Name: שליטה מרחבית וטמפורלית של מלנומה מורין ייזום מוטציה תאי גזע מלנוציט (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-07T14:45:00.000+00:00
Duration: 6 min 9 s
Description: למד שיטה לשליטה מרחבית וטמפורלית בייזום מלנומה בעור הגב של עכברים באמצעות מודל גנטי מהונדס. הפרוטוקול מאפשר מחקר מדויק של הפעלת תאי גזע מלנוציט והתפתחות הגידול.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכת על ידי Office של עוזר מזכיר ההגנה לענייני בריאות, באמצעות התוכנית לחקר הסרטן שנסקרו עמית תחת הפרס W81XWH-16-1-0272. דעות, פרשנויות, מסקנות והמלצות הן אלה של המחברים ואינן בהכרח מיוחסות על-ידי משרד ההגנה. עבודה זו הייתה נתמכת גם על ידי מענק זרע מהתוכנית הגזע קורנל לייט. H. Moon נתמך על ידי מרכז קורנל על תוכנית המלומדים בעלי חוליות גנומיקה.

כל ההליכים בעלי החיים מבוצעים בהתאם לטיפול בבעלי חיים מוסדיים באוניברסיטת קורנל ולהשתמש בוועדה (IACUC).
1. הכנה
<ol><li>
לאסוף קטעי זנב מ 12 יום עכברים לידתיים ולעכל ב 400 μL של 0.05 N NaOH ב 95 ° צ' עבור 1 h. מערבולת ולהוסיף 32 μL של 1 M טריס-HCl, pH 7. עכברים גנוטיפ על פי פרוטוקולי ה-PCR שסופקו דרך המעבדה ג'קסון ולזהות עכברים עם גנוטיפ של ריבית6. - Tyr-creer – hemizygous (+/creer) - Lsl-BrafV600E – heterozygous (+/Lsl-v600e) - Pten – homozygous flox (flox/flox) - Lsl-tdTomato – hemizygous (+/ליטר) הערה: רצפים פריימר מסופקים ברשימת חומרים.</li>
	<li>השתמש בקוצץ שיער (קוצץ חשמלי) כדי לגלח את העור הקודם 2 עד 3 ימים לפני כל הניסויים המתוארים להלן, וכאשר עכברים הם כ -7 שבועות של גיל. לדאוג לא לפגוע בעור העכבר הדק באמצעות הקוצץ החשמלי כמו כל פציעה עלולה לעורר תגובה ריפוי הפצע אשר יפעיל את השיער זקיק גזע תאים, כולל MCSCs.</li>
	<li>קבע אם מחזור השיער הוא בתוך הזמן והאם העור נפצע במהלך תקופת ההמתנה. אם העור מראה סימן כלשהו לפציעה, אין להשתמש בעכבר להליכים אלה. הערה: למרות שמחזור השיער עשוי להיות מעט שונה בין הרקעים הגנטיים, בגיל זה מחזור השיער בעור העורבן הוא בדרך כלל במצב הטלנוגן11. The Tyr-CreER הגנטי יהיה יעד MCSCs בעור טלעוגן, ואת השינויים הגנטיים הבאים יהיה להתבטא לצמיתות בכל שלדורות של mcsc, כולל גידולים מלנוציטים ומלנוציטוטיק.</li>
</ol>2. טיפול טמוקסיפן לקומבינציה גנטית של היצור-לקס
<ol><li>
הכנת טמוקסיפן עבור הזרקת הצפק (IP) או ניהול אקטואלי עבור שילוב גנטי מערכתי או מקומי מחדש הערה: על מנת טמוקסיפן כדי לגרום שילוב חוזר, זה חייב להיות מטבוליזם על ידי הכבד ל 4-הידרוקסימטפן (4-OHT), אשר יכול לאגד ולהפעיל את Creer. יישום מקומי של טמוקסיפן לא יהיה חילוף חומרים בדרך זו ו 4-OHT חייב לשמש ישירות. רק שיטה אחת של משלוח טמוקסיפן נדרש עבור שילוב מספיק מחדש.<ol>
<li>טממוקסיפן: מכינים טממוקסיפן בריכוז של 10 מ ג-1 מומס בשמן תירס. כדי לסייע פירוק התרופה לתוך פתרון, להוסיף עד 10% נפח הכולל של 100% אתנול כיתה מולקולרית תרופה בצורת אבקה, מערבולת עבור 3 דקות ולאחר מכן להוסיף את הנפח הנותר של שמן תירס. המשך למערבולת עד שהחומר הגבישי אינו גלוי עוד בפתרון. פתרון טמוקסיפן ניתן לעקר על ידי עובר דרך מסנן יקרומטר 0.2. . המשך לשלב 2.2.1 לטיפול</li>
		<li>4-OHT: להכין פתרון מניות של הידרוקסיטמוקסיפן עד 3 מ"ג mL-1 ב 100% אתנול. לאחר מכן, ניתן ליישם פתרון עובד ככל הנדרש כדי לכסות את אזור העור של הריבית (בדרך כלל יישום יחיד). הערה: פתרון מניות של הידרוקסיטמוקסיפן יכול להיות מומס ב 100% אתנול עבור ריכוז סופי של 5 מ"מ. לאחר מכן, כדי להכין פתרון עובד, 5 μL של פתרון מניות 4OH-tamoxifen ניתן מדולל לתוך 15 μL של 100% אתנול. עבור 4 מ"מ2 שטח, 1 עד 3 μl של פתרון העבודה ניתן להחיל למריחה על הסביבה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
טיפול בעכברים עם טמוקסיפן או מערכתית או למריחה על העיצוב
	<ol>
<li>עבור טיפול סיסטמי, מנהל 2 מ"ג טמוקסיפן דרך הזרקת IP פעם ביום עבור 3 ימים באמצעות מחט G 26. הערה: באמצעות מודל זה, כ 93% ± 4% של השקט MCSCs מתויגים עם tdTomato6.</li>
		<li>להפעלה אזורית, בצע טיפול מקומי אחד עם 4-OHT. כסו את תחום העור המעניין בפתרון העבודה. ניתן לקבוע את כמות פתרון העבודה לפי גודל אזור הריבית כפי שמתואר בשלב 2.1.2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>ב 48 h בעקבות המינון האחרון של טמוקסיפן, המשך לשלב 3 עבור הגידול הכימי להסרת שיער המושרה או לשלב 4 עבור UV-B המושרה ליזום גידול</li>
