות דגם עכבר מהונדס גנטית. פרוטוקול זה מתאר מאקרוסקופי כמו גם חניכה מיקרוסקופיים עורית מלנומה.
מלנומה מאובחנת באופן נרחב ברחבי העולם, עם שכיחות גוברת. פרוטוקולים אלה מאפשרים את השלבים המוקדמים של ייזום מלנומה להיות נשלט בקפידה, להקל על המחקר של הפיתוח שלה. על ידי שליטה בזמן ובמיקום של הפעלת תאי גזע מלנוציטים, יש לנו את היכולת להבחין בשינויים בתוך אוכלוסיית תאי הגזע וייזום המלנומה הזן החדש שלה.
הדגמת ההליך תהיה דאהים קים ולואיאן, סטודנטים לתואר שני מהמעבדה. יומיים עד שלושה ימים לפני תחילת ההליך, השתמש גוזם חשמלי לגלח את העור הגבי מכל עכבר הרדמה בן שבעה שבועות. ביום הניסוי, השתמש ספוגית כותנה להחיל שכבה דקה של קרם depilatory על העור החשוף.
לאחר הקרם כבר מיושם באופן שווה, להשתמש במטליות כותנה נקיות כדי להסיר את השמנת, ואחריו ניגוב עדין עם מטלית לחה כדי להסיר כל קרם שיורית. ואז להחזיר כל עכבר לכלוב הבית שלה עם ניטור עד החלמה מלאה. להקרנת UV-B, מכסים את העור הגבי בחומר מגן UV-B כך שרק האזור הרצוי ייחשף, ומכסים את תא ה- UV במכסה עמיד בפני UV.
לאחר מכן הפעל את מנורת UV-B כדי להקרנת העכבר לתקופת הזמן הניסיונית המתאימה לפני החזרת העכבר לכלוב ריק עם ניטור עד להחלמה מלאה. כדי לבודד את דגימות העור, השתמש גוזם חשמלי כדי להסיר כל שערה מאזור העור הגבי של העכברים מוקרנים המתת חסד, ולהבריש קלות את העור החשוף עם רקמה ללא מוך כדי לנקות את האזור. בצע חתך קטן עם מספריים חדים ממש מעל בסיס הזנב והכנס מספריים גדולים וקהים לחתך כדי להפריד את רקמות החיבור התת עוריות.
באמצעות מספריים חדים, לחתוך בזהירות לאורך קצה אזור העור של עניין לבודד את דגימת הרקמה ומניחים את רקמת העור excised על מגבת נייר נקי. לאחר מכן השתמש מטלפים עמומים כדי למתוח את העור, כך שהוא דבק במגבת והוא מתוח. כאשר כל הדגימות נקצרו, מניחים דגימת עור ומגבת נייר בחזרה לתוך פיסת נייר מסנן מקופל מיד סמוך לקמט, דואג כי המדגם הוא חלק ולא מקופל או מקומט.
סגור את צידי נייר הסינון עם סיכות הידוק וקצץ את הנייר. לאחר מכן תוכלו להטביע את הדגימות בפורמלין חיץ ניטרלי של 10% למשך שלוש עד חמש שעות בטמפרטורת החדר לפני שטיפת הרקמות עם שתי שטיפות של חמש דקות במים מיונים. לאחר הכביסה השנייה, להסיר בזהירות כל חומר שיורית מרקמות העור, לקצץ את הקצוות של הדגימות, כך שהם לא משוננים.
לאחר מכן, בצע שלושה חתכים קשתיים בכל מדגם, כך רוחב הרצועות הוא לא יותר מחמישה מילימטרים, ולעשות חתכים רוחביים, כך הדגימות הם לא יותר מ 20 מילימטרים רוחב. מקם תבנית קריו המכילה טמפרטורת חיתוך אופטימלית או מדיום OCT בכיוון לאורך, והצב ארבע עד חמש חתיכות עור על גבי OCT. כאשר כל החלקים נמצאים במקום, להשתמש בשני זוגות של מדפים עדין להביא את הקצה הארוך של כל פיסת עור לתחתית עובש cryo, כך הדגימות הן אנכיות בתוך OCT בניצב לבסיס התבנית.