</ol>3. להסרת שיער כימית
<ol><li>לצייד חדר טיפול בעכבר המכיל מערכת isof, עם החומרים הנדרשים הבאים: קרם הסרת שיער, שקיות צמר, מטלית נייר, ומים.</li>
	<li>מניחים את העכבר לתוך התא אינדוקציה מורדם עם 3.5 כדי 4.5% isofלאנה ו 1 L/min חמצן.</li>
	<li>לאחר שקצב הנשימה התייצב, לאשר את העכבר הוא במישור הנכון של הרדמה על ידי ביצוע צביטה הבוהן ולהעביר את העכבר לצינור הראשי שמירה על הרדמה עם 1 כדי 1.5% isofלהקה ו 1 L/min חמצן. להחיל משחה העין כדי לשמור על העיניים מפני ייבוש תוך הרדמה.</li>
	<li>השתמש בספוגית כותנה כדי להחיל שכבה דקה של קרם הסרת שיער לאזור מגולח של העור העכבר.</li>
	<li>ברגע שהקרם הוחל באופן שווה, השתמש בדגימות כותנה נקיות כדי להתחיל בהסרה. הזמן הכולל שהקרם במגע עם העור לא יעלה על 1 דקות.</li>
	<li>לנגב בעדינות את העור במטלית נייר לחה ולהבטיח כי כל קרם שיורית הוסר. הערה: קרם להסרת שיער יכול לגרום לגירוי בעור אם הוא לא מוסר לחלוטין. עכברים מסוימים, כגון אלה על רקע C57BL/6, יכול להיות נוטה לפתח דרמטיטיס12. למרות נדיר, כמה בעלי חיים יפתחו דרמטיטיס בתוך 24 שעות לאחר הסרת השיער קרם יישום או להסרת שיער מכני. הקפד לבדוק את העכברים יום לאחר הטיפול כדי לחפש סימנים של גירוי בעור האזורי.</li>
	<li>הסירו את פירי השיער שהוסרו ואת כל החומרים ששימשו לתוך תא בידוד.</li>
	<li>מניחים את העכבר לתוך כלוב העכבר ריק, נקי עד ההרדמה יש לבשו.</li>
	<li>. החזר את העכברים לכלובים שלהם</li>
</ol>4. UV-B הקרנה
<ol><li>צייד חדר טיפול בעכבר המכיל מערכת isof, עם החומרים הנדרשים הבאים: UV-B מערכת אור, UV-B מטר אור, כיסוי מגן על העכבר, נוסף UV-B הגנה לחוקר, ו טיימר.</li>
	<li>עכברים צריכים להיות לקרינה במינון UV-B של ריבית (כלומר, 0-180 mJ/cm2). השתמש במד אור UV-B כדי לקבוע את אורך הזמן המתאים כדי להאיר את העכברים. הערה: mW/cm2 x זמן = מינון</li>
	<li>. לדבר עם העכבר בעזרת מלגלית בעוד בחדר האינדוקציה, להשתמש 3.5 כדי 4.5% isofלאנה ו 1 L/min חמצן.</li>
	<li>ברגע העכבר מיוצב, לאשר תופעות הרדמה עם צביטה בבוהן ולהעביר את העכבר לצינור ההרדמה הראשי הממוקם בחדר UV. להחיל משחה העין כדי למנוע את העיניים מהתייבשות בזמן הרדמה. שמרו על הרדמה עם 1 עד 1.5%. וחמצן 1 L/דקות</li>
	<li>לכסות את העור הגבי עם חומר הגנה UV-B, כך שרק האזור הרצוי יהיה חשוף. הערה: בשלב זה, יש לעשות שימוש ב-PPE המתאים. משך הזמן הדרוש כדי לפרק את העכבר תלוי בעוצמת הנורה המשמש, אבל הרדמה אולי צריך להיות מנוטרים אם הזמן הנדרש עולה על 30 s.</li>
	<li>מכסים את תא UV באמצעות מכסה עמידות UV או כל חומרים מתאימים אחרים.</li>
	<li>הפעל את מנורת UV-B והקרין את העכבר במשך הזמן שנקבע על ידי חוקרים עבור המטרה הספציפית.</li>
	<li>כבה את מערכת UV ו-isofלאנה, ואז למקם את העכבר על כלוב העכבר ריק עד ההרדמה יש לבשו.</li>
	<li>. החזר את העכברים לכלובים שלהם</li>
</ol>5. עיבוד רקמה
<ol><li>
בידוד עור
	<ol>
<li>השג את הפרטים הבאים לפני תחילת העבודה: מכשירי נקרופסי, נייר סינון ומגבות נייר.
</li>
		<li>המתת חסד העכברים לפי פרוטוקולים IACUC שאושרו, ולאשר את המוות לפני שתמשיך.</li>
		<li>משתמשים בקוצץ שיער, מגלחים. את כל השערות מאזור העור מצחצח בקלילות את האזור ברקמה נטולת מוך כדי לפנות את האזור.</li>
		<li>לעשות חתך קטן עם מספריים חדים ממש מעל הבסיס של הזנב.</li>
		<li>הוסף מספריים בוטים גדולים לתוך החתך ולהפריד את רקמות החיבור התת עורי.</li>
		<li>לבודד בזהירות את אזור העור של עניין על ידי גזירה עם מספריים חדים לאורך קצה הרקמה.</li>
		<li>מניחים את רקמת העור על מגבת נייר נקייה להשתמש מלקחיים עמום כדי למתוח את העור כך שהוא דבק המגבת והוא לימד. שלב זה משמש למתן תמיכה נוספת לרקמות כך שניתן יהיה לתמרן ולעבד אותה תוך שמירה על צורתו. הערה: להיזהר רק לטפל באזורים החיצוניים של רקמת העור, כמו מלקחיים עלול לגרום נזק לעור אשר ניתן לראות היסטולוגית.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
קיבוע רקמות
	<ol>
<li>מקפלים פיסת נייר סינון במחצית ומתייג בהתאם. מניחים את העור יחד עם גיבוי מגבת נייר לתוך הנייר המקופל הצמוד מיד לקמט, להבטיח כי המדגם הוא חלק ולא מקופל או מקומט. אטום את נייר הסינון על-ידי הידוק הצדדים הפתוחים ולאחר מכן קצץ כך שניתן יהיה להשתמש בנייר הנותר לדגימות עתידיות. הערה: שלב זה מבוצע כך העור שומר על צורתו במהלך הקיבעון.</li>
		<li>יש להטביע במלואו את דגימת הרקמה ב-10% מחסן ניטרלי באגירה עבור 3 עד 5 שעות בטמפרטורת החדר או לילה ב -4 ° c.</li>
		<li>בעקבות קיבעון, להסיר את הדגימות מתוך formalin, לשטוף במים מוכי (2x, 5 דקות כל אחד) ולהמשיך לעשות בלוקים רקמות. הסירו בזהירות כל חומר שרידי מרקמת העור (כלומר, נייר שיורית).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
ביצוע בלוקים רקמות קפואות (איור 1)
	<ol>
<li>חתוך את הקצוות של דגימת העור כך שהם לא משוננים ולאחר מכן לבצע 3 חתכים משונן. רוחב של רצועות אלה לא צריך להיות יותר מאשר הגובה של cryomold (5 מ"מ). הבא, לעשות חתכים רוחבי יש פיסות העור אשר אינם ארוכים יותר מאשר ברוחב של cryomold (20 מ"מ) והוא יכול להיות מוטבע. חזרו עם החצי הנותר של העור הקודם, או שמרו את הרקמה לשימושים אחרים (לסירוגין, שמרו חצי לפני הקיבעון). הערה: חשוב לשמור על חלקי העור בכיוון הנכון.</li>
		<li>אוריינט the cryomold (25 x 20 x 5 מ"מ3) בכיוון לאורך ובמקום 4 כדי 5 פיסות עור על גבי OCT. פעם כל החלקים נמצאים במקום, להשתמש 2 זוגות של מלקחיים עדינים כדי להביא את הקצה הארוך של העור אל החלק התחתון של cryomold. העור צריך עכשיו לעמוד ב-OCT בניצב לבסיס העובש. דאג למזער את היווצרות כיסי האוויר בתוך ה-OCT במהלך שלב זה (איור 1).</li>
		<li>ממלאים את העובש עם OCT אל השפה השנייה, ומניחים על המשטח השטוח של הקרח היבש. מלקחיים להשתמש כדי להתאים את כל חלקי העור שייתכן שזזו במהלך ההעברה כמו הבלוק מתחיל להקפיא. לאחר השכבה התחתונה מתחזק, מניפולציה של רקמות יהיה בלתי אפשרי.</li>
		<li>גזור 8-10 יקרומטר שקופיות לניתוח.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
ביצוע Formalin קבוע פרפין מוטבע (FFPE) רקמה בלוקים
	<ol>
<li>מקום 2 חתיכות של עור קבוע לתוך קלטת בתווית ומייבשים בריכוזים הגוברת של אתנול (75% אתנול עבור 30 דקות, 85% עבור 30 דקות, 90% עבור 30 דקות, 95% עבור 30 דקות, 100% עבור 2x 30 דקות, מחליף את הפקודה קסילן או קסילן עבור 2x 30 דקות). דגירה עם פרפין ב 58-60 °, הראשון 30 דקות, ולאחר מכן לילה.</li>
		<li>להטביע את הרקמה 24 x 24 מ"מ2 כייר רקמת פלדת אל-חלד עם פרפין נוזלי ולגבש ב-5 ° c. התמצאות רקמות צריך להיות דומה לזה של גושי רקמה קפואים כך סעיפים האורך על פני זקיקי שיער מרובים יכולים להיות דמיינו (איור 1).</li>
		<li>לאחר הפרפין התחזק, להסיר את העובש לחתוך לתוך 5-10 יקרומטר סעיפים לניתוח.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Wernli, K. J., Henrikson, N. B., Morrison, C. C., Nguyen, M., Pocobelli, G., Blasi, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+for+skin+cancer+in+adults%3A+updated+evidence+report+and+systematic+review+for+the+US+preventive+services+task+force%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+the+American+Medical+Association%22%5BJournal%5D)">Screening for skin cancer in adults: updated evidence report and systematic review for the US preventive services task force.</a> The Journal of the American Medical Association. 316 (4), 436-447 (2016).</li>
<li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+statistics%2C+2018%5BTitle%5D)+AND+%22CA%3A+A+Cancer+Journal+for+Clinicians%22%5BJournal%5D)">Cancer statistics, 2018.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (1), 7-30 (2018).</li>
<li>White, A. C., Lowry, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Refining+the+role+for+adult+stem+cells+as+cancer+cells+of+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Refining the role for adult stem cells as cancer cells of origin.</a> Trends in Cell Biology. 25 (1), 11-20 (2015).</li>
<li>Moon, H., Donahue, L. R., White, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+cancer+cells+of+origin+in+cutaneous+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Understanding cancer cells of origin in cutaneous tumors.</a> Cancer Stem Cells. , 263-284 (2016).</li>