לאחר מכן מלאו את התבנית ב- OCT נוסף בשפה השנייה וה מניחים את התבנית על משטח שטוח של חתיכת קרח יבש, תוך שימוש במטחנים כדי להתאים את כל חתיכות העור שאולי עברו במהלך ההעברה כאשר הבלוק מתחיל לקפוא לפי הצורך. כאשר עכברים הם שבעה שבועות לאחר הלידה, העור הגבי שלהם הוא בטלוגן. במהלך טלוגן, זקיק השיער ותאי גזע מלנוציטים ידועים להיות במצב מנוחה רזה, ואת העור צריך להראות שום צמיחת שיער משמעותית לאחר הגילוח.
דפילציה כימית, עם זאת, יכול לגרום להפעלת תאי גזע זקיק השיער, גרימת צמיחת שיער משמעותית בתוך האזור של עניין. כמו depilation כימי יכול לגרום באופן משמעותי את ההפעלה של זקיק השיער ותאי גזע מלנוציטים, תאי גזע מלנוציטים נוטה מלנומה במצב פעיל יכול ליצור גידולים חניכה מלנומה מיקרוסקופית ניתן לראות בתוך שבועיים של depilation כימי. הקרנה UV-B יכול גם לגרום חניכה הגידול מן ההפוגה, גידול נוטה מלנוציטים תאי גזע.
חשוב לציין, UV-B גורם טרנסלוקציה ישירה של תאי גזע מלנוציטים מן נישה תאי גזע זקיקי שלהם האפידרמיס בין הזקיקים. יתר על כן, UV-B יכול לגרום תאי גזע מלנוציטים שמקורם היווצרות מלנומה עורית לאורך האפידרמיס interfollicular. בדומה לעור הגבי, חניכת מלנומה הנגרמת על ידי UV-B ניתן לראות בעיקר באזורי עור אחרים, כגון עור האוזן.
ואכן, בהשוואה לעור האוזן שליטה, מכוסה בד עמיד UV, עור האוזן חשוף UV-B מדגים פיגמנטציה גבוהה יותר בשל נטל גבוה יותר של חניכת מלנומה. מינונים שונים של UV-B עשויות להיות השפעות שונות על העור של העכבר ופעילות melanocyte. לכן, חשוב לקבוע ולייעל את מינון ההקרנה לפני תחילת הניסוי.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מתאר שיטה לבקרה מרחבית וזמנית על התחלת גידולים מלנוציטיים בעור הגב של עכברים, באמצעות מודל עכברים מהונדס גנטית. הפרוטוקול מקל על חקר התפתחות המלנומה על ידי בקרה על הפעלתן של תאי גזע מלנוציטיים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מחקר על מלנומה
- מודלים של עכברים מהונדסים גנטית
- הפעלת תאי גזע
רקע
- שיעורי האבחנה של מלנומה עולים ברחבי העולם.
- הבנת השלבים המוקדמים של התפתחות המלנומה חיונית לפיתוח טיפולים.
- שליטה על עיתוי ומיקום הפעלת תאי גזע מסייעת למחקר.
- מחקר זה משתמש בגישה חדשנית כדי לצפות בשינויים באוכלוסיות של תאי גזע.
מטרת המחקר
- מתן פרוטוקול מפורט ליצירת מלנומה בעכברים.
- בחינת הדינמיקה של תאי גזע מלנוציטים במהלך התחלת גידול סרטני.
- העמקת ההבנה של מנגנוני התפתחות המלנומה.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- גילוח העור הגבי של עכברים הרדומים.
- מריחת קרם להסרת שיער לחשיפת העור.
- ניטור השפעתו של תהליך ההפעלה של תאי גזע של מלנוציטים.
- שימוש במודל עכברים מהונדס גנטית לשם בקרה מדויקת.
תוצאות עיקריות
- השראה מוצלחת של מלנומה בתנאים מבוקרים.
- תצפית על שינויים באוכלוסיית תאי הגזע.
- הדגמת הפרוצדורה על ידי סטודנטים לתארים מתקדמים.
- סיוע למחקרים נוספים על התפתחות מלנומה.
מסקנות
- השיטה מאפשרת מחקר מפורט של תחילת היווצרות המלנומה.
- שליטה על הפעלת תאי גזע היא קריטית לצורך המחקר.