<li>Blanpain, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracing+the+cellular+origin+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Tracing the cellular origin of cancer.</a> Nature Cell Biology. 15 (2), 126-134 (2013).</li>
<li>Moon, H., Donahue, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melanocyte+stem+cell+activation+and+translocation+initiate+cutaneous+melanoma+in+response+to+UV+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Melanocyte stem cell activation and translocation initiate cutaneous melanoma in response to UV exposure.</a> Cell Stem Cell. 21 (5), 665-678 (2017).</li>
<li>Moon, H., White, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+path+from+melanocyte+stem+cells+to+cutaneous+melanoma+illuminated+by+UVB%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Oncology%22%5BJournal%5D)">A path from melanocyte stem cells to cutaneous melanoma illuminated by UVB.</a> Molecular & Cellular Oncology. 5 (2), e1409864(2018).</li>
<li>Rabbani, P., Takeo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinated+activation+of+Wnt+in+epithelial+and+melanocyte+stem+cells+initiates+pigmented+hair+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Coordinated activation of Wnt in epithelial and melanocyte stem cells initiates pigmented hair regeneration.</a> Cell. 145 (6), 941-955 (2011).</li>
<li>Chou, W. C., Takeo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+migration+of+follicular+melanocyte+stem+cells+to+the+epidermis+after+wounding+or+UVB+irradiation+is+dependent+on+Mc1r+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Direct migration of follicular melanocyte stem cells to the epidermis after wounding or UVB irradiation is dependent on Mc1r signaling.</a> Nature Medicine. 19 (7), 924-929 (2013).</li>
<li>Keyes, B. E., Segal, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nfatc1+orchestrates+aging+in+hair+follicle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Nfatc1 orchestrates aging in hair follicle stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (51), E4950-9 (2013).</li>
<li>Müller-Röver, S., Handjiski, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+guide+for+the+accurate+classification+of+murine+hair+follicles+in+distinct+hair+cycle+stages%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">A comprehensive guide for the accurate classification of murine hair follicles in distinct hair cycle stages.</a> The Journal of Investigative Dermatology. 117 (1), 3-15 (2001).</li>
<li>Kastenmayer, R. J., Fain, M. A., Perdue, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+retrospective+study+of+idiopathic+ulcerative+dermatitis+in+mice+with+a+C57BL%2F6+background%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Association+for+Laboratory+Animal+Science%E2%80%AF%3A+JAALAS%22%5BJournal%5D)">A retrospective study of idiopathic ulcerative dermatitis in mice with a C57BL/6 background.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science : JAALAS. 45 (6), 8-12 (2006).</li>
<li>Vultur, A., Herlyn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SnapShot%3A+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">SnapShot: melanoma.</a> Cancer Cell. 23 (5), 706-706.e1 (2013).</li>
<li>Dankort, D., Curley, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Braf%28V600E%29+cooperates+with+Pten+loss+to+induce+metastatic+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Braf(V600E) cooperates with Pten loss to induce metastatic melanoma.</a> Nature Genetics. 41 (5), 544-552 (2009).</li>
<li>Viros, A., Sanchez-Laorden, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultraviolet+radiation+accelerates+BRAF-driven+melanomagenesis+by+targeting+TP53%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ultraviolet radiation accelerates BRAF-driven melanomagenesis by targeting TP53.</a> Nature. 511 (7510), 478-482 (2014).</li>
</ol>

המחברים לא מצהירים. על ניגוד אינטרסים

ההיכר שינויים גנטיים לעתים קרובות למצוא גידולים מלנומה עורית כבר תיאר היטב13. המוטציה הדומיננטית ביותר הנהג הוא BrafV600E, ומודל מהונדסים גנטית העכבר עבור brafV600E-תיווך מלנומה נוצר על ידי קבוצת Bosenberg14 והופקד במעבדה ג'קסון. באמצעות מודל זה של העכבר, המחקר האחרון שלנו הפגינו את הדרישה של הפעלה תאית של MCSCs מועדת הגידול עבור חניכה משמעותית של BrafV600E-תיווך מלנומה בעור הרכה6.
<p cl...

מלנומה, הצורה המממנת של גידולים מלנולוציפטיים, הוא הסרטן האגרסיבי ביותר בעור עם מלנומה עורית אחראי על רוב מקרי המוות של סרטן העור1. בארצות הברית, מלנומה מאובחנת בדרך כלל; הוא הוקרן להיות 5 עד 6th הסרטן הנפוץ ביותר בקרב המקרים המשוער סרטן חדש ב 20182. יתר על כן, בעוד מקרי סרטן הכולל הראו את המגמה של צמצום הדרגתי בעשורים האחרונים, מלנומה עורית שיעור שיעור במהלך העשורים האחרונים להפגין עלייה רציפה ומהירה בשני המינים2.
כדי להילחם מלנומה עורית ביעילות רבה יותר, חשוב להבין בבירור את האירועים המוקדמים של פיתוח מלנומה מתאי המוצא שלהם לזהות טוב יותר קלינית שיטות מניעה יעיל. ידוע כיום כי בתאי גזע בוגרים יכולים לתרום באופן משמעותי להיווצרות הגידול כמקורות הסלולר של סרטן בסוגים רבים ושונים של איברים כולל רקמות העור3,4,5. באופן דומה, מבוגרים תאי גזע מלנוציט (MCSCs) בעור המורין הישן יכול לעבוד כתאי מלנומה של המקור על הפעלה חריגה של Ras/חיל הארץ ו akt מסלולים6. עם זאת, אלה מוטציות אונגניים לבד אינם מסוגלים ביעילות לגרום להיווצרות הגידול מן השקט MCSCs. גידולים מלנולוציפטיים בסופו של דבר להתפתח כאשר MCSCs להיות פעיל במהלך רכיבה על שיער טבעי. עם זאת, בפרוטוקול זה, נתאר שיטות כדי לגרום באופן מלאכותי הפעלה תאית של MCSCs מועדת הגידול, ובכך להקל על שליטה מדויקת של חניכה מלנומה6,7.
באמצעות השיטות המתוארות כאן, שליטה מרחבית וטמפורלית של חניכה מלנומה עורית מפני גידול MCSCs ביטוי אונגניים BrafV600E יחד עם אובדן של ביטוי pten ניתן לבצע בהצלחה, כמו שאנחנו דיווחו בעבר על6. שיטה זו משלבת ממצאים קודמים כי הפגנת שיער זקיק גזע הפעלה של תא דרך הסרת שיער כמו גם איך חשיפה של העור murine ל-UV-B יכול להקל על ההפעלה של MCSCs תושב זקיק השיער וטרנסלוקציה של הסלולר הזה אוכלוסיית המשנה לאפידרמיס הפוליקולרית6,8,9,10. אלה במערכות מודל vivo יכול לספק מידע חשוב לגבי איך שינויים פיסיולוגיים וסביבתיים יכולים לשנות את הסטטוס התאי של מלנומה נוטה MCSCs, אשר בתורו יכול לגרום לחניכה משמעותית של מלנומה בעור.

<table><tbody><tr><td>טמוקסיפן</td><td>סיגמא</td><td>T5648-1G</td><td>להזרקה מערכתית</td></tr><tr><td>טמוקסיפן</td><td>קיימן כימי</td><td>13258</td><td>להזרקה מערכתית</td></tr><tr><td>שמן תירס</td><td>סיגמא</td><td>45-C8267-2.5L-EA</td><td></td></tr><tr><td>4OH-טמוקסיפן</td><td>סיגמא</td><td>H7904-25MG</td><td>לטיפול מקומי</td></tr><tr><td>26 גרם 1/2 אינץ' מחטים</td><td>שונות</td><td></td><td>בדרגה</td></tr> <tr>וטרינרית<td>1 מ"ל מזרק</td><td>שונים</td><td></td> גוזם שיער לחיות מחמד <td>בדרגה וטרינרית</td></tr><tr><td></td><td>Wahl</td><td>09990-502</td><td></td></tr><tr><td>קרם להסרת שיער</td><td>Nair</td><td>n/a</td><td>זמין ברוב בתי המרקחת</td></tr><tr><td>צמר גפן ספוגיות</td><td>שונות</td><td></td><td></td></tr><tr><td>נורה אולטרה סגולה</td><td>UVP</td><td>95-0042-08</td><td>דגם XX-15M מנורת UV בינונית</td></tr><tr><td>200 הוכחה אתנול</td><td>שונים</td><td></td><td>אתנול טהור</td></tr><tr><td>Histoplast PE</td><td>Fisher Scientific</td><td>22900700</td><td>כדורי פרפין</td></tr><tr><td>פורמלין ניטרלי חוצץ, 10%</td> <td>סיגמא</td><td>HT501128-4L</td><td></td></tr><tr><td>Clear-Rite 3</td><td>Thermo Scientific</td><td>6901</td><td>תחליף קסילן</td></tr><tr><td>O.C.T. תרכובת</td><td>תרמו</td><td>23730571</td><td></td></tr><tr><td>קלטת רקמות</td><td>סאקורה</td><td>89199-430</td><td>עבור עיבוד FFPE</td></tr><tr><td>Cryomolds</td><td>Sakura</td><td>4557</td><td>25 x 20 מ"מ</td></tr><tr><td>FFPE תבנית מתכת</td><td>Leica</td><td></td><td>3803082 24 מ"מ x 24 מ"מ</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>שונים</td><td></td><td>וטרינרי כיתה</td></tr><tr><td>הרדמה מערכת אינהלציה</td><td>שונים</td><td></td><td>וטרינרי</td></tr><tr><td>כיתה מספריים עדינים</td><td>FST</td><td>14085-09</td><td>ישר, חד / חד</td></tr><tr><td>מספריים עדינים</td><td>FST</td><td>14558-09</td><td>ישר, חד/חד</td></tr><tr><td>Metzenbaum</td><td>FST</td><td>14018-13</td><td>ישר, קהה/קהה</td></tr><tr><td></td><td>FST</td><td>11252-00</td><td>Dumont #5</td></tr><tr><td>מלקחיים</td><td>FST</td><td>11018-12</td><td>מיקרו-אדסון</td></tr><tr><td>Tyr-CreER; LSL-BrafV600E; Pten-f/f</td><td>Jackson Labs</td><td>13590</td><td></td></tr><tr><td>LSL-tdTomato</td><td>Jackson Labs</td><td>007914</td><td>ai14</td></tr><tr><td>Cre-1</td><td></td><td>n/a</td><td>GCATTACCGGTCGATGCAACGA GTGATGAG</td></tr><tr><td>Cre-2</td><td></td><td>n/a</td><td>GAGTGAACGAACCTGGTCGAA ATCAGTGCG</td></tr><tr><td>Braf-V600E-1</td><td></td><td>n/a</td><td>TGAGTATTTTTGTGGCAACTGC</td></tr><tr><td>Braf-V600E-2</td><td></td><td>n/a</td><td>CTCTGCTGGGAAAGCGGC</td></tr><tr><td>Kras-G12D-1</td><td></td><td>n/a</td><td>AGCTAGCCACCATGGCTTGAGT AAGTCTGCA</td></tr><tr><td>Kras-G12D-2</td><td></td><td>n/a</td><td>CCTTTACAAGCGCCACGCAGACT GTAGA</td></tr><tr><td>Pten-1</td><td></td><td>n/a</td><td>ACTCAAGGCAGGGATGAGC</td></tr><tr><td>Pten-2</td><td></td><td>n/a</td><td>AATCTAGGGCCTCTTGTGCC</td></tr><tr><td>Pten-3</td><td></td><td>n/a</td><td>GCTTGATATCGAATTCCTGCAGC</td></tr><tr><td>tdTomato-1</td><td></td><td>n/a</td><td>AAGGGAGCTGCAGTGGAGTA</td></tr><tr><td>tdTomato-2</td><td></td><td>n/a</td><td>CCGAAAATCTGTGGGAAGTC</td></tr><tr><td>tdTomato-3</td><td></td><td>n/a</td><td>GGCATTAAAGCAGCGTATCC</td></tr><tr><td>tdTomato-4</td><td></td><td>n/a</td><td>CTGTTCCTGTACGGCATGG</td></tr></tbody></table>