- גישה זו עשויה להוביל לתובנות חדשות לגבי הביולוגיה של המלנומה.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
שליטה מרחבית וזמנית על התחלת מלנומה במודלים של עכברים מאפשרת חקירה מדויקת של אירועים אונקוגניים מוקדמים בתאי גזע של מלנוציטים. יכולת זו תומכת בהסרת סיכונים מכניסטיים ובתיקוף מטרות בנקודת המפנה המוקדמת ביותר בגילוי מלנומה. גישה זו מגבירה את הביטחון החזוי עבור מחקר תרגומי ותיעוד תיקי פיתוח במחקר ופיתוח של אונקולוגיה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר השראה מבוקרת של טרנספורמציה אונקוגנית בתאי גזע של מלנוציטים לצורך מחקרים מונחי השערה.
- מסייע בהורדת סיכונים מכניסטיים באמצעות בידוד ההשפעות של גורמים גנטיים וסביבתיים ספציפיים.
- תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרות על ידי קישור מצבי הפעלה של תאי גזע לתוצאות של התחלת גידול.
- מספק פלטפורמה להערכת אסטרטגיות התערבות מוקדמת למניעת מלנומה.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מכונן מערכות in vivo הדירות לצורך סריקה של חומרים מניעתים או טיפוליים בשלבים הבאים.
- מסטנדרט את מצבי ההפעלה הביולוגיים, ובכך משפר את יכולת ההשוואה בין בדיקות ואת מהימנות הפלט הכמותי.
- מאפשר התרחבות (scalability) בהערכת תרכובות על ידי סנכרון אירועי התחלת הגידולים בקרב קבוצות הניסוי.
- תומך בפיתוח מדדים (readouts) חסונים עבור סמני ביולוגים של מלנומה בשלב מוקדם.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאם מודלים פרה-קליניים עם מנגנוני התחלה רלוונטיים למחלה הנצפים במלנומה אנושית.
- מקל על הרציפות משלב הגילוי ועד לאישור פרה-קליני באמצעות מידול של אירועים תומוריגניים מוקדמים.
- מאפשר קבלת החלטות על קידום מותאמי-סיכון המבוססות על תובנות מנגנוניות לגבי התחלת הגידול.
- תומך בזיהוי של ביומרקרים תרגומיים הקשורים להפעלה של תאי גזע ולהופעת מלנומה.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
שיטה זו משתלבת בממשק שבין שלבי הגילוי המוקדמים למחקר הפרה-קליני, ומגשרת בין תיקוף המטרה לזיהוי מובילים (lead identification) עבור טיפולים במלנומה.
- ביולוגיה של גילוי: מספקת פלטפורמה לבדיקת היפותזות על תפקידה של הפעלת תאי גזע בייזום מלנומה.
- סריקה: מספקת מודלים סטנדרטיים וניתנים לשחזור לצורך הערכה כמותית של יעילות התערבות.
- אנליטיקה: מאפשרת מדידה של תדירות ייזום הגידול, שינויים בפיגמנטציה וההפצה המרחבית של נגעים.
- מחקר תרגומי: מקשרת בין אירועים מכניסטיים מוקדמים לבין סממנים קליניים פוטנציאליים ונקודות התערבות.
- שימוש חוזר ארגוני: מציע מערכת in vivo שמישה חוזרת למחקרים מכניסטיים וטיפוליים מגוונים במחקר המלנומה.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית במחקרי התחלת מלנומה.
- ערך תפעולי: משפר את הסטנדרטיזציה, השחזוריות והיכולת להרחבה (scalability) של פרוטוקולים להתחלת גידולים in vivo.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת החלטות go/no-go ואת יעילות ההון על ידי מתן אפשרות להערכה מוקדמת של סיכונים ביולוגיים.
- השפעה על פורטפוליו: תומך בתיעדוף מותאם סיכונים ובקידום תוכניות למניעה והתערבות במלנומה.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בטיפול בעכברים, ביולוגיה של תאי גזע ובניית מודלים של גידולים in vivo.
- נדרשת גישה לציוד הקרנה ב-UV-B ולפרוטוקולי מינון מדויקים לצורך הדירות (reproducibility).
- נדרשת סטנדרטיזציה בין צוותים של נהלי הסרת שיער והקרנה כדי להבטיח השוואתיות של הנתונים.
- התאמה לאזורי עור אחרים או לרקעים גנטיים שונים עשויה לדרוש אופטימיזציה של הפרוטוקול.
- אופטימיזציה של מינון ותזמון ה-UV-B היא קריטית כדי למנוע השפעות מטעות על פעילות המלנוציטים.