שליטה מרחבית וטמפורלית של מלנומה מורין ייזום מוטציה תאי גזע מלנוציט

Spatial and Temporal Control of Murine Melanoma Initiation from Mutant Melanocyte Stem Cells

מלנומה עורית ידועה כסרטן העור האגרסיבי ביותר. למרות גורמי הסיכון ושינויים גנטיים העיקריים להמשיך להיות מתועד עם עומק הגוברת, שיעור השכיחות של מלנומה עורית הראה עלייה מהירה ורציפה במהלך העשורים האחרונים. כדי למצוא שיטות מניעה יעיל, חשוב להבין את השלבים המוקדמים של חניכה מלנומה בעור. הנתונים הקודמים הוכיחו כי בתאי גזע מלנוציט הזקיקים (MCSCs) ברקמות העור המבוגר יכול לשמש כתאי מלנומה של המקור בעת המבטא מוטציות אונגניים ושינויים גנטיים. Tuמוריגנזה הנובעים MCSCs נוטה מלנומה יכול להיגרם כאשר MCSCs מעבר מן השקט למצב פעיל. מעבר זה מלנומה נוטה MCSCs ניתן לקדם על ידי אפנון של או שיער זקיק תאי גזע המדינה פעילות או באמצעות גורמים סביבתיים חיצוניים כגון אולטרה סגול-B (UV-B). גורמים אלה יכולים להיות מניפולציות באופן מלאכותי במעבדה על ידי depilation כימיים, מה שגורם מעבר של תאי גזע שיער זקיק ו מן השקט למצב פעיל, ועל ידי חשיפה UV-B באמצעות אור שספסל העליון. שיטות אלה מספקות שליטה מרחבית מוצלחת והטמפורלית של חניכה מלנומה עורית בעור מוריין. לכן, אלה במערכות מודל vivo יהיה בעל ערך להגדיר את השלבים המוקדמים של חניכה מלנומה עורית יכול לשמש כדי לבדוק שיטות פוטנציאליות למניעת גידול.

מלנומה עורית חניכה הנגרמת על ידי שיער כימי
הליך ההסרת שיער כימי מתואר באיור 2. כאשר העכברים הם 7-שבועות לאחר הלידה, העור הטייתי שלהם הוא בטלגן. במהלך טלעוגן, תאי גזע שיער זקיק ו MCSCs ידועים להיות בשקט, מצב מנוחה. העור לא צריך להראות צמיחה משמעותית שיער לאחר גילוח. מצד שני, להסרת שיער כימי יכול לגרום זקיק השיער הפעלת תא גזע, אשר בתורו מראה צמיחת שיער משמעותי מאזור הריבית (<strong cl...

הפרוצדורה הבאה מתארת שיטה לשליטה מרחבית וטמפורלית של ייזום גידול מלנוציטוטי בעור מוראני, באמצעות דגם עכבר מהונדס גנטית. פרוטוקול זה מתאר מאקרוסקופי כמו גם חניכה מיקרוסקופיים עורית מלנומה.

Cutaneous melanoma is well known as the most aggressive skin cancer. Although the risk factors and major genetic alterations continue to be documented ...

מלנומה מאובחנת באופן נרחב ברחבי העולם, עם שכיחות גוברת. פרוטוקולים אלה מאפשרים את השלבים המוקדמים של ייזום מלנומה להיות נשלט בקפידה, להקל על המחקר של הפיתוח שלה. על ידי שליטה בזמן ובמיקום של הפעלת תאי גזע מלנוציטים, יש לנו את היכולת להבחין בשינויים בתוך אוכלוסיית תאי הגזע וייזום המלנומה הזן החדש שלה.הדגמת ההליך תהיה דאהים קים ולואיאן, סטודנטים לתואר שני מהמעבדה. יומיים עד שלושה ימים לפני תחילת ההליך, השתמש גוזם חשמלי לגלח את העור הגבי מכל עכבר הרדמה בן שבעה שבועות. ביום הניסוי, השתמש ספוגית כותנה להחיל שכבה דקה של קרם depilatory על העור החשוף.לאחר הקרם כבר מיושם באופן שווה, להשתמש במטליות כותנה נקיות כדי להסיר את השמנת, ואחריו ניגוב עדין עם מטלית לחה כדי להסיר כל קרם שיורית. ואז להחזיר כל עכבר לכלוב הבית שלה עם ניטור עד החלמה מלאה. להקרנת UV-B, מכסים את העור הגבי בחומר מגן UV-B כך שרק האזור הרצוי ייחשף, ומכסים את תא ה- UV במכסה עמיד בפני UV.לאחר מכן הפעל את מנורת UV-B כדי להקרנת העכבר לתקופת הזמן הניסיונית המתאימה לפני החזרת העכבר לכלוב ריק עם ניטור עד להחלמה מלאה. כדי לבודד את דגימות העור, השתמש גוזם חשמלי כדי להסיר כל שערה מאזור העור הגבי של העכברים מוקרנים המתת חסד, ולהבריש קלות את העור החשוף עם רקמה ללא מוך כדי לנקות את האזור. בצע חתך קטן עם מספריים חדים ממש מעל בסיס הזנב והכנס מספריים גדולים וקהים לחתך כדי להפריד את רקמות החיבור התת עוריות.באמצעות מספריים חדים, לחתוך בזהירות לאורך קצה אזור העור של עניין לבודד את דגימת הרקמה ומניחים את רקמת העור excised על מגבת נייר נקי. לאחר מכן השתמש מטלפים עמומים כדי למתוח את העור, כך שהוא דבק במגבת והוא מתוח. כאשר כל הדגימות נקצרו, מניחים דגימת עור ומגבת נייר בחזרה לתוך פיסת נייר מסנן מקופל מיד סמוך לקמט, דואג כי המדגם הוא חלק ולא מקופל או מקומט.סגור את צידי נייר הסינון עם סיכות הידוק וקצץ את הנייר. לאחר מכן תוכלו להטביע את הדגימות בפורמלין חיץ ניטרלי של 10% למשך שלוש עד חמש שעות בטמפרטורת החדר לפני שטיפת הרקמות עם שתי שטיפות של חמש דקות במים מיונים. לאחר הכביסה השנייה, להסיר בזהירות כל חומר שיורית מרקמות העור, לקצץ את הקצוות של הדגימות, כך שהם לא משוננים.לאחר מכן, בצע שלושה חתכים קשתיים בכל מדגם, כך רוחב הרצועות הוא לא יותר מחמישה מילימטרים, ולעשות חתכים רוחביים, כך הדגימות הם לא יותר מ 20 מילימטרים רוחב. מקם תבנית קריו המכילה טמפרטורת חיתוך אופטימלית או מדיום OCT בכיוון לאורך, והצב ארבע עד חמש חתיכות עור על גבי OCT. כאשר כל החלקים נמצאים במקום, להשתמש בשני זוגות של מדפים עדין להביא את הקצה הארוך של כל פיסת עור לתחתית עובש cryo, כך הדגימות הן אנכיות בתוך OCT בניצב לבסיס התבנית.לאחר מכן מלאו את התבנית ב- OCT נוסף בשפה השנייה וה מניחים את התבנית על משטח שטוח של חתיכת קרח יבש, תוך שימוש במטחנים כדי להתאים את כל חתיכות העור שאולי עברו במהלך ההעברה כאשר הבלוק מתחיל לקפוא לפי הצורך. כאשר עכברים הם שבעה שבועות לאחר הלידה, העור הגבי שלהם הוא בטלוגן. במהלך טלוגן, זקיק השיער ותאי גזע מלנוציטים ידועים להיות במצב מנוחה רזה, ואת העור צריך להראות שום צמיחת שיער משמעותית לאחר הגילוח.דפילציה כימית, עם זאת, יכול לגרום להפעלת תאי גזע זקיק השיער, גרימת צמיחת שיער משמעותית בתוך האזור של עניין. כמו depilation כימי יכול לגרום באופן משמעותי את ההפעלה של זקיק השיער ותאי גזע מלנוציטים, תאי גזע מלנוציטים נוטה מלנומה במצב פעיל יכול ליצור גידולים חניכה מלנומה מיקרוסקופית ניתן לראות בתוך שבועיים של depilation כימי. הקרנה UV-B יכול גם לגרום חניכה הגידול מן ההפוגה, גידול נוטה מלנוציטים תאי גזע.חשוב לציין, UV-B גורם טרנסלוקציה ישירה של תאי גזע מלנוציטים מן נישה תאי גזע זקיקי שלהם האפידרמיס בין הזקיקים. יתר על כן, UV-B יכול לגרום תאי גזע מלנוציטים שמקורם היווצרות מלנומה עורית לאורך האפידרמיס interfollicular. בדומה לעור הגבי, חניכת מלנומה הנגרמת על ידי UV-B ניתן לראות בעיקר באזורי עור אחרים, כגון עור האוזן.ואכן, בהשוואה לעור האוזן שליטה, מכוסה בד עמיד UV, עור האוזן חשוף UV-B מדגים פיגמנטציה גבוהה יותר בשל נטל גבוה יותר של חניכת מלנומה. מינונים שונים של UV-B עשויות להיות השפעות שונות על העור של העכבר ופעילות melanocyte. לכן, חשוב לקבוע ולייעל את מינון ההקרנה לפני תחילת הניסוי.

spatial-temporal-control-murine-melanoma-initiation-from-mutant

Research

JoVE Journal

Cancer Research

מחקר סרטן

בפרוטוקול זה, w הדואר זיהה אוכלוסיית רומן של תאים כמו melanocyte-(הידוע גם במלנוציטים לב) בלבם של עכברים ובני אדם שתורם להפרעות קצב פרוזדורים גורמת בעכברים.

בידוד תאים כמו Melanocyte-ראשיים מלב העכבר

בסרטון זה, תאי מלנומה שמקורם בבני אדם מושתלים באופן תת-עורי באזור האגף של עכבר מדוכא חיסון. מודל PDX מאפשר חקירה פרה-קלינית של תאי מלנומה המשחזרים טוב יותר את ההטרוגניות של הגידול ואת אגרסיביות המלנומה שנצפתה בתנאי in vivo.

מידול Xenograft הנגזר מהמטופל: טכניקה ליצירת מודלים של עכברי מלנומה

המלנין עוריות הוא מושרה על ידי יישום מקומי של forskolin במודל עכברי של אדם UV רגיש בהיר עור. מניפולציה תרופתי של רמות cAMP בעור ואפידרמיס המחשיכים מאוד להגן מפני דלקות בתיווך UV (כוויות שמש), כפי שנמדד על ידי מינון erythematous מינימום assay (MED).

אינדוקציה תרופתי של עוריות מלנין והגנה מפני כוויות שמש בדגם מואנש מאוס

אנו מתארים את הנתיחה וvivo התרבות לשעבר של עור העוברי של עכבר. מערכת התרבות שומרת על ממשק אוויר נוזלי על פני השטח של הרקמות ומאפשרת הדמיה במיקרוסקופ הפוכה. Melanoblasts, רכיב של העור מתפתח, שכותרתו fluorescently המאפשרת את התנהגותם כדי להיות שנצפתה באמצעות מיקרוסקופ confocal.

אקס תרבות Vivo של עור העכבר עוברי וLive-הדמיה של הגירת Melanoblast

עבודה זו מתארת ​​פרוטוקול בידול במבחנה לייצר מלנוציטים פיגמנט, מתאי גזע אנושיים pluripotent באמצעות רכס עצבי ואת melanoblast שלב ביניים באמצעות פרוטוקול מזין ללא, 25 יום.

מזין ללא גזירת &quot;מלנוציטים מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנוש

כאן, אנו מציגים פרוטוקול ליצירת 3D organotypic מלנומה ספרואיד העור מודל recapitulates הן את הארכיטקטורה ואת multicellular המורכבות של איברים/גידול של ויוו , אבל באותו זמן מסתגלת שיטתית ניסיוני התערבות.

מודל העור מלנומה Organotypic 3D ספרואיד

פרוטוקול זה מתאר שיטה מהירה לייצר בו תרבויות מלנוציט ופיברובלסט מן העור של 0-4 העכברים הישנים של היום. התרבויות העיקריות הללו ניתן לשמור ומניפולציות בתוך מבחנה כדי ללמוד מגוון של תהליכים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית, כולל ביולוגיה של תאי העור, פיגמנטציה, ריפוי פצעים ומלנומה.

הדור המהיר של משפחת מלנוציט הראשית והתרבויות בפיברובלסט

מלנומה היא מחלה אגרסיבית מאוד שמתפשטת במהירות לאיברים אחרים. פרוטוקול זה מתאר את היישום של הדמיית אולטרסאונד בתדר גבוה במיוחד, יחד עם עיבוד 3D, כדי לפקח על הנפח של בלוטות הלימפה מפשעתיות במודל העכבר Braf / Pten של מלנומה גרורתית.

ניתוח נפח בלוטות הלימפה על ידי הדמיית אולטרסאונד בתדר גבוה במיוחד במודל העכבר המהונדס גנטית Braf /Pten של מלנומה

כאן, אנו מתארים מערכת תכנות מחדש ישירה ממוטבת עבור מלנוציטים ומערכת אריזה מרוכזת של וירוסים ביעילות גבוהה המבטיחה תכנות מחדש ישיר חלק.

תכנות מחדש ישיר של פיברובלסטים של עכברים למלנוציטים

מאמר זה מתאר זרימת עבודה של טכניקות המשמשות לבדיקת מתווכים מועמדים חדשים של גרורות מלנומה ומנגנוני הפעולה שלהם.

פלטפורמת גילוי חזקה לזיהוי מתווכים חדשים של גרורות מלנומה

הפרוטוקול הנוכחי מתאר את ההשתלה וההערכה של מלנומה בכורואיד מורין תוך שימוש בטומוגרפיה קוהרנטית אופטית.

השתלה והערכה של מלנומה בכורואיד מורין באמצעות טומוגרפיה קוהרנטית אופטית

למד שיטה לשליטה מרחבית וטמפורלית בייזום מלנומה בעור הגב של עכברים באמצעות מודל גנטי מהונדס. הפרוטוקול מאפשר מחקר מדויק של הפעלת תאי גזע מלנוציט והתפתחות הגידול.

שליטה מרחבית וטמפורלית של מלנומה מורין ייזום מוטציה תאי גזע מלנוציט

גלה סרטונים נוספים